廖桃桃, 湯俊杰, 史瀟翔, 張偉杰, 茆廣華*, 吳向陽*

1.江蘇大學環(huán)境與安全工程學院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學食品與生物工程學院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013

多溴聯(lián)苯醚(polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)是一類典型的持久性有機污染物，作為常用的阻燃劑廣泛應用于建筑、塑料、紡織和電子產(chǎn)品等行業(yè)[1-2]。2,2′,3,3′,4,4′,5,5′,6,6′-十溴聯(lián)苯醚(BDE-209)是PBDEs家族中使用量最大的一種，所占比例超過82%[3]。2017年《斯德哥爾摩公約》將BDE-209列為持久性有機污染物[4]，但其仍在各種環(huán)境介質(zhì)(灰塵、空氣、水體)、食品和人體樣本中普遍檢出[5-10]。研究表明，BDE-209具有生物蓄積性，其毒性效應和潛在的健康風險逐漸引起人們的廣泛關注。目前，針對BDE-209毒性效應的研究表明，BDE-209可引起動物和人體的各種系統(tǒng)毒性，包括發(fā)育神經(jīng)、生殖和內(nèi)分泌系統(tǒng)毒性等[11-13]。BDE-209對免疫系統(tǒng)的毒性也有相關報道。Feng等[14]發(fā)現(xiàn)，小鼠口服800 mg·kg-1BDE-209兩年可引起多種器官的組織病理學改變。Zeng等[15]研究表明，BDE-209(口服800 mg·kg-1，超過7個月)可減少白細胞數(shù)量、抑制CD8 T細胞增殖和細胞因子的產(chǎn)生，從而引起免疫毒性。然而，這些從不同角度評估免疫毒性的研究缺乏系統(tǒng)性及多指標的綜合分析評價，且關于機體短期暴露于BDE-209是否可自行恢復的研究鮮見報道。

綜合生物標志物響應(integrated biomarker responses, IBR)是一種可通過簡單計算將多種生物標志物轉(zhuǎn)化為單個指標的綜合分析方法[16]。通過綜合分析，IBR可避免由于不同生物標志物的不同步而導致的評估結果偏差。過去幾十年，IBR被廣泛應用于生態(tài)和醫(yī)療研究領域[17-19]?，F(xiàn)今，IBR也逐漸應用于毒理學領域，但主要集中于水生毒理學研究，缺乏在嚙齒動物毒理學領域的應用[20-22]。因此，本研究通過建立成年期雌性Balb/c小鼠BDE-209暴露模型，考察其對臟器指數(shù)、免疫球蛋白、淋巴細胞增殖、脂質(zhì)過氧化等免疫指標的影響，并用IBR結合其他分析方法對研究結果進行綜合性評估，通過綜合性評價指標揭示短期BDE-209暴露的免疫毒性及機體的自體修復情況，該研究可為BDE-209的免疫毒性評估提供基礎數(shù)據(jù)，對人類健康具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1藥品與試劑 BDE-209(CAS No.1163-19-5)購自上海甄淮生物科技有限公司(以大豆油為溶劑，配置成濃度梯度為0.6、6和60 mg·mL-1的BDE-209大豆油溶液)；胎牛血清(FBS)和懸浮細胞1640 培養(yǎng)基(RPMI 1640)購自美國GIBCO公司；脂多糖(LPS)、刀豆蛋白A(ConA)、噻唑蘭(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；IFN-γ、IL-4、IgG酶聯(lián)免疫試劑盒購自合肥博美生物技術有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；RNA提取試劑盒購自Takara公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和DNA擴增試劑盒購自羅氏公司。

1.1.2動物與分組 清潔級8周齡 Balb/c 雌性小鼠80只，體重(18±2)g，購自江蘇大學動物中心，于實驗前檢疫3 d，飼養(yǎng)溫度(23±1)℃，濕度60%±5%。實驗動物隨機分組，每組20只，于產(chǎn)后(postnatal day，PND)56～76 d暴露于BDE-209。實驗設對照組(玉米油)、BDE-209高劑量組(400 mg·mL-1BDE-209)、BDE-209中劑量組(40 mg·mL-1BDE-209)和BDE-209低劑量組(4 mg·mL-1BDE-209)，灌胃量為0.2 mL·30 g-1·d-1，每天1次，連續(xù)給藥21 d。分別于給藥結束后的第1 d(PND77)和第21 d(PND98)進行相關指標的測定。

1.2 方法

1.2.1成年期BDE-209暴露對小鼠血常規(guī)指標的影響 末次給藥后第1 d 和第21 d，取小鼠眼球血于抗凝管中混勻，用于白細胞、淋巴細胞比率、紅細胞及血小板分析。

1.2.2成年期BDE-209暴露對小鼠臟器指數(shù)的影響 末次給藥后第1 d 和第21 d，脫頸處死。取出脾臟和胸腺并稱重記錄，按照公式計算臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)(mg·g-1)=臟器重量(mg)/體重(g)

1.2.3成年期BDE-209暴露對小鼠血清IgG的影響 末次給藥后第1 d和第21 d，小鼠眼后靜脈叢取血，3 000 r·min-1離心10 min，取上層血清，采用酶聯(lián)免疫法測定血清中IgG的含量。

1.2.4成年期BDE-209暴露對小鼠淋巴細胞增殖的影響 脾細胞懸液的制備參考Li等[23]的方法。調(diào)整脾細胞懸液濃度為5×106個·mL-1，接種于96孔板，100 μL·孔-1。分別向每孔中加入ConA液(10 μg·mL-1，100 μL)或LPS液(20 μg·mL-1，100 μL)，對照孔加入等量培養(yǎng)液，每組設10個復孔。于37 ℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，采用MTT法于570 nm處測定其OD值。

1.2.5成年期BDE-209暴露對小鼠淋巴細胞分泌細胞因子的影響 按照1.2.4的方法制備脾細胞懸液，接種于24孔板，200 μL·孔-1，培養(yǎng)48 h后，1 000 r·min-1離心10 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫法測定IFN-γ和IL-4的含量。

1.2.6成年期BDE-209暴露對小鼠脂質(zhì)過氧化的影響 末次給藥后第1 d和第21 d，分別取脾臟和胸腺各200 mg置于10 mL離心管中，加入適量的生理鹽水，制成10%的組織勻漿液，3 000 r·min-1離心10 min后，取上清液，根據(jù)試劑盒說明測定MDA和SOD的含量。

1.2.7成年期BDE-209暴露對小鼠脾臟IFN-γ和IL-4 mRNA表達的影響 末次給藥后第1 d和第21 d，小鼠脫頸處死，取其脾臟，去除結締和脂肪組織后，按照Trizol試劑盒要求提取總RNA，Nanodrop2000測定總RNA濃度。按照Takara試劑盒要求將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-80 ℃保存。以cDNA為模板進行PCR擴增反應，用LightCycler 96熒光定量PCR儀進行熒光定量分析。

表1 qPCR研究中引物序列Table 1 Primers sequences in the qPCR study

1.3 IBR計算

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，組間差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，結果用平均值±標準差(X±SD)表示，采用Turkey檢驗方法用于實驗中各暴露組與對照組之間差異的顯著性比較，P<0.05表示暴露組與對照組之間有顯著性差異。析因分析、主成分分析結合IBR用于指標的綜合分析，其中析因分析中P<0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 成年期BDE-209暴露對小鼠血常規(guī)指標的影響

如表2所示，在PND77時，與空白對照組相比，小鼠白細胞數(shù)量及淋巴細胞比率均呈下降趨勢，并在中高劑量組具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。PND98時，BDE-209暴露引起的血常規(guī)指標異常均得到恢復，且與對照組相比無顯著差異，提示小鼠在切斷暴露源后可得到一定程度的自我修復。

2.2 成年期BDE-209暴露對小鼠臟器指數(shù)的影響

如表3所示，與空白對照組相比較，PND77時各暴露組小鼠的脾臟和胸腺指數(shù)均呈下降趨勢，且在中高劑量組具有統(tǒng)計學差異(P< 0.05或P< 0.01)。停止暴露21 d后(即PND98時)，各暴露組臟器指數(shù)均得到一定程度的恢復且與對照組無顯著差異(P>0.05)?？梢?，中、高劑量BDE-209暴露可引起小鼠免疫器官的萎縮，但該毒性效應可通過機體自我修復得到改善。

2.3 成年期BDE-209暴露對小鼠血清IgG的影響

如圖1所示，短期低、中劑量BDE-209暴露可顯著增加小鼠血清IgG含量(P< 0.01)，停藥21 d各劑量組IgG含量與空白對照組無顯著差異，提示該免疫刺激作用可在暴露源清除后得到改善。

表2 成年期BDE-209暴露對小鼠臟器指數(shù)的影響Table 2 Effect of BDE-209 exposure on organ index of adult mice

表3 成年期BDE-209暴露對小鼠臟器指數(shù)的影響Table 3 Effect of BDE-209 exposure on organ index of adult mice

注：**表示與空白對照組相比，差異在P<0.01水平上具有統(tǒng)計學意義。圖1 成年期BDE-209暴露對小鼠血清IgG的影響Fig.1 Effect of BDE-209 exposure on IgG secretion from serum in adulthood mice

2.4 成年期BDE-209暴露對小鼠脾臟淋巴細胞增殖的影響

由圖2可知，PND77時，BDE-209可不同程度抑制ConA和LPS誘導的小鼠脾淋巴細胞增殖，與對照組相比，各暴露組均具有顯著的抑制作用(P<0.01)。PND98時，BDE-209暴露所致的脾淋巴細胞增殖能力降低得到改善且與對照組相比無顯著差異，表明BDE-209暴露所致的成年期小鼠細胞免疫損傷可隨著暴露源清除得到改善。

2.5 成年期BDE-209暴露對小鼠淋巴細胞分泌細胞因子的影響

由圖3可知，BDE-209暴露21 d可抑制小鼠淋巴細胞IFN-γ的分泌，促進IL-4的分泌，且高劑量組與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。暴露結束21 d后，二者均得到改善，但與對照組相比，高劑量組IL-4的分泌量與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示BDE-209暴露對IFN-γ和IL-4的影響可在暴露源清除后得到一定程度的恢復。

2.6 成年期BDE-209暴露對小鼠脂質(zhì)過氧化的影響

由圖4可知，PND77時，BDE-209可顯著增加脾臟和胸腺組織中MDA含量，降低SOD活性(脾臟40 mg·kg-1和400 mg·kg-1，P<0.01；胸腺，400 mg·kg-1，P<0.01)。PND98時，高劑量組可顯著增加組織MDA含量(P<0.01)，并顯著降低胸腺SOD活性(P<0.01)，表明BDE-209暴露對小鼠脂質(zhì)過氧化的影響較難在暴露源清除后得到恢復。

注：**表示與空白對照組相比，差異在P<0.01水平上具有統(tǒng)計學意義。圖2 成年期 BDE-209 暴露對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響Fig.2 Effect of BDE-209 exposure on splenocyte proliferation in adult mice

2.7 成年期BDE-209暴露對小鼠脾臟IFN-γ和IL-4 mRNA表達的影響

由圖5可知，PND77時，中、高劑量BDE-209可顯著促進小鼠脾臟IFN-γ和IL-4 mRNA表達(P< 0.01)。PND98時，IFN-γ和IL-4 mRNA表達與空白組相比均未見顯著性差異。由此可知，BDE-209暴露對IFN-γ和IL-4 mRNA表達具有一定的促進作用，但在停止暴露后可通過自我修復得到一定程度的恢復。

2.8 綜合分析

2.8.1主成分分析(PCA) 由表4可知，所有特征值為1以上的保留因子共3個，累積貢獻率達到82.085%，說明PCA成功將13個變量成功降維變成3個因子，且這3個因子保留了全部數(shù)據(jù)82.085%的信息。由表5可知，在第一主成分的特征向量中，荷載較高(>0.7)的指標有IFN-γ mRNA、IL-4 mRNA、淋巴IL-4、脾臟SOD、脾臟MDA、脾臟指數(shù)、淋巴IFN-γ；在第二主成分的特征向量中，荷載較高(>0.7)的指標有B細胞增殖、T細胞增殖；在第三主成分的特征向量中，荷載較高(>0.7)的指標有IgG。

2.8.2IBR分析 圖6中的3個方向軸表示3種生物標志物(IgG、B細胞增殖、淋巴IL-4)，星狀圖圍成的面積為IBR值。從圖6中可以看出，在同一暴露劑量下，PND98的IBR值小于PND77的IBR值；與空白對照組比較，暴露劑量組IBR增大。表明BDE-209對成年期小鼠具有免疫毒性，但在停止暴露21 d后機體可通過自我修復降低該免疫毒性效應。

注：**表示與空白對照組相比，差異在P<0.01水平上具有統(tǒng)計學意義。圖4 成年期BDE-209暴露對小鼠抗氧化能力的影響Fig.4 Effect of BDE-209 exposure on anti-oxidation capacity of adulthood mice

注：**表示與空白對照組相比，差異在P<0.01水平上具有統(tǒng)計學意義。圖5 成年期BDE-209暴露對小鼠脾臟中IFN-γ、IL-4基因表達的影響Fig.5 Effect of BDE-209 exposure on IFN-γ and IL-4 mRNA expression in splenocytes in adult mice

圖6 不同濃度BDE-209暴露后成年期小鼠IBR星狀圖Fig.6 IBR of adult mice exposed from different concentration of BDE-209

表4 元件提取結果Table 4 The results of component extraction

2.8.3析因分析 由表6可知，BDE-209劑量和是否度過恢復期對IgG、B細胞增殖、T細胞增殖、脾臟MDA、脾臟SOD、淋巴IL-4、IFN-γ mRNA、IL-4 mRNA具有極顯著的交互性(P<0.01)，對脾臟指數(shù)、淋巴IFN-γ具有顯著的交互性(P<0.05)，說明針對這些指標，BDE-209暴露毒性與劑量相關，并且可在停藥21 d后得到有效改善。

表5 旋轉(zhuǎn)元件矩陣Table 5 Rotated component matrix

表6 析因分析結果Table 6 The results of factorial analysis

3 討論

胸腺和脾臟是重要的免疫器官，其指數(shù)變化可在一定程度上反映機體的免疫功能。BDE-209暴露降低了小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，表明其可導致胸腺和脾臟萎縮。Kreutz等[25]研究發(fā)現(xiàn)，暴露于農(nóng)藥成分的魚比正常魚的免疫球蛋白水平更高，揭示免疫刺激效應的有害性。因此，研究中發(fā)現(xiàn)的IgG水平升高，提示BDE-209暴露對成年期小鼠的免疫毒性。ConA誘導T淋巴細胞增殖，LPS誘導B淋巴細胞增殖，研究發(fā)現(xiàn)BDE-209顯著抑制PND77的T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖，這與上述脾臟和胸腺萎縮的相關結果是一致的。Liu等[26]研究發(fā)現(xiàn)，暴露于BDE-209的大鼠淋巴細胞增殖受到抑制，這與我們的結果相似。

為了進一步探究BDE-209的免疫功能障礙，此次研究檢測了胸腺和脾臟中的MDA和SOD水平。結果表明，BDE-209可提高MDA水平，降低SOD活性。先前對于BDE-209的甲狀腺毒性研究發(fā)現(xiàn)，BDE-209可對甲狀腺產(chǎn)生類似影響[27]。本團隊已有研究表明BDE-209可通過氧化損傷產(chǎn)生免疫毒性，這與先前研究發(fā)現(xiàn)的機體對環(huán)境壓力異常的應激反應和免疫毒性誘導反應一致[28]。

Th1型細胞因子IFN-γ是主要的促炎細胞因子，Th2型細胞因子IL-4是主要的抗炎細胞因子。先前研究表明，在一些感染性、自身免疫性/炎癥性、過敏性(特應性)和腫瘤性疾病中，促炎和抗炎性細胞因子之間存在嚴重的不平衡[29]。此次研究發(fā)現(xiàn)，BDE-209暴露對IFN-γ分泌具有抑制作用，對IL-4分泌具有促進作用，提示對Th1反應的下調(diào)和對Th2反應的上調(diào)，反映了潛在的Th1/Th2失衡。IFN-γ基因表達與細胞因子分泌的變化趨勢相反，推測是機體的負反饋調(diào)節(jié)所致。盡管IFN-γ與IL-4基因表達的變化趨勢相同，但其變化程度不同，表明存在潛在的Th1/Th2失衡。

BDE-209對小鼠的影響經(jīng)自我修復21 d后，所檢測指標均趨向正常水平。相比空白對照組，臟器指標、IgG、脾淋巴細胞增殖及Th1/Th2相關基因mRNA水平均無統(tǒng)計學意義上的差異。低劑量組細胞因子分泌水平及SOD、MDA水平恢復正常，中、高劑量組差異仍有顯著性。這些結果表明，BDE-209對成年小鼠的體液免疫和脂質(zhì)過氧化具有較持久的影響，且主要發(fā)生在中、高劑量暴露下。

IBR可通過簡單的多元圖形方法(星狀圖)將各種生物標記物變化進行可視化。析因分析不僅可以檢驗各因素水平之間的差異，而且可以檢驗各因素之間的交互作用。為了全面分析BDE-209的免疫毒性，以及短期暴露于BDE-209是否可以通過停藥后自我修復來降低其免疫毒性，可采用IBR和析因分析進行綜合分析。PCA通過減少維數(shù)而不丟失重要信息來分析數(shù)據(jù)，此次研究考慮到大量的指標，使用它來選擇用于IBR分析的生物標記物。經(jīng)PCA分析，選擇保留85.821%信息的3個主成分。選取3個與這3個主成分密切相關的生物標志物(IgG、B細胞增殖、淋巴IL-4)進行IBR分析。鑒于BDE-209暴露結束21 d后各組的IBR值均明顯小于暴露結束時的IBR值，推測小鼠具有良好的自我修復能力。析因分析結果顯示，對于多項檢測指標，BDE-209的暴露劑量和是否度過恢復期之間存在交互影響，說明小鼠在切斷暴露源后可有效降低BDE-209的毒性作用。這一結果與我們觀察到的PND98大多數(shù)指標趨于正常一致。

綜上，短期BDE-209暴露對成年期小鼠具有免疫毒性，但機體可在切斷暴露源后通過自我修復得到一定程度的恢復。