湯娜娜，李 娟，曹福羊，劉曉梅

術后認知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction, POCD)是指麻醉和(或)手術后認知功能的惡化，表現為記憶或注意力障礙，可出現在術后數天或數月內[1,2]。研究發(fā)現，有12%認知功能正常的患者在手術后可出現認知功能障礙，其中年齡、麻醉和手術類型等是POCD發(fā)生的重要影響因素[3，4]。臨床研究表明，吸入麻醉可對實驗動物產生神經毒性作用并導致認知障礙，但其發(fā)生機制尚不明確[5]。本研究旨在探討異氟醚對成年小鼠的認知功能損傷、損傷機制及ERK磷酸化抑制在改善異氟醚所致的認知損害中的作用。

1 對象與方法

1.1 對象 選取SPF級健康雄性C57BL/6J P6小鼠66只，體重20～25 g，由北京華阜康生物工程有限公司提供。均飼養(yǎng)于無特殊病原菌環(huán)境，溫度22～24 ℃，濕度40%～50%，每12 h晝/夜交替，自由攝食水。采用隨機數字表法分為3組：對照組(Con組)、異氟醚組(Iso組)、干預組(Iso+U0126)，每組22只。本研究經北京軍事醫(yī)學科學院實驗動物管理委員會批準，動物處置過程符合倫理學要求。

1.2 方法 Iso組和Iso+U0126組小鼠置于1個帶進出口的密閉樹脂盒，通過氣體流量計和異氟醚獨立揮發(fā)罐將1.4%異氟醚(CAS：26675-46-7；麥克林公司生產)+60%氧氣+38.6%空氣混合通入樹脂盒，對小鼠進行麻醉處理2 h；Iso+ U0126組小鼠于異氟醚處理前30 min，腹腔注射100 mg/kg U0126(MEK1/2抑制劑)預處理。Con組小鼠置于同樣樹脂盒，僅給予60%氧氣+40%空氣處理2 h。采用Vamous麻醉氣體監(jiān)測儀(德國Drager公司)監(jiān)測異氟醚及O2濃度。

1.3 檢測指標

1.3.1 β淀粉樣蛋白1-42(amyloid β protein 1-42, Aβ1-42)水平檢測 造模結束后每組隨機選取6只小鼠心臟灌流后斷頭，取皮層樣本，稱重加入預冷的組織蛋白裂解液勻漿，4 ℃,14 000 r/min,離心10 min后取上清，采用BCA法測定樣本濃度。每組再隨機選取4份皮層樣本，采用ELISA法測定β淀粉樣蛋白42(Aβ1-42)表達水平。所有試劑盒購于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

1.3.2 蛋白免疫印跡試驗檢測磷酸化細胞外信號調節(jié)激酶1(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1, p-ERK1)水平 3組取上述皮層樣本采用Western blot法檢測皮層p-ERK1表達情況。將等量蛋白(50 μg)加入SDS上樣緩沖液中，70 ℃恒溫加熱10 min使其變性。經SDS-PAGE電泳分離、轉膜、封閉后加入小鼠抗磷酸化ERKl單克隆抗體(1∶1000，美國Cell Signaling公司) 4 ℃過夜，漂洗后加入羊抗鼠二抗(1∶2000，美國Sigma公司)，室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL發(fā)光顯影，定影，采用美國Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)掃描，照相。以目的條與內參β-actin條帶灰度值的比值反應目的條帶的表達水平。

1.3.3 免疫熒光法檢測p-ERK1水平 造模結束后每組隨機選取6只小鼠心臟灌流后斷頭，將小鼠皮層剝離后用4%多聚甲醛固定24 h，20%蔗糖脫水4 h,30%蔗糖脫水4 h，制成厚度為5 μm的冰凍切片。固定、破膜、封閉后，添加兔抗p-ERKl單克隆抗體(1∶1000，美國Cell Signaling公司)。將載玻片放在濕盒中， 4 ℃冰箱中過夜。洗滌3次后，加入山羊抗兔抗體(1∶1000，美國Cell Signaling公司)，37 ℃孵育1 h。在室溫下用DAPI(104139，Abcam)孵育5 min。滴加抗熒光淬滅劑后封片，在熒光顯微鏡下隨機選取3個視野進行觀察，對視野中綠色熒光表示的p-ERK1+細胞和藍色熒光表示的總細胞進行計數，實驗結果以p-ERK1+細胞數/DAPI+細胞數×100%表示。

1.3.4 水迷宮實驗 水迷宮系統(tǒng)(Haslings 公司，美國)為直徑150 cm、高60 cm的黑色圓柱形水池，池壁上以4個等距點將水池平均分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ象限，平臺置于第Ⅰ象限中央，直徑10 cm，低于水面1 cm。水中加入白色染料拌勻，保持水溫25 ℃，訓練期間平臺位置和水池周圍參照物保持不變。水迷宮實驗共7 d，第1～7 天行定位航行實驗，小鼠面向池壁分別從第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限入水點入水，間隔15 min，記錄小鼠從入水到找到平臺的時間。當逃避潛伏期超過 90 s，則引導小鼠至平臺并停留 10 s，時間記為90 s，取4次逃避的平均值為逃避潛伏期。第7天同時行空間探索實驗：撤除平臺，于第Ⅰ象限中點將小鼠面向池壁放入水中，記錄其30 s 內穿越平臺次數[6]。

2 結 果

2.1 小鼠皮層p-ERK1和Aβ1-42表達水平比較 WB和免疫熒光實驗結果提示(圖1)，與Con組比較， Iso組Aβ1-42水平顯著升高，小鼠皮層p-ERK1的表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)。與Iso組比較，Iso+U0126組Aβ1-42表達無統(tǒng)計學差異，皮層p-ERK1水平顯著下降(P<0.05，表1)。

表1 各組小鼠皮層p-ERK1和Aβ1-42表達水平比較

2.2 小鼠逃避潛伏期和穿越平臺次數的比較 造模后第2～7天，與Con組相比，Iso組小鼠逃避潛伏期顯著延長，穿越平臺次數顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與Iso組比較，Iso+U0126組小鼠逃避潛伏期顯著縮短，穿越平臺次數顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2)。

圖1 3組小鼠皮層p-ERK1表達水平比較 Con組為對照組，Iso組為異氟醚組， Iso+U0126組為干預組

表2 三組小鼠逃避潛伏期和穿越平臺次數的比較

3 討 論

異氟醚通過調節(jié)NMDA型谷氨酸受體，在中樞神經系統(tǒng)中產生鎮(zhèn)痛和麻醉作用[7-9]。有研究發(fā)現， NMDA型谷氨酸受體在學習和記憶過程中有關鍵作用，也可能在麻醉誘導的大腦認知缺陷中發(fā)揮作用[10]。有研究指出，麻醉藥物處理下的氧化應激反應對細胞外信號調節(jié)激酶磷酸化的水平的改變可能是神經元凋亡的潛在原因[11]。

本研究參考臨床常用的異氟醚濃度(正常成年人的最低肺泡濃度1.15%)，對照文獻[12]標準進行模型，選取出生后2月齡的C57BL/6J小鼠作為實驗對象，進行1.4%異氟醚連續(xù)2 h處理。研究表明異氟醚可劑量依賴性地損傷海馬突觸可塑性和增加炎性反應水平，導致海馬相關性認知損傷[13]。本研究結果表明，Iso組小鼠造模24 h后連續(xù)7 d的逃避潛伏期較Con組顯著增長，穿越平臺次數顯著減少，提示小鼠經過異氟醚處理后，海馬相關的認知功能受到顯著損害。

Aβ1-42是與認知功能和腦損傷有關的蛋白，其在阿爾茨海默病、炎性腦病、腦缺血再灌注損傷中均可明顯增高[14]。ERK是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，其主要包括ERK1和ERK2兩種亞型，可將細胞外刺激傳遞給細胞內并調節(jié)多種細胞功能。大腦中Aβ的異常累積同時會上調p-ERK的水平，而通過抑制Aβ激活的p-ERK水平，可提高小鼠海馬齒狀回區(qū)神經元的存活數量，提高小鼠學習能力和空間記憶能力[15]。本研究采用ELISA法檢測皮層Aβ1-42含量，經典WB法和免疫熒光實驗檢測各組小鼠皮層p-ERK1水平。結果顯示，與Con組相比，Iso組小鼠皮層Aβ1-42含量升高，p-ERK1水平顯著升高，說明異氟醚致成年小鼠皮層Aβ異常累積，并致ERK磷酸化水平上調。

U0126是一種常用的MAPKK抑制劑，即MAPK 激酶抑制劑或MEK1/2抑制劑。U0126可以通過細胞選擇性抑制MEK1/2，從而抑制MAP 激酶 (ERK1/2即p44/42 MAPK)的磷酸化和激活[16]。在本研究中，相比Iso組，Iso+U0126組小鼠皮層Aβ1-42水平無顯著變化，而p-ERK1的水平顯著降低，逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數顯著增多，表明預先給予U0126可改善異氟醚處理后Aβ1-42異常累積所致的p-ERK1水平上調及認知功能障礙。

綜上所述，1.4%異氟醚連續(xù)2 h處理可致成年小鼠認知功能障礙，其機制可能與Aβ1-42異常累積致ERK磷酸化水平升高有關，而通過預先抑制ERK磷酸化水平可改善異氟醚所致的認知功能損害。本研究初步探討了吸入麻醉誘導POCD的相關機制，而ERK作為新靶點可能為臨床預防或治療POCD的發(fā)生提供新的方向，下一步將進行更全面的研究。