張博慧, 賈戴輝, 程倩, 許俊彥, 邵喆, 黃應(yīng)峰

寶船生物醫(yī)藥科技(上海)有限公司藥物分析部門, 上海 201203

N糖基化修飾是單克隆抗體藥物普遍存在的翻譯后修飾現(xiàn)象。目前研究表明，糖基化修飾與單克隆抗體藥物的功能、藥物代謝、免疫原性等關(guān)系密切[1-3]，如核心巖藻糖缺失能顯著增強(qiáng)ADCC效應(yīng)[4]，半乳糖能夠增強(qiáng)CDC活性[5]；末端N-乙酰葡萄糖影響抗體藥物半衰期[6-7]；唾液酸化糖型具有抗炎癥功能[8]；α(1-3)半乳糖和NGNA型唾液酸易引起免疫原性[9]等。N糖對(duì)抗體結(jié)構(gòu)也具有重要作用，能穩(wěn)定CH2結(jié)構(gòu)域，去糖抗體穩(wěn)定性會(huì)變差，更易發(fā)生去折疊和聚集[10]。

N糖類型和含量受細(xì)胞株、培養(yǎng)條件、純化和儲(chǔ)存[11-13]等過程的影響，因此在單抗藥物細(xì)胞篩選、工藝優(yōu)化、純化、產(chǎn)品放行和穩(wěn)定性考察中控制和監(jiān)測(cè)N糖含量，保證單抗藥物安全性、有效性等尤為重要。目前檢測(cè)N糖的方法主要有親水色譜-熒光法[14]、CE-LIF法[15-16]和質(zhì)譜法[17-18]等。其中親水色譜-熒光法是目前應(yīng)用最為廣泛的方法，該方法通常需要用糖苷酶水解糖蛋白上的N糖鏈，再用標(biāo)記試劑進(jìn)行衍生化，采用親水色譜柱分離，熒光檢測(cè)器檢測(cè)。由于PNGase F幾乎能水解所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的N糖，因此得到廣泛應(yīng)用[19]。傳統(tǒng)的N糖譜檢測(cè)方法一般耗時(shí)較長，目前快速N糖樣品制備的試劑盒已經(jīng)商品化，大幅提高了N糖的檢測(cè)效率，但是通常價(jià)格昂貴。而應(yīng)用快速PNGase F酶與傳統(tǒng)制備過程相組合成為提高檢測(cè)效率和降低檢測(cè)成本的一種選擇。本研究基于親水色譜-熒光法，針對(duì)PNGase F水解條件進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)和解決了酶解過程中易對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響的一些因素，建立了高效準(zhǔn)確的N糖檢測(cè)方法，以期為N糖的檢測(cè)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1供試品 本研究所用mAb1、mAb2和mAb2-F均為寶船生物醫(yī)藥科技(上海)有限公司生產(chǎn)的IgG1型單克隆抗體。

1.1.2試劑和耗材 N糖苷酶F(PNGase F)、快速PNGase F酶(rapid PNGase F)及變性緩沖液(5×)均購自New England BioLabs公司；無水乙醇、甲酸銨、乙酸、二甲基亞砜(DMSO)、2-氨基苯甲酰胺(2-AB)、氰基硼氫化鈉、β-巰基乙醇等均購自Sigma公司；甲酸和乙腈購自Fisher公司；PBS Buffer(1×)購自上海生工；10 kD超濾離心管購自Merck公司；100 mmol·L-1Tris-HCl(含1% SDS，pH 9.0)溶液和非涂層-熔融石英毛細(xì)管購自Beckman公司；純化柱(GlycoCleanTMS Cartridges)購自Prozyme公司；色譜柱ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide Column(1.7 μm，2.1 mm×150 mm)購自Waters公司；色譜柱AdvanceBio Glycan Mapping Column(2.7 μm，4.6 mm×150 mm)購自Agilent公司。

1.1.3主要儀器設(shè)備 高效液相系統(tǒng)(HPLC，1260)購自Agilent公司；超高效液相系統(tǒng)(UPLC，H-Class Plus)購自美國Waters公司；液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(LC-MS，Q Exactive)和數(shù)據(jù)處理軟件(Biopharma Finder)均購自美國Thermo公司；毛細(xì)管電泳儀(CE，PA800 Plus)購自Beckman公司；真空離心濃縮干燥儀(RVC 2-25)購自德國Christ公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1蛋白沉淀和N糖衍生化 向酶解后的樣品中加入3倍體積的冰乙醇，-15～-25℃放置約1 h，高速離心10 min，取上清干燥。加入10 μL 2-AB衍生化試劑，65℃避光孵育3 h。用純化柱純化后干燥，50%乙腈復(fù)溶，準(zhǔn)備上機(jī)分析。

1.2.2HPLC色譜條件 儀器采用高效液相系統(tǒng)(Agilent，1260)；色譜柱采用Advance Bio Glycan Mapping Column；流動(dòng)相A為100 mmol·L-1甲酸銨(pH 4.5)，流動(dòng)相B為100%乙腈；進(jìn)樣量2 μL；流速0.5 mL·min-1；熒光檢測(cè)器激發(fā)波長260 nm，發(fā)射波長430 nm；色譜柱溫度55℃；梯度洗脫。

1.2.3UPLC色譜條件 儀器采用超高效液相系統(tǒng)(Waters，H-class plus)，色譜柱采用ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide Column。流動(dòng)相A為100 mmol·L-1甲酸銨(pH 4.5)，流動(dòng)相B為100%乙腈，進(jìn)樣量2 μL，流速0.5 mL·min-1，熒光檢測(cè)器激發(fā)波長330 nm，發(fā)射波長420 nm，色譜柱溫度60℃，梯度洗脫。

1.2.4質(zhì)譜參數(shù) 應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(LC-MS，Q Exactive)的HESI正離子模式(HESI+)，離子源的溫度和電壓分別為320℃和3.8 kV，離子傳輸管溫度為200℃，其他儀器參數(shù)設(shè)置均經(jīng)過優(yōu)化以獲得最佳信號(hào)響應(yīng)；母離子掃描范圍700～3 000 m·z-1，分離度15 000，分析時(shí)長60 min；數(shù)據(jù)處理軟件采用Biopharma Finder。

1.2.5還原毛細(xì)管凝膠電泳(R CE-SDS) 將蛋白沉淀用100 mmol·L-1Tris-HCl(含1% SDS，pH 9.0)溶液復(fù)溶，加入β-巰基乙醇還原。儀器采用毛細(xì)管電泳儀(Beckman，PA800 plus)，毛細(xì)管采用非涂層-熔融石英毛細(xì)管，PDA檢測(cè)器，波長220 nm，電動(dòng)進(jìn)樣(-5 kV)20 s，電壓分離(-15 kV)40 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 緩沖液pH對(duì)結(jié)果的影響

分別將mAb1和mAb2樣品調(diào)pH至4、5、6和7，取200 μg進(jìn)行PNGase F酶解24 h，檢測(cè)N糖含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1和圖1所示，mAb2在不同pH緩沖液酶解的N糖含量高度一致，說明pH對(duì)該樣品N糖水解無影響；而mAb1中N糖含量隨pH的變化出現(xiàn)明顯差異，其中緩沖液pH為4時(shí)，峰2(p2)含量出現(xiàn)大幅度升高，相應(yīng)的峰3(p3)含量明顯下降，pH 6和7條件下N糖含量基本一致。

表1 mAb1和mAb2在不同pH緩沖液中酶解的N糖含量Table 1 N-glycan content of mAb1 and mAb2 hydrolyzed in different pH buffer

圖1 mAb1和mAb2在不同pH緩沖液中酶解的N糖色譜圖Fig.1 N-glycan chromatogram of mAb1 and mAb2 hydrolyzed in different pH buffer

將mAb1不同pH酶解后的蛋白進(jìn)行還原CE-SDS檢測(cè)，結(jié)果(圖2)顯示含N糖重鏈(HC)基本已被酶解成非糖基化重鏈(NG HC)，說明不同pH緩沖液下PNGase F酶解N糖24 h后均酶解完全，N糖含量的變化并非不完全酶解造成。

利用液質(zhì)聯(lián)用鑒定各N糖的種類，p2和p3分別為G0F-GN(A1F)和G0F(A2F)。通過比較不同時(shí)間(1、8和24 h)酶解結(jié)果(表2)，發(fā)現(xiàn)緩沖液pH為4和5時(shí)，p2和p3含量的變化隨著酶解時(shí)間的增加而呈梯度變化，pH 4時(shí)尤為明顯；pH為6和7時(shí)，變化不明顯。因此推測(cè)在某些單抗分子上，G0F上的N-乙酰氨基葡萄糖在低pH條件下易從N糖鏈上脫落，使G0F形成G0F-GN，從而引起G0F-GN和G0F含量的變化。因此在進(jìn)行PNGase F酶解時(shí)，應(yīng)避免酶解體系中pH過低。

圖2 mAb1不同pH酶解蛋白R(shí) CE-SDS電泳圖Fig.2 Reduced CE-SDS of deglycoprotein from mAb1 hydrolyzed in different pH buffer

表2 mAb1在不同pH緩沖液中酶解不同時(shí)間的N糖含量Table 2 N-glycan content of mAb1 hydrolyzed in different pH buffer at different times

2.2 置換緩沖液的選擇

為避免樣品緩沖液pH及成分對(duì)PNGase F酶解的影響，用超濾離心管將樣品換液至合適的溶液中再進(jìn)行PNGase F酶解。本研究選擇了1×PBS溶液(pH 7.4)和超純水分別置換mAb1和mAb2的樣品緩沖液，以未置換緩沖液(pH 7)為對(duì)照，PNGase F酶解24 h，進(jìn)行N糖譜檢測(cè)。N糖色譜圖和含量分別見表3和圖3，結(jié)果表明1×PBS溶液、超純水和樣品緩沖液(pH 7)的N糖譜結(jié)果一致。因?yàn)榈鞍自诔兯蟹€(wěn)定性較差，所以本研究選用1×PBS溶液(pH 7.4)置換樣品的緩沖液。

表3 mAb1和mAb2在樣品緩沖液、1×PBS和超純水中的N糖含量Table 3 N-glycan content of mAb1 and mAb2 hydrolyzed in sample buffer, 1×PBS and water

圖3 mAb1和mAb2在樣品緩沖液、1×PBS和超純水中的N糖色譜圖Fig.3 N-glycan profiles of mAb1 and mAb2 hydrolyzed in sample buffer, 1×PBS and water

2.3 不同PNGase F酶對(duì)N糖結(jié)果的影響

直接取200 μg樣品，分別加入快速PNGase F酶(rapid PNGase F)和PNGase F進(jìn)行酶解，N糖譜如圖4所示。結(jié)果顯示用rapid PNGase F進(jìn)行酶解時(shí)，若選擇用UPLC和1.7 μm粒徑的ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide Column色譜柱，則由于分離度的提高，mAb2的N糖色譜圖(圖4B)中G0F和G1Fa出現(xiàn)肩峰，而HPLC結(jié)果(圖4A)由于分離度較差，此峰未得到有效分離。當(dāng)將mAb2樣品緩沖液置換至1×PBS中時(shí)(圖4C)，該肩峰消失。

A：mAb2未置換緩沖液HPLC檢測(cè)；B：mAb2未置換緩沖液UPLC檢測(cè)；C：mAb2置換緩沖液UPLC檢測(cè)。圖4 不同PNGase F的N糖譜結(jié)果Fig.4 N-glycan profiles of mAb2 hydrolyzed by different PNGase F

綜合2.1～2.3部分的研究結(jié)果可知，將樣品置換緩沖液至合適的溶液中再進(jìn)行PNGase F酶解，對(duì)改善N糖譜峰形和結(jié)果準(zhǔn)確度至關(guān)重要，本研究采用了1×PBS溶液，效果良好。另外，在置換緩沖液的基礎(chǔ)上使用快速PNGase F能將酶解時(shí)間縮短為數(shù)十分鐘，有效提高了檢測(cè)效率。選擇UPLC能有效提高分辨率。

2.4 蛋白變性對(duì)酶解效率的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，在非變性條件下利用快速PNGase F酶解不同單抗所需酶解時(shí)間差異明顯，從數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)不等。為了有效提高酶解效率，選擇所需酶解時(shí)間最長的mAb2-F置換緩沖液至1×PBS中，加入變性緩沖液(5×)和1 μL rapid PNGase F酶，50℃孵育10 min后進(jìn)行N糖譜檢測(cè)處理，將沉淀的蛋白進(jìn)行還原 CE-SDS檢測(cè)，以未加變性緩沖液(5×)樣品為對(duì)照。由圖5還原CE-SDS結(jié)果可知，相同的酶解時(shí)間條件下，蛋白變性后由于高級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，N糖充分暴露與酶接觸，所以其酶解效果更好。

2.5 酶解程度對(duì)N糖結(jié)果的影響

在非變性條件下加入不同體積的rapid PNGase F酶對(duì)mAb2-F進(jìn)行N糖譜檢測(cè)處理，將沉淀的蛋白進(jìn)行還原 CE-SDS檢測(cè)，以加入變性緩沖液(5×)和1 μL rapid PNGase F酶的樣品為對(duì)照，酶解條件均選擇50℃、10 min。由圖6(左)可知，在非變性條件下酶解相同時(shí)間，酶量的增加使非糖基化組分增多，但酶量增加至2 μL時(shí)酶解效果仍較差，而變性條件下用1 μL rapid PNGase F酶解，糖基化組分基本被轉(zhuǎn)換成非糖基化組分。N糖水解的程度不同，N糖含量(表4)明顯成梯度變化,說明PNGase F對(duì)不同類型的N糖水解效率不同，因此為了獲得樣品中真實(shí)的N糖含量水平，應(yīng)將N糖盡量酶解完全。

圖5 mAb2-F在變性和非變性條件下切糖后還原CE-SDS圖譜Fig.5 R CE-SDS profiles of mAb2-F deglycated in nature and denature conditions

表4 不同體積rapid PNGase F酶解mAb2-F的N糖含量Table 4 N-glycan content of mAb2-F deglycated by different rapid PNGase F amount

3 討論

N糖檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性受多種因素的影響。在緩沖液pH對(duì)PNGase F酶解的影響研究中發(fā)現(xiàn)，低pH能使某些單抗在酶解過程中G0F逐漸轉(zhuǎn)化為G0F-GN，造成檢測(cè)結(jié)果的嚴(yán)重偏差，這種情況通常出現(xiàn)在Protein A親和純化后的樣本，在低pH洗脫后直接進(jìn)行酶解，若先將樣品緩沖液pH調(diào)至中性或進(jìn)行換液處理，能夠避免pH的影響。對(duì)照mAb2置換和未置換樣品緩沖液酶解結(jié)果，置換緩沖液能有效消除G0F和G1Fa的肩峰，消除樣品緩沖液成分對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

另外，本研究對(duì)多種單抗的研究發(fā)現(xiàn)，酶解程度不同的N糖檢測(cè)結(jié)果存在明顯差異，說明N糖苷酶F對(duì)不同類型的N糖水解效率不同，這與已有文獻(xiàn)報(bào)道[20]一致。因此為了獲得樣品中真實(shí)的N糖含量水平，應(yīng)將N糖盡量酶解完全。酶解程度可采用將蛋白沉淀進(jìn)行還原CE-SDS檢測(cè)，觀察非糖基化組分含量的變化情況。

在細(xì)胞株篩選和工藝優(yōu)化階段，快速、準(zhǔn)確的N糖檢測(cè)結(jié)果能夠有效推進(jìn)開發(fā)進(jìn)度，而該階段巨大的樣本量又對(duì)成本控制提出更高的要求，因此建立一種高效、準(zhǔn)確且低成本的N糖檢測(cè)方法尤為重要。本研究確定了較為通用的PNGase F酶對(duì)單克隆抗體的酶解條件，即為將樣品置換緩沖液至1×PBS，取適量樣品加入變性緩沖液(5×)和1 μL Rapid PNGase F酶，50℃孵育10 min，進(jìn)行后續(xù)除蛋白、干燥等處理，快速PNGase F酶和變性處理的應(yīng)用，將酶解時(shí)間大幅縮短，提高了檢測(cè)效率；同時(shí)采用傳統(tǒng)的UPLC和ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide Column色譜柱，有效提高了分離度，并控制了檢測(cè)成本。

圖6 不同體積rapid PNGase F酶解mAb2-F的R CE-SDS和N糖譜圖Fig.6 N-glycan and R CE-SDS profiles of mAb2-F deglycated by different rapid PNGase F amount