袁啟鋒, 姚寶珍

武漢大學(xué)人民醫(yī)院兒科, 武漢 430060

孤獨癥譜系障礙(autism spectrum disorder，ASD)是一種多病因神經(jīng)發(fā)育性疾病，人群患病率約為1%，其中男性患病率約為1∶42，是女性患病率的4倍[1]。其臨床核心癥狀為社會交往障礙、重復(fù)刻板樣動作和狹窄興趣，除核心癥狀外，ASD患者還常表現(xiàn)有焦慮、抑郁、多動、沖動、易激惹、智力障礙、注意力缺陷、睡眠障礙、癲癇、便秘等伴隨癥狀[2]。自1940s首次描述ASD[3]，科學(xué)界對其病因進(jìn)行了廣泛探討，包括炎癥、自身免疫、基因異常等，但具體發(fā)病機制仍未明了。

在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)中，谷氨酸是最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，也是一種潛在的神經(jīng)毒素，其引起的興奮毒性可能導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的死亡。為了保持突觸傳遞的敏感性，谷氨酸必須被及時清除，其中，星形膠質(zhì)細(xì)胞的攝取是保持胞外谷氨酸濃度穩(wěn)定的最主要途徑[4]。星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元之間谷氨酸-谷氨酰胺的代謝偶聯(lián)(圖1)，可以防止過量的谷氨酸擴散到周邊的神經(jīng)元上，進(jìn)而避免了神經(jīng)元的過度興奮，對神經(jīng)元起到保護(hù)作用。谷氨酸能神經(jīng)元是哺乳動物大腦皮層最主要的神經(jīng)元。在谷氨酸能神經(jīng)元中，谷氨酰胺(glutamine，Gln)經(jīng)谷氨酰胺酶(glutaminase，GLS)催化為谷氨酸(glutamate，Glu)，Glu與N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR)、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體(α-amino-3-hydroxy5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor，AMPAR)、紅藻氨酸受體(kainate receptor，KAR)、代謝性谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptors，mGluRs)結(jié)合，形成興奮性電位。星形膠質(zhì)細(xì)胞可通過膜上谷氨酸轉(zhuǎn)運體(glutamate transporter, GLT)攝取突觸間隙Glu，在谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)作用下轉(zhuǎn)化為Gln，后者被星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放，可再次進(jìn)入Glu能神經(jīng)元或者γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)能神經(jīng)元。在GABA能神經(jīng)元，Glu被谷氨酸脫羧酶(glutamic acid decarboxylase，GAD)催化為GABA，與Glu能神經(jīng)元相類似，GABA與GABA受體結(jié)合，產(chǎn)生抑制性電位，被星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)GABA轉(zhuǎn)氨酶(GABA transporter，GAT)攝取的GABA通過三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle，TAC)，重新轉(zhuǎn)化為Glu和Gln，從而被再次利用[5]。一系列研究表明，Glu與GABA在ASD患者不同腦區(qū)表達(dá)水平不同[6-8]，提示谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)異?？赡転锳SD發(fā)生的核心機制。因此，本文圍繞谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)與ASD的關(guān)系進(jìn)行綜述，重點探討炎癥、自身免疫、基因異常等ASD經(jīng)典致病因素與該循環(huán)異常之間的聯(lián)系，以期為孤獨癥譜系障礙分型和治療提供一種新思路。

圖1 谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)模式Fig.1 Glutamate-glutamine cycle mode

1 谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)異常與ASD

1.1 Glu、GABA水平與ASD

當(dāng)前，關(guān)于ASD患者Glu、GABA水平的研究結(jié)論并不一致(表1)，這可能是由于研究對象在年齡、性別、受試者數(shù)量等因素方面存在較大的差異且所取的生物學(xué)樣本不同[13]。后續(xù)研究可以通過標(biāo)準(zhǔn)化這些因素來改進(jìn)，并且利用Glu/GABA比值來代替單個氨基酸水平，以更好地反映神經(jīng)興奮/抑制平衡。由于Glu、GABA在ASD發(fā)病機制和治療中的潛在作用，監(jiān)測其在體液乃至唾液、尿液和糞便中的濃度變化對ASD患者的早期診斷和干預(yù)也很重要;此外，有研究提示GABA可能是一種靈敏度和特異度均較高的ASD血清標(biāo)志物[14]。

1.2 NMDAR與ASD

NMDAR是一種配體門控興奮性離子通道受體，在神經(jīng)元興奮性毒性和突觸可塑性方面發(fā)揮重要作用。NMDAR廣泛分布于大腦，由GluNR1～GluNR3 3個亞基構(gòu)成：GluNR1含甘氨酸結(jié)合位點；GluNR2有A、B、C、D 4種亞型，含Glu結(jié)合位點；部分NMDAR還含有GluNR3亞基，可抑制該受體功能。靜息狀態(tài)時，NMDAR鈣離子(Ca2+)通道由水合鎂離子(Mg2+)堵塞。當(dāng)突觸前膜釋放Glu等神經(jīng)遞質(zhì)，激活A(yù)MPAR等受體，突觸后膜去極化，Mg2+被移除，此時甘氨酸結(jié)合GluNR1亞基與Glu結(jié)合GluNR2亞基共激動NMDAR，Ca2+通道開放，Ca2+進(jìn)入神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)。當(dāng)突觸間隙Glu濃度異常升高，NMDAR過度激活時，神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)鈣超載，活化相關(guān)代謝酶、生成氧自由基、破壞細(xì)胞能量產(chǎn)生，進(jìn)而損傷神經(jīng)元[15]。NMDAR過度激活所導(dǎo)致的神經(jīng)元興奮性毒性損傷可能與ASD發(fā)病相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，ASD患者血清甘氨酸濃度更高[16]，同樣，丙戊酸(valproic acid，VPA)誘導(dǎo)的ASD模型小鼠前額葉皮層GluNR2B亞基水平也較正常組高[17]，提示ASD患者NMDAR功能增強。而使用NMDAR拮抗劑MK-801(出生后6～10 d給藥)，可改善VPA模型ASD鼠社會交往障礙和重復(fù)刻板樣動作[18]，但MK-801(0.03 mg·kg-1)也會損害正常小鼠社會交往功能[19]，這可能與MK-801劑量有關(guān)，劑量不同，它的生物效應(yīng)可能截然相反[20]。D-環(huán)絲氨酸，作為甘氨酸結(jié)合位點相關(guān)的NMDAR部分激動劑，可作用于NMDAR，進(jìn)而促進(jìn)AMPAR移除來改善ASD模型鼠(出生后28 d給藥)社會交往障礙，且不同于Glu直接激活NMDAR，D-環(huán)絲氨酸并不會導(dǎo)致興奮性神經(jīng)毒性[21]。NMDAR的激活需AMPAR參與，故D-環(huán)絲氨酸最終可能通過降低VPA暴露后代的NMDAR功能來改善ASD癥狀，當(dāng)然這需要進(jìn)一步試驗來驗證。此外，ASD鼠NMDAR功能可能與小鼠年齡密切相關(guān)。Shank2-/-小鼠是經(jīng)典的ASD模型，研究發(fā)現(xiàn)，這種小鼠在出生早期(出生后15 d內(nèi))表現(xiàn)為NMDAR功能亢進(jìn)，后期則表現(xiàn)為NMDAR功能減退，早期使用NMDAR拮抗劑——美金剛，可有效緩解小鼠社會交往障礙，而早期使用D-環(huán)絲氨酸或后期使用美金剛則均無明顯效果[22]。那么，VPA誘導(dǎo)的ASD模型鼠甚至臨床ASD患者NMDAR功能是否隨年齡有這種類似轉(zhuǎn)變，仍需進(jìn)一步深入探究。

表1 谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)異常與ASD發(fā)病相關(guān)研究Table 1 Study on the relationship between abnormal glutamate-glutamine cycle and ASD

2 炎癥與ASD

炎癥是機體的一種固有免疫方式，正常機體促炎細(xì)胞因子/抗炎細(xì)胞因子處于平衡狀態(tài)。肥胖與促炎細(xì)胞因子/抗炎細(xì)胞因子失衡相關(guān)。值得注意的是，與正常人群相比，ASD患者常有肥胖表現(xiàn)[23]。提示ASD可能與炎癥相關(guān)[24-26]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子-ɑ(tumor necrosis factor-ɑ，TNF-ɑ)mRNA表達(dá)水平與ASD患者社會行為異常有關(guān)，與患者其他核心癥狀相關(guān)性則未得到證實[27]。

炎癥可通過影響谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)導(dǎo)致ASD發(fā)生(圖2)。在ASD動物模型中，促炎細(xì)胞因子/抗炎細(xì)胞因子失衡與谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)異常并存[25]。星形膠質(zhì)細(xì)胞在谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)中具有重要作用，神經(jīng)炎癥可致GLT-1表達(dá)上調(diào)和GS表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量和功能，導(dǎo)致其對Glu攝取能力下降，過度激活NMDAR，造成神經(jīng)元興奮性毒性損傷[28-29]。為探究ASD患者神經(jīng)炎癥與谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)異常之間的因果關(guān)系，El-Ansary等[30]對20名ASD患兒血清樣本進(jìn)行多元回歸分析，認(rèn)為ASD患兒血清Glu升高87%歸因于神經(jīng)炎癥。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)炎癥可激活犬尿氨酸途徑(kynurenine pathway，KP)，該途徑代謝產(chǎn)物喹啉酸過度激活NMDAR導(dǎo)致ASD發(fā)生[31]。

圖2 炎癥通過影響谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)導(dǎo)致ASD發(fā)生Fig.2 Inflammation leads to ASD by affecting glutamate-glutamine cycle

3 自身免疫性抗體與ASD

自身免疫性抗體由B細(xì)胞合成，CD19是B細(xì)胞表面重要膜抗原。對ASD患者外周血流式細(xì)胞分型，可發(fā)現(xiàn)CD19陽性細(xì)胞計數(shù)較正常人群高[32]。部分ASD患者發(fā)病與自身免疫性抗體相關(guān)，例如：1型糖尿病絕大多數(shù)為自身免疫性疾病，母親患1型糖尿病，其子女ASD風(fēng)險也更高[33]。但Connery等[34]對82名ASD患兒自身免疫性腦炎相關(guān)的多種抗體進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)NMDAR血清抗體均陰性，僅有5%患兒GAD65抗體陽性。當(dāng)然，抗NMDAR抗體腦炎患兒可表現(xiàn)為ASD樣癥狀[35]，說明該抗體可能與ASD發(fā)病相關(guān)，但并不是由于抗體直接影響谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)所致，因為NMDAR抗體陽性的ASD患兒突觸上NMDAR并未被破環(huán)[36]。自身免疫抗體可能是在大腦形成免疫復(fù)合物介導(dǎo)炎癥，從而間接導(dǎo)致該循環(huán)異常[37]。

4 基因異常與ASD

多種ASD相關(guān)基因與谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)異常相關(guān)，且ASD嚴(yán)重程度與該循環(huán)存在遺傳關(guān)聯(lián)[38]。NMDAR基因表達(dá)異常會導(dǎo)致ASD發(fā)生，其離子通道開放需同時激活突觸前膜和突觸后膜，這種獨特開放機制使NMDAR對于突觸可塑性具有重要影響。長時程抑制 (long-term depression, LTD)和長時程增強 (long-term potentiation, LTP)是突觸可塑性的兩種關(guān)鍵形式。

NMDAR輕度去極化時，Ca2+少量進(jìn)入突觸后神經(jīng)元，突觸后膜AMPAR被移除且去磷酸化，LTD發(fā)生。Neuroligin基因家族編碼突觸后細(xì)胞黏附分子，對突觸的發(fā)育和成熟有重要作用。Neuroligin1是該家族成員之一，Neuroligin1基因缺失雜合子小鼠海馬區(qū)NMDAR介導(dǎo)的LTD減弱，并表現(xiàn)為ASD樣癥狀[39]。同樣，該家族另一基因，R451C-neuroligin3發(fā)生突變，也會減弱LTD，導(dǎo)致ASD發(fā)生[40]。但Lee等[41]提到，ASD相關(guān)基因突變可能是減弱mGluR介導(dǎo)的LTD，而非NMDAR介導(dǎo)的LTD。

LTP是突觸可塑性的另一種形式。當(dāng)NMDAR被激活，Ca2+大量進(jìn)入突觸后神經(jīng)元，非突觸AMPAR插入突觸后膜且AMPAR被磷酸化，LTP發(fā)生。ASD相關(guān)基因突變影響NMDAR介導(dǎo)的LTP也可能是疾病發(fā)生的一種機制。Rac1是一種小G蛋白，具有GTP酶活性，當(dāng)其被鳥嘌呤核苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factor，GEF)激活，與GTP結(jié)合時，便能促進(jìn)肌動蛋白聚合。Dock4屬于GEF成員，由DOCK4基因編碼，可激活Rac1，DOCK4基因敲除小鼠表現(xiàn)為ASD樣行為，且海馬CA1區(qū)NMDAR密度減少，NMDAR介導(dǎo)的LTP也被抑制，而藥物激活NMDAR可減輕這些小鼠的社會認(rèn)知障礙[42]?？傊?，ASD相關(guān)基因表達(dá)異常可能影響谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)，并進(jìn)一步影響突觸可塑性，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

5 展望

ASD臨床表現(xiàn)不盡相同，病因也是復(fù)雜多樣，導(dǎo)致該疾病診斷和治療難度頗大，探究眾多病因的內(nèi)在聯(lián)系，明確ASD發(fā)病核心機制，對于疾病的研究顯得極其重要。谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)異?？赡苁茿SD的核心發(fā)病機制，炎癥、自身免疫性抗體和ASD相關(guān)基因異常等經(jīng)典病因均可能通過影響該循環(huán)，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。當(dāng)前，谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)異常具體如何導(dǎo)致ASD發(fā)生，相關(guān)研究結(jié)論并不一致。后續(xù)臨床研究需要盡可能擴大樣本量，且研究對象盡可能同質(zhì)。本文為簡化ASD病因及分型提供了一種新思路，即ASD發(fā)病相關(guān)病因較多，但它們均可能是通過影響谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)導(dǎo)致疾病的發(fā)生，那么，未來或許可針對該循環(huán)這一共同靶點對ASD進(jìn)行有效治療。