陳炫亦, 李紹軍, 陳衛(wèi)民, 孟泉科

1.西北農林科技大學創(chuàng)新實驗學院, 陜西 楊凌 712100；2.西北農林科技大學生命科學學院, 陜西 楊凌 712100；3.三門峽職業(yè)技術學院， 河南 三門峽 472000

在生命科學研究領域中，激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope，LSCM)是光學顯微水平上觀察生命活動的重要工具，但是其成像模式會對樣品和熒光分子產生較大的影響，樣品中等焦點以外的熒光分子仍然會被路過的激光激發(fā)卻不參與成像，等到更換共聚焦點再次激發(fā)參與成像時可能會出現(xiàn)光漂白而導致失真；在需要長時間觀測高靈敏活性樣品的研究中，傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡光毒性較大，會造成樣品熒光失活，無法滿足高保真觀測要求[1-2]。首個真正意義上的光片熒光顯微鏡(lightsheet fluorescence microscope, LSFM)，又名選擇平面光照明顯微鏡(selective plane illumination microscope, SPIM)，由Huisken等[3]在《科學》雜志上于2004年報道，距普通光片成像技術的提出(1903年)及熒光顯微鏡的誕生(1908年)已有百年。光片熒光顯微鏡作為一種新型熒光顯微鏡，采用不同于傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡的成像模式，大幅降低光毒性，減少了光漂白現(xiàn)象的發(fā)生，解決了時空連續(xù)性觀測大型活體樣品內部熒光信號成像難題。鑒于光片熒光顯微鏡在細胞生物學、發(fā)育生物學以及神經生物學等領域的潛在應用價值，與光片熒光顯微鏡同年誕生的《自然-方法》將其評選為建刊十年以來十大生物學領域新技術之一[4]。

基于此，本文簡要介紹光片熒光顯微鏡的成像原理、成像特點以及標志性改進成像質量的事件，重點介紹光片熒光顯微鏡在神經生物學、發(fā)育生物學、動物細胞生物學和植物科學領域的應用，并對近年來代表性應用進行匯總，旨在幫助研究人員快速了解該顯微鏡的基本原理及其在生命科學領域中的應用，為相關領域的研究者提供參考。

1 光片熒光顯微鏡的成像原理、特點與改進

1.1 成像原理

光片熒光顯微鏡采用薄片層狀光源取代了以往熒光顯微鏡的圓柱狀光源，利用柱面鏡聚焦或快速掃描高斯光束、貝塞爾光束等方式在探測物鏡的焦面產生非常薄的片狀光場，在樣品內形成一塊二維的光平面(sheet)，平面內的熒光分子受到光激發(fā)產生熒光，形成熒光平面，如同利用光束在立體標本中切出切片一樣，“光片(light sheet)”之名由此而來[2,5]。光片的產生方式主要有4種，具體見表1。

表1 4種光片產生方式的比較Table 1 Comparation between four ways of producing light sheet

激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope，LSCM)通常只有1個工作物鏡，基于落射式架構的共聚焦顯微鏡，其物鏡同時起到激光光源照明匯聚和樣品成像的功能，利用濾色鏡將熒光以外的光過濾掉，再通過同一物鏡接收激發(fā)得到的熒光信號[10]。而光片熒光顯微鏡通過2個物鏡分別完成激發(fā)光的照射及熒光信號的收集，將照明和探測成像兩個功能分開。片狀的激發(fā)光源通過一個照明物鏡對樣品從一側進行照射，橫穿樣品內部的扁平光束會在樣品中形成一個熒光照射平面。這個二維平面與激發(fā)光的軸向呈90°，即照明激發(fā)光路與探測光路互相正交，被與激發(fā)光束垂直排列的探測成像物鏡和相機所采集。由于其激發(fā)裝置和探測裝置在同一平面正交分布，而非在同一條豎線上排列，這使得放置生物樣本的承載容器也與傳統(tǒng)顯微鏡的平板狀載物臺不同(圖1)[2, 11]。受到這種裝置結構的影響，光片熒光顯微鏡的樣品是裝載在含有瓊脂糖或氟化乙丙烯的樣品圓柱長管中的。共聚焦顯微鏡的樣品通常承載在載玻片或培養(yǎng)皿等平面支持物上，對樣品有薄片狀的要求；而光片熒光顯微鏡采用的正交光路設計，使其具有較大的觀測空間，可以觀測較大的樣本，其樣品可以是較大尺度的完整胚胎、器官等[5]，如秀麗隱桿線蟲[12]、黑腹果蠅[13]、斑馬魚[14-15]、夏威夷明溝蝦[16]和小鼠[17-19]等模式生物的動物活體胚胎或器官。

圖1 光片熒光顯微鏡的基本原理Fig.1 Basic principle of the light-sheet fluorescence microscope

1.2 成像優(yōu)勢

1.2.1低光毒性、光漂白性與低光損傷 光毒性(phototoxicity)是指在較長時間的強光照射下，活體生物樣本細胞內的有機分子會產生分解現(xiàn)象，這是利用激光作為光源進行顯微觀測時無法避免的[20]。光損傷(photodamage)是指長時間或是高劑量進行激光掃描樣品，令樣品細胞內有機分子受到破壞的現(xiàn)象[1]。光漂白(photobleaching)指的是熒光分子在光照下熒光褪色減弱的過程，幾乎所有的熒光團在光照下都會出現(xiàn)褪色[21]。光毒性、光漂白和光損傷是熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡觀察樣本常面臨的負面效應。

共聚焦顯微鏡基于針孔結構，采用傳統(tǒng)的光發(fā)射-激發(fā)耦合模式，即光的發(fā)射與探測裝置由二向色鏡等效在一條直線上排列且空間重合。在觀測樣品某一平面的時候將會使樣品內大多數(shù)的化合物都吸收光，這種無選擇性的光照會增大光漂白的影響，容易對樣本造成較大的光損傷以及光毒性作用，導致無法長時間連續(xù)觀測活體樣本[20]。而光片熒光顯微鏡側向照明的方式使其只需照亮觀測平面即可觀測所要觀測的成像面，使得光毒性和光漂白效應降低幾個數(shù)量級[21]，解決了共聚焦顯微鏡成像時無法長時間持續(xù)觀測的問題。

1.2.2高時空分辨率 光片熒光顯微鏡采用了寬視場的圖像采集器如電荷耦合器件(charge coupled device, CCD)相機和科研級互補金屬氧化物半導體相機(scientific complementary metal oxide semiconductor, sCMOS)，進行逐面成像，使得被激發(fā)光所照射的平面所有的熒光信號都能被檢測到。結合精確的采樣定位系統(tǒng)便可以快速地獲得樣品多層次的光學切片，還可在低光毒性的基礎上對活樣本同時進行長時間的多色、多視角成像[20]。

最早的成像模式是保持光片固定不動，沿探測光路軸向移動樣品，但由于位移平臺速度受限，其成像速度只能達到約10 frames·s-1；隨后出現(xiàn)了物鏡耦合平面照明顯微鏡(objective-coupled planar illumination microscope，OCPIM)[22]，主要是通過保持樣品靜止，用移動速度較快的壓電位移平臺沿軸向同時移動光片和探測物鏡進行三維成像，將成像速度提高到了20 frames·s-1，但僅適用于產生高斯光片，其他類型的光片由于需要更復雜的激發(fā)裝置，無法滿足OCPIM的承重要求；再往后出現(xiàn)了解耦合照明探測光片熒光顯微鏡(decoupled illumination detection-light sheet fluorescence microscope, DID-LSFM)[23]，在探測光路中加入三次相位板(cubic phase-mask, CPM)來拓展探測裝置的景深，成像速度可以達到1 600 frames·s-1(通過設置感興趣領域減少相機使用像素數(shù)目)，這種高時空分辨率的成像模式是其他顯微鏡難以實現(xiàn)的。但是在引入CPM后，需經后期去卷積處理抵消高速、寬視場成像所帶來的分辨率與對比度下降等問題。國內也有相關研究，如胡渝曜等[24]提出通過引入電動可變焦距透鏡(electrically tunable lens, ETL)與一維振鏡，大幅提高成像速度以突破移動探測物鏡或移動樣本等方案的速度極限，使單幅圖像穩(wěn)定成像的速度達到275 frames·s-1，此外通過調整光路還有效地減少了高時空分辨率成像過程中偽像的出現(xiàn)。Greer和Holy[25]引入了分布式平面顯像(distributed planar imaging)的技術，即在OCPIM的基礎架構中的鏡筒透鏡后置入鋒利的棱鏡鏡面(knife-edged prism mirror, KEM)，將圖像截成兩部分，分別由CMOS相機接收，可以并行對兩部分圖像處理，而后拼合，提高圖像處理速度，支持深達700 μm、每秒掃描28 mm的成像，研究人員將其命名為快速物鏡耦合平面照明顯微鏡(fast objective coupled planar illumination microscopy)。此外，與近年來快速發(fā)展的超分辨技術結合，也成為光片熒光顯微鏡成像模式改進的熱點之一，如受激輻射損耗-光片熒光顯微鏡(stimulated emission depletion selective plane illumination microscope, STED-SPIM)[26]、相干結構照明-光片熒光顯微鏡(coherent structured illumination light sheet fluorescence microscope, csi-LSFM)[27]等，突破了傳統(tǒng)熒光顯微鏡的光學衍射極限，有效提高了顯微鏡的分辨率。如Leica公司的TwinFlex可以與自家的SP8超分辨成像技術結合使用。

1.3 成像效果的改進與優(yōu)化

常見光源的光是容易產生衍射和散射問題的高斯光束(Gaussian beam)，存在觀測視場與軸向分辨率相互制約的問題。有研究小組選擇利用無衍射光束解決這一問題，如利用艾里光束(Airy beam)[28]或貝塞爾光束(Bessel beam)[29]來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的高斯光束來產生光片，顯著增強了高散射的大型生物樣品的體內細胞分辨率三維成像的信號對比度和成像深度。Wang等[30]以1 320 nm的近紅外二區(qū)的連續(xù)激光為激發(fā)光，能夠得到中心波長為1 600 nm的發(fā)射光，對小鼠腦組織進行非侵入式成像，成像深度達到2 mm。利用光片熒光顯微鏡觀測樣品過大仍會造成樣本光吸收量和散射過多，從而影響到成像的質量。多向選擇性層狀光照明顯微鏡(multidirectional selective plane illumination microscope, mSPIM)的出現(xiàn)解決了這2個問題：首先是從樣品的不同角度成像，成像疊加后的結果可以消除樣品吸收所引起的激發(fā)路徑陰影，這個策略也可以解決貝塞爾光片由于旁瓣的存在而導致的成像對比度下降問題；其次，從相反的方向連續(xù)照射樣品或者是成像后利用算法處理得到優(yōu)化后的結果，解決了在樣品中散射過強的問題[31]。Yang等[32]采用特殊設計的水浸式物鏡接收激發(fā)光，而后被相機采集，通過改變介質，有效地提高了信號接收率，還可作為附加模塊安裝到熒光倒置顯微鏡上，使其能夠進行光片熒光顯微成像。

對于這種可以進行高時空分辨率成像的顯微鏡來說，高頻的機械偏移使圖像質量下降，是一個難以避免的問題。張球等[33]提出利用4f系統(tǒng)和CCD相機跟蹤樣品的位置并使用納米平移臺對機械漂移進行補償?shù)姆桨?，有效地減少了機械偏移現(xiàn)象的出現(xiàn)。

在光片熒光顯微鏡允許盡可能多的光線通過物鏡的同時，使得衍射所產生的離焦信號被采集。去卷積算法可以有效解決成像模糊的問題，去卷積(deconvolution)就是利用各種算法消除離焦的圖像信號或是對其進行重新分配，提高圖像的對比度和分辨率[34]。在單位算力價格逐步下降的今天，計算密集型的去卷積算法愈來愈廣泛地應用在光片熒光顯微成像中。如Zhang等[35]采用海森正則化(Hessian regularization)算法和修改后的去條紋算法(stripe-removal algorithm)對圖像進行處理和重建，能夠在較厚的光片中保持高成像對比度和高信噪比的容積成像。此外，F(xiàn)ei等[36]開發(fā)了一種新的光片熒光顯微鏡——亞體素光片熒光顯微鏡(subvoxel light sheet microscopy, SLSM)，通過支持向量回歸機(support vector regression, SVR )算法重建一批低分辨率圖像。重建4×SLSM采集到的圖像分辨率優(yōu)于同倍數(shù)鏡SPIM近百倍；4×SLSM的分辨率略優(yōu)于20×SPIM的分辨率，但成像速度是后者的10倍還多，且光漂白顯著低于后者。

目前針對不同的具體研究條件，產生了以正交光路設計為核心的一系列光片熒光顯微鏡，如在探測物鏡焦平面上快速移動聚焦光束，形成一個虛擬光片的數(shù)字掃描激光光片顯微鏡(digitally scanned laser light sheet microscope, DSLM)[20]；同時利用3個物鏡(2個照明物鏡和1個探測物鏡)，發(fā)射兩束排在同一直線對射的光束激發(fā)樣品的多向選擇性層狀光照明顯微鏡(multidirectional SPIM, mSPIM)[31]；具有多個探測物鏡，可多向對立體樣本進行信號采集的多視角光片顯微鏡(multi-view light-sheet microscope, MuVi-LSFM)[5]；在傾斜樣品內部形成傾斜光片，可以對細胞、秀麗隱桿線蟲性腺、果蠅幼蟲腦部、小鼠視網膜和腦切片以及整個棘魚進行深達66 μm超分辨成像的單分子傾斜平面顯微鏡(single-molecule oblique-plane microscopy, obSTORM)[37]等。

各大公司開發(fā)了許多商用光片熒光顯微鏡。一些顯微鏡套用的是傳統(tǒng)顯微鏡鏡筒裝配架構，將平面載物臺替換為成像室，側面有照射物鏡。另一些則是采用了集成化箱體設計的非傳統(tǒng)顯微鏡裝配架構[5]，放棄了傳統(tǒng)顯微鏡的架構使得光片顯微鏡能在保留核心結構的同時，有了更多靈活的裝配空間來觀測較大的立體樣本。如蔡司(Zeiss)推出的Lightsheet Z.1，呈箱式的外觀與傳統(tǒng)顯微鏡相差極大，內部裝載有含瓊脂糖或聚全氟乙丙烯的樣本管；其他比較具有代表性的還有徠卡(Leica)公司的TwinFlex、Luxendo公司的MuViSPIM和InViSPIM等，Lexendo公司生產的這2款顯微鏡中，MuViSPIM還額外支持樣品的旋轉功能。

2 光片熒光顯微鏡的應用

光片熒光顯微鏡解決了傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡難以長時間觀測以及無法對大體積活體樣本的觀測問題，而這些問題恰恰是研究神經與發(fā)育生物學等學科的核心要求。截至2020年12月，被Web of Science數(shù)據(jù)庫收錄的以“l(fā)ight sheet fluorescence”或“selective plane illumination”為關鍵詞的文獻已有2 263篇，包括但不限于對光片熒光顯微鏡的改進和應用。

2.1 光片熒光顯微鏡在神經生物學中的應用

光片熒光顯微鏡在神經科學領域的應用為中樞神經系統(tǒng)的發(fā)育以及獲得亞細胞分辨率的完整哺乳動物大腦形態(tài)圖像等研究提供了可能；使用貝塞爾光束和艾里光束等無衍射光束還可以顯著增加混濁神經組織穿透深度的能力[11]。在觀測一些密度較大、易造成散射降低成像質量的樣品，如大腦、免疫器官、腫瘤組織等時需要作透明化處理，方可達到更理想化的觀測效果。Tomer等[13]對發(fā)育中的黑腹果蠅胚胎神經系統(tǒng)進行了高分辨率的長期成像，并在體內建立了神經母細胞譜系，還在整個早期胚胎中實現(xiàn)了精準的單細胞自動跟蹤。Hahn等[17]在原有3DISCO (3-dimensional imaging of solvent-cleared organ) 技術的基礎上開發(fā)出了一種新式組織透明技術sDISCO (stabilised 3D imaging of solvent-cleared organs)，對小鼠全腦進行了高分辨率的熒光成像。該技術的核心是由1份苯甲醇(benzyl alcohol)和2份苯甲酸芐酯(benzyl benzoate)配制而成的一種組織透明化試劑BABB，它可以作為清除劑將所要觀察周圍無關的聯(lián)結組織清理掉，得到更好的深層組織成像效果。研究表明，通過GCaMP對斑馬魚大腦中的鈣離子的捕獲進而產生熒光，發(fā)現(xiàn)丘腦對外界光信號刺激，尤其是對若隱若現(xiàn)的光刺激起到感應器的作用，并將這一信息傳達至頂蓋，使生物產生逃離的反應[15]。光片熒光顯微鏡的低光毒性保證了實現(xiàn)長時間檢測腦部神經活動的可能性。Misha Ahrens實驗室發(fā)現(xiàn)位于延髓后側的一部分去甲腎上腺素能神經細胞能夠激活位于延髓側部的一部分膠質細胞，在必要的時候允許動物選擇放棄，抑制持續(xù)失敗的行為[38]。其實驗室在2018年發(fā)表在《自然-方法》[39]和《神經元》[40]上的文章提供了該研究使用的光片熒光顯微鏡、虛擬現(xiàn)實、細胞消融術和光遺傳學等技術詳細的實驗方法與工具說明。此外，還有研究小組首次發(fā)現(xiàn)了斑馬魚的睡眠神經信號特征：大腦背側皮層存在低頻率高幅度的簇狀放電活動(slow bursting sleep)，且端腦存在持續(xù)傳播的神經信號波，表明脊椎動物大腦中睡眠的共同神經信號可能出現(xiàn)超過了4.5億年[41]。

2.2 光片熒光顯微鏡在動物發(fā)育生物學中的應用

光片熒光顯微技術以其低光毒性和可三維實時成像為核心特性，解決了難以長時間對發(fā)育中的生命體進行顯微觀測的難題，正在成為發(fā)育生物學研究中必不可少的研究工具。Ding等[42]利用光片熒光顯微鏡與配套的熒光友好型組織清理技術(fluorescence-friendly tissue clearing technique)觀測了新生兒以及小鼠心臟，量化了心室尺寸，還定位了從出生后到成年小鼠心臟的心臟特異性蛋白和離子通道的空間分布。充分說明了光片熒光顯微技術極大地促進了發(fā)育生物學所能觀測到空間的廣度和時間的長度。Wolff等[16]通過對一種海洋甲殼動物——夏威夷明鉤蝦的胚胎發(fā)育過程進行持續(xù)長達數(shù)天的觀察，隨后對長出的胸肢在單細胞分辨率下進行細胞重建，分析發(fā)現(xiàn)正在生長的早期肢體原基會進一步劃分出2個分別進行前-后軸與背-腹軸發(fā)育的部分，并于肢遠端交匯；肢芽的形成與細胞增殖過程的空間調控有關，同時肢體的伸長也受細胞分裂過程在遠-近軸上的優(yōu)先取向的驅動。Daetwyler等[14]同時對5個活斑馬魚胚胎進行成像，再以紅細胞圖像作為訓練數(shù)據(jù)，建立了一套可自動化處理并分析數(shù)據(jù)集的平臺。通過平臺的分析，得到了一個記錄有時間信息且能精準定量的三維血管網絡發(fā)育模型。有研究報道，將光片熒光顯微鏡與微粒圖像測速(micro-particle image velocimetry, μPIV)技術相結合，對3 d左右斑馬魚幼體的心臟血液流動進行跟蹤，根據(jù)流動數(shù)據(jù)模擬重建出心臟血液流動的三維模型，此外還可測算出每次泵動的血液流量[43]。Mcdole等[44]設計了一種智能的光片熒光顯微鏡，能夠自適應性的跟蹤胚胎發(fā)育過程，構建出小鼠胚胎從原腸胚形成到早期器官發(fā)育的全過程，在此基礎上該研究小組繪制出了小鼠的高分辨胚胎發(fā)育圖譜和細胞水平的命運圖譜。

2.3 光片熒光顯微鏡在動物細胞行為相關研究中的應用

光片熒光顯微鏡的低光毒性、低光漂白性和低光損傷的特點，支持長時間對活細胞進行跟蹤。Renkawitz等[45]在借助光片熒光顯微鏡長時間跟蹤細胞行為時，發(fā)現(xiàn)了部分種類的癌細胞、中性粒細胞以及T細胞等變形細胞可以利用細胞核衡量路徑寬窄，并以此來尋找細胞遷移過程中最易通過路徑的行為。Vargas-Patron等[46]對斑馬魚幼體進行了含有熒光標記人膠質母細胞瘤(glioblastoma)細胞的異體移植。通過利用光片熒光顯微鏡的持續(xù)成像，結合流式細胞儀對細胞增殖情況的分析，鑒定出了人膠質母細胞瘤細胞的至少3個細胞增殖周期。同時根據(jù)人膠質母細胞瘤在斑馬魚體內的增殖和生長情況，認為其可以作為臨床前研究過程中評估抗增殖藥物有效性的模型。多形性膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme)會通過誘導血管生成和血管重構來改變健康組織的血管網絡，因此研究人員對小鼠大腦進行U87與GL261多形性膠質母細胞瘤的異體移植，通過光片熒光顯微鏡的成像，建立了移植前后的血管拓撲結構模型[47]。研究發(fā)現(xiàn)在整體上基本拓撲結構保持一致，但在細節(jié)上發(fā)生了許多微妙的改變。移植后的血管拓撲結構具有較高的腫瘤內和腫瘤間異質性，這有助于我們更好的了解這一腫瘤對血管拓撲結構的影響。Prahst等[18]使用光片熒光顯微鏡對小鼠視網膜組織在細胞和亞細胞水平進行快速、定量的三維及四維時移成像。相對于共聚焦成像時制片對視網膜結構的破壞，光片熒光顯微鏡可以對整個眼部進行成像，以避免破壞原有組織形態(tài)。研究人員運用該顯微鏡通過氧誘導視網膜病變模型(oxygen-induced retinopathy, OIR)觀測到諸如細胞移動異常、細胞絲狀偽足的改變以及之前從未觀測到的病態(tài)血管簇等現(xiàn)象。

2.4 光片熒光顯微鏡在植物科學中的應用

近年來，在光片熒光顯微鏡在動物器官和胚胎研究中應用越來越廣泛的背景下，植物學家也將其用作研究植物生理生化與發(fā)育的新工具。研究人員利用一種熒光能量共振技術結合光片顯微鏡對擬南芥根尖細胞的胞質及核質中的Ca2+進行動態(tài)成像，跟蹤其在不同刺激下Ca2+的分布與濃度變化，從而在植物發(fā)育與信號轉導方面可以獲得植物體內高分辨率、在大組織體積深度方面獲得可忽略光漂白效應的更精確的研究結果[48]。Jozefamaj實驗室分別對擬南芥[49]和紫花苜蓿[50]的根部細胞分裂過程進行長時間成像跟蹤。通過對擬南芥根部細胞中磷脂酶Dα(phospholipase D alpha 1)與微管、網格蛋白小泡(clathrin-coated vesicles, CCVs)和網格蛋白小窩(clathrin-coated pits, CCPs)之間的定位，可知細胞是否正在進行分裂；通過對紫花苜蓿根表皮和皮層細胞微管中熒光標記的長時間連續(xù)跟蹤，得到根部生長速率的信息。De Col等[51]開發(fā)出基于熒光能量共振轉移的新型ATP熒光感應蛋白——ATeam1.03-nD/nA，結合光片熒光顯微鏡用于監(jiān)測細胞質或細胞器(如線粒體)中的MgATP2-，并能繪制出諸如根須等組織的MgATP2-含量與分布圖，這套方案能夠對活細胞的ATP能量代謝狀況進行精準、高效的實時分析，為活細胞能量代謝研究提供了高通量的研究手段。此外，利用對擬南芥花的種系分化(germline differentiation)現(xiàn)象進行多視角跟蹤，在亞細胞分辨率下重建出花的三維模型，觀察到了雌、雄胚子的減數(shù)分裂、花粉不對稱分裂、減數(shù)分裂過程中染色體的移動以及在絨氈層細胞中異常的再組有絲分裂(unusual restitution mitosis)等現(xiàn)象[52]。Slattery等[53]利用光片熒光顯微鏡監(jiān)視葉片內部光環(huán)境，對野生大豆和葉綠素b突變體大豆Y11y11葉片的葉綠素與光合光能吸收率進行了分析。使用光片熒光顯微鏡不僅無需在葉片表面進行多余的處理，還能避免熒光成像時葉綠素所造成的誤差和焦平面的光漂白現(xiàn)象。

綜上所述，光片熒光顯微鏡以其寬視野、高時空分辨率及低光毒性、低光損傷等的優(yōu)勢在現(xiàn)代生命科學研究眾多領域中迅速崛起，近年來代表性的應用匯總見表2。

表2 光片熒光顯微鏡在生命科學領域的應用Table 2 Application of the LSFM in life science

續(xù)表物種觀測對象光片熒光顯微鏡參與的主要研究內容參考文獻哺乳綱人誘導多能干細胞脂肪干細胞泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤免疫細胞體外培養(yǎng)誘導多能干細胞,觀察分化心臟微組織的結構與功能,還通過對心肌細胞進行鈣成像,檢測其不同細胞的功能異質性,為研究組織的結構-功能互作提供新見解[68]結合組織清理技術,在小鼠大腦中觀測人誘導多能干細胞源神經前體細胞的分化,分化為神經細胞、星形膠質細胞和寡突膠質細胞,該研究提供了一套研究干細胞分化的成像方法[69]用于觀測生物活性玻璃參與誘導脂肪干細胞的成骨分化,開創(chuàng)了新的用于成骨分化和骨再生的立體水凝膠體外培養(yǎng)模式[70]首次系統(tǒng)介紹了利用光片熒光顯微鏡對胚胎與胎兒內、外生殖器與腎臟的樣本制作、成像和體外建模等完整流程[71]對上皮性卵巢癌組織進行成像,發(fā)現(xiàn)在癌細胞轉移的過程中,血管構造變的無序且密集,減少血流灌輸可以有效抑制轉移過程,為此類癌癥治療提供了新思路[72]在體外構建出肝癌細胞球狀體,使用顯微鏡觀察形態(tài)及其功能,發(fā)現(xiàn)球狀體中的肝細胞會發(fā)生極化并形成膽管,進行膽汁排泄,為特定組織的相關研究提供新的思路[73]對部分種類的癌細胞、中性粒細胞以及T細胞等變形細胞進行長時間成像,研究發(fā)現(xiàn)其可以利用細胞核寬度尋找最佳運動路徑,解答了白細胞等為何能夠快速通過致密組織,到達靶點的問題[45]鳥綱斑胸草雀輸卵管對斑胸草雀的輸卵管組織進行三維成像,研究精子的儲存機制,發(fā)現(xiàn)了一個可能影響精子選擇的門狀狹窄開口結構,這是首次對脊椎動物的精子儲存器官進行的三維成像與建模[74]昆蟲綱果蠅胚胎建立了SiMView成像系統(tǒng),對胚胎神經系統(tǒng)進行長時間成像,建立神經母細胞譜系,實現(xiàn)了精準的單細胞自動跟蹤,提供了高分辨的活體成像方法[13]甲殼綱夏威夷明鉤蝦胚胎對夏威夷明鉤蝦胚胎的腹肢發(fā)育過程進行長時間成像,這也為其他動物四肢的發(fā)育提供了新的研究思路和見解[16]頭足綱章魚胚胎實現(xiàn)了章魚卵的人工控制孵化,并對章魚的胚胎進行成像,觀測其發(fā)育和器官發(fā)生事件,為頭足類動物發(fā)育的研究提供支持[75]珊瑚綱尖枝列孔珊瑚珊瑚共生微生物結合組織清理技術,對珊瑚進行三維成像,還得到了共生微生物的豐度和空間分布,以及對細胞行為的捕捉,為珊瑚相關研究提供了有力的成像方法[76]雙子葉植物綱擬南芥紫花苜蓿大豆花根部根部表皮和皮層葉片對擬南芥花的種系分化現(xiàn)象進行多視角跟蹤與計算機模擬重建,觀察到一系列生殖細胞的細胞活動,為植物有性生殖研究提供新思路[52]對擬南芥根尖細胞胞質及核質中的Ca2+進行動態(tài)成像,研究鈣信號傳遞的細胞活動[48]對擬南芥根部細胞中磷脂酶Dα進行定位,結合其他蛋白質的信息,可以確定細胞是否正在進行分裂[49]開發(fā)出一種熒光感應蛋白,結合光片熒光顯微鏡成像,可以監(jiān)測細胞質或細胞器中的MgATP2-,對活細胞的ATP能量代謝狀況進行定量分析[51]對根部進行成像,研究植物與4種真菌的互作關系,以及真菌對植物分泌IAA與JA的影響,為研究植物-微生物互作機理的研究提供新思路[77]對紫花苜蓿根表皮和皮層細胞成像,得到根部生長速率的信息[50]對野生大豆和葉綠素b突變體大豆葉片的葉綠素與光合光能吸收率進行分析,發(fā)現(xiàn)葉綠素含量會極大地影響光衰減效應[53]

續(xù)表物種觀測對象光片熒光顯微鏡參與的主要研究內容參考文獻絲胞綱煙曲霉菌體對3種類型的小鼠侵襲性肺曲霉病模型肺部進行成像,觀測菌體生長與侵蝕小鼠肺部情況,揭示了抗真菌過程中肺泡巨噬細胞和多形核中性粒細胞這2個關鍵免疫細胞群的空間分布、相互作用和激活事件,有助于理解復雜的宿主-病原體互作和對小鼠模型的優(yōu)化[78]

3 展望

作為一類新式顯微鏡，光片熒光顯微鏡在保持高空間分辨率和最小化光漂白與光毒性的同時，進行容積成像。該顯微鏡所具有的較低的光毒性、高時空分辨率、寬視場、大型樣本成像、與不同激發(fā)態(tài)的相容性以及可以與其他現(xiàn)有成像技術和組學分析相結合的特性日益發(fā)展成熟，將滿足科研領域日益增長的對整個生物體、組織和細胞快速、溫和條件成像的需求。

在光遺傳學中，通過向神經元中導入特定基因，表達的光敏蛋白能將光信號轉換成電信號，再利用光的有無控制神經細胞的活躍與否[11]。腦的神經連接復雜，神經元之間連接轉換處理各種信號的數(shù)量是天文數(shù)字級別，而對某些神經官能疾病，例如對某些行為的神經網絡調控路線，我們要有效的追蹤哪些細胞與諸如語言遲滯、強迫癥等有關的神經疾病活動有關聯(lián)——是激活行為還是關閉行為。因此或許可以將光片熒光顯微鏡同光遺傳學技術結合起來，利用LSFM對組織的光照穿透力等特性，實現(xiàn)光控特定熒光標記細胞進行細胞生物學過程的研究。目前美國霍華德·休斯醫(yī)學研究所的Keller課題組已經采用光遺傳學或化學遺傳學的方法對神經通路進行干涉并應用于研究中[38-39]。除此之外，光片熒光顯微鏡作為高時空分辨率的觀測裝置，還可與當前熱門的諸如基因組學、轉錄組學以及蛋白質組學等多組學研究乃至基因編輯技術相結合[79]，通過將觀察性研究與構建細胞動態(tài)變化模型、細胞分子互作網絡的構建及信息整合挖掘的研究相聯(lián)系，有望統(tǒng)一長期以來對不同細胞種類定義研究領域“百家爭鳴”的局面, 為多維度認知細胞發(fā)育、行為和互作關系等提供了有力的技術支持。此外，大量的圖像數(shù)據(jù)已難僅靠人力進行處理，以圖像識別領頭的一系列深度學習技術漸漸成為該領域標本信息分析的“標配”，協(xié)助研究人員進行研究；反卷積算法的應用能夠有效解決寬視場成像所帶來的成像質量低的痛點，由此可以預見到愈來愈多計算機科學元素的加入是未來光片熒光顯微鏡發(fā)展的大勢所趨[35-36, 38]。光片熒光顯微鏡模塊化的裝配模式，使其包容性足夠大，有研究小組將其與藥物的高通量篩選系統(tǒng)結合，使得可以實時觀測藥物對如神經活動作用的效果[80]。

目前在光片熒光顯微鏡使用過程中仍會有一些局限，譬如在觀測心臟等器官時，殘留的血紅蛋白會干擾熒光分子，產生假陽性信號，還會在觀測中遇到生理偽影等的問題[30, 81]；一些比較厚的組織較強的光散射會造成成像質量不足[30]；以及成像所產生的數(shù)據(jù)常以太比特計量，需要大量的儲存介質保存。但從目前應用來看，光片熒光顯微鏡可以為細胞生物學、發(fā)育生物學以及神經科學等提供獨特優(yōu)勢的成像視域并促進學科的進一步發(fā)展。