劉旺, 靳晶豪, 陳孝仁

揚州大學(xué)園藝與植物保護學(xué)院, 江蘇 揚州 225009

基因擴增是分子生物學(xué)領(lǐng)域的基本研究手段之一，傳統(tǒng)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)以及在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來的熒光定量PCR、免疫PCR等技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對生物體核酸的有效擴增與檢測，但是由于存在所需儀器設(shè)備昂貴、反應(yīng)時間過長等缺點，使得以PCR為基礎(chǔ)的核酸擴增技術(shù)在現(xiàn)場快速檢測和基層的應(yīng)用推廣中受到了一定的限制。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，新技術(shù)不斷涌現(xiàn)。Notomi等[1]首次報道了環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)。該技術(shù)是一種新穎的核酸擴增技術(shù)，只需要在恒溫(60～65 ℃)條件下反應(yīng)30～60 min甚至更短時間即可完成核酸的擴增，無需使用昂貴的PCR儀[2]。LAMP技術(shù)能實現(xiàn)核酸擴增的核心之一就是使用2對特異性強的特殊引物：1對內(nèi)引物和1對外引物。為了便于描述，將靶基因的目的序列進(jìn)行命名(圖1A)，引物結(jié)構(gòu)如圖1B所示，外引物的堿基數(shù)量和濃度均需低于內(nèi)引物，以保證內(nèi)引物先于外引物和靶基因進(jìn)行配對反應(yīng)。LAMP技術(shù)的另一核心就是合成酶的選用。它使用的BstDNA合成酶具有非常重要的鏈置換活性，使得LAMP擴增過程中發(fā)生鏈置換反應(yīng)，即DNA聚合酶在延伸新鏈的過程中如果遇到了下游雙鏈，可以繼續(xù)延伸反應(yīng)并同時將下游雙鏈剝離而產(chǎn)生游離的單鏈。這兩者是LAMP技術(shù)能夠進(jìn)行核酸擴增的重要基礎(chǔ)[3]。

A:靶基因序列命名；B:LAMP引物結(jié)構(gòu)圖圖1 LAMP擴增結(jié)構(gòu)圖[3]Fig.1 The structure of LAMP[3]

與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，LAMP技術(shù)具有諸多優(yōu)點：特異性更強；靈敏度更高；操作簡單、快速；結(jié)合反轉(zhuǎn)錄酶可直接完成對RNA的擴增檢測；可與多種儀器結(jié)合，應(yīng)用范圍更廣[4]。目前，我國已開發(fā)出多種商業(yè)化LAMP試劑盒，使檢測成本進(jìn)一步降低，促進(jìn)了LAMP技術(shù)的推廣和普及[5]，為基層及落后地區(qū)相關(guān)機構(gòu)進(jìn)行現(xiàn)場快速檢測提供了方便。憑借其簡單、快速等優(yōu)勢，近年來LAMP技術(shù)在動植物病害、醫(yī)療、食品衛(wèi)生、水生物與環(huán)境現(xiàn)場檢測等方面得到了廣泛的應(yīng)用[5]。基于此，本文簡要介紹了LAMP技術(shù)的基本原理、反應(yīng)產(chǎn)物的檢測方法，重點闡述了LAMP技術(shù)的改進(jìn)與發(fā)展，綜述了近年來其在科研生產(chǎn)中的應(yīng)用進(jìn)展，并對其發(fā)展前景進(jìn)行了展望，以期為LAMP技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展提供合理的研究方向。

1 LAMP技術(shù)的原理

LAMP技術(shù)分為2個階段，即起始物合成階段(圖2)和循環(huán)擴增階段(圖3)。起始物合成階段最終形成一條莖環(huán)狀DNA，作為循環(huán)擴增階段的模板；循環(huán)擴增階段在內(nèi)引物和BstDNA合成酶的引導(dǎo)下發(fā)生置換反應(yīng)，形成長短不同的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，最終的擴增產(chǎn)物為莖環(huán)狀DNA與花椰菜狀DNA所組成的混合物[1]。擴增完成后需要對產(chǎn)物進(jìn)行檢測，目前檢測LAMP產(chǎn)物的主要方法有：瓊脂糖凝膠電泳檢測，其結(jié)果為梯帶狀的多個條帶[6]；實時濁度法檢測，擴增所產(chǎn)生的白色沉淀與DNA量之間呈線性關(guān)系，對擴增全過程實時監(jiān)控，比瓊脂糖凝膠電泳等終點檢測法效率更高、結(jié)果更準(zhǔn)確，但該方法適用于實驗室而不適于現(xiàn)場檢測；熒光比色檢測，在反應(yīng)體系中加入羥基萘酚藍(lán)(hydroxy naphthol blue, HNB)，可以通過觀察LAMP產(chǎn)物的顏色(陽性反應(yīng)的產(chǎn)物為紫色，陰性反應(yīng)則為天藍(lán)色),直接判斷靶基因是否成功擴增[7-8]。

圖2 LAMP起始物合成階段[1]Fig.2 LAMP initiation synthesis phase[1]

圖3 循環(huán)擴增階段[1]Fig.3 Loop amplification phase[1]

2 LAMP技術(shù)的改進(jìn)與發(fā)展

自2000年被推出以來，LAMP技術(shù)受到越來越廣泛的關(guān)注，但檢測對象的局限性、多對引物設(shè)計的困難性、反應(yīng)程序優(yōu)勢不夠明顯、技術(shù)應(yīng)用的單一性等問題都使得LAMP技術(shù)難以得到更好的推廣應(yīng)用。隨著技術(shù)的發(fā)展，各領(lǐng)域的專家在利用LAMP方法的同時也對此技術(shù)不斷進(jìn)行研究改進(jìn)，使得LAMP技術(shù)得到了很大的優(yōu)化提高。

2.1 檢測樣品的拓展

最初被提出時，LAMP技術(shù)主要是針對DNA的檢測。Notomi等[1]不僅對DNA進(jìn)行了檢測，也對RNA進(jìn)行了嘗試，發(fā)現(xiàn)LAMP技術(shù)配合反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行RT-LAMP，可以對RNA直接進(jìn)行檢測，隨后也證實了RT-LAMP檢測技術(shù)的可行性與準(zhǔn)確性。目前，LAMP技術(shù)不僅可對DNA與RNA樣品進(jìn)行檢測，而且對檢測樣品的純度要求與普通PCR相比較低。2007年Kaneko等[9]研究發(fā)現(xiàn)，LAMP技術(shù)對各種培養(yǎng)基成分具有較好的耐受性，檢測樣品不需要純化就能直接進(jìn)行擴增，降低了對檢測樣品的要求，極大地縮減了檢測成本，使LAMP技術(shù)得到了更廣泛的應(yīng)用。

2.2 引物設(shè)計的發(fā)展

雖然自開發(fā)以來LAMP技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用，但其引物設(shè)計是一大難點。一個反應(yīng)需要設(shè)計至少4條引物，繁瑣的引物設(shè)計過程需要研究人員花費大量時間進(jìn)行分析。但隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展，引物設(shè)計網(wǎng)站(如PrimerExplorer、BioSunLAMP等)建立了專業(yè)的LAMP引物設(shè)計模塊，用戶只需要像設(shè)計普通PCR引物那樣提供相關(guān)參數(shù)，系統(tǒng)就可產(chǎn)生多套LAMP引物組合以供選擇，極大地提高了引物設(shè)計效率，節(jié)省了實驗時間。

2.3 反應(yīng)程序的優(yōu)化

由于LAMP技術(shù)是恒溫擴增反應(yīng)，減少了PCR反應(yīng)中控制溫度變化所需的時間，所以在60 min左右的時間內(nèi)就能完成整個反應(yīng)，比PCR速度更快，但是相較于臨床研究中常用的免疫學(xué)技術(shù)，所用時間仍然過長。因此，人們對其反應(yīng)程序進(jìn)行了改進(jìn)與優(yōu)化。研究人員通過加入2條環(huán)引物等方法，使反應(yīng)時間縮短一半，最短可達(dá)11 min，且靈敏度比PCR技術(shù)高出2個數(shù)量級，極大地提高了檢測效率[4,10]。

2.4 與其他技術(shù)的聯(lián)用

隨著技術(shù)的進(jìn)步，研究人員將LAMP技術(shù)與其他技術(shù)進(jìn)行聯(lián)用，開發(fā)出許多優(yōu)秀的檢測方法。例如，將LMAP技術(shù)與聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)結(jié)合，發(fā)展出一種微孔LAMP反應(yīng)，減少了模板和引物的用量并能檢測1個DNA分子[10]；將LAMP技術(shù)與核酸雜交結(jié)合，應(yīng)用多重LAMP技術(shù)進(jìn)行擴增，使反應(yīng)操作更簡便快速且靈敏度高、特異性強，適用于臨床快速檢測[11]；免疫捕獲技術(shù)與LAMP技術(shù)聯(lián)用比與PCR技術(shù)結(jié)合的靈敏度高[12]?？梢?，LAMP技術(shù)與其他技術(shù)的聯(lián)用使得LAMP技術(shù)得到了更好的發(fā)展，同時也開發(fā)出具有不同功能的LAMP檢測試劑盒，使得LAMP技術(shù)應(yīng)用更加廣泛。

3 LAMP技術(shù)的應(yīng)用

自2000年推出以來，憑借操作簡單、反應(yīng)快速等優(yōu)勢，LAMP技術(shù)在植物病害檢測、動物病害檢測與食品安全檢測等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

3.1 在植物病害檢測中的應(yīng)用

近年來，LAMP技術(shù)不斷發(fā)展，可為植物病害防控提供病情預(yù)警和病害診斷依據(jù)，得到了廣泛應(yīng)用。目前，該技術(shù)適用于真菌、細(xì)菌、病毒與線蟲等植物病原物的檢測[13]。

3.1.1真菌病害的檢測 近年來，LAMP技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物病原真菌的快速檢測。利用LAMP方法加入HNB等指示劑，能夠快速有效地對曲霉(Aspergillusspp.)[14]、疫霉(Phytophthoraspp.)[15]、腐霉(Pythiumspp.)[16]、小麥白粉菌(Erysiphales)[17]等真菌完成現(xiàn)場檢測，無需分離真菌與植物的DNA，且檢測限可達(dá)到pg級甚至fg級，靈敏度遠(yuǎn)高于普通PCR方法。將LAMP方法與移動閱讀器等電子設(shè)備結(jié)合，可形成一種實時監(jiān)測致病疫霉的系統(tǒng)，及時有效控制其危害[18]。Chiara等[19]開發(fā)出一種檢測懸鈴木潰瘍病菌(Ceratocystisfimbriata)和櫟樹猝死病菌(Phytophthoraramorum)等不同類型的檢疫性病原物的便攜式儀器，增設(shè)了1對環(huán)引物，最快可在15 min內(nèi)完成檢測，促進(jìn)了植物檢疫部門在入境口岸和現(xiàn)場的檢疫工作開展。針對不同真菌病害的檢測需求，LAMP技術(shù)相繼得到優(yōu)化，相關(guān)設(shè)備得到研發(fā)，有望在田間條件下使用，使病害預(yù)測更加準(zhǔn)確和高效，有助于田間病害的及時防治。

3.1.2細(xì)菌病害的檢測 傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法一直是細(xì)菌檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但是該方法步驟繁瑣、費時費力，使用更簡便的檢測方法，如LAMP技術(shù)，是實現(xiàn)細(xì)菌快速檢測的必然需求[10]。針對病原菌設(shè)計特異引物，可特異性檢測細(xì)菌性果斑病(Acidovoraxavenaesubsp.citrulli)、細(xì)菌性潰瘍病(Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis)、炭疽病(Colletotrichumgloeosporioides)等，靈敏度比常規(guī)PCR高約1 000倍，大大提高了細(xì)菌病害的檢測效率[20-21]。利用LAMP技術(shù)可直接通過細(xì)菌懸浮液檢測丁香假單胞菌番茄致病變種(Pseudomonassyringaepv.tomato)，無需菌株分離和復(fù)雜的DNA提取，非常適用于植物檢疫和現(xiàn)場檢測[22]。在LAMP方法中加入熒光染料，能夠可視化快速診斷柑橘苗木黃龍病[23]與柑橘潰瘍病[24]，對柑橘的田間生產(chǎn)具有重要意義?？梢?，LAMP技術(shù)可以滿足植物檢疫和田間病害診斷需求，有利于控制細(xì)菌病害的傳播擴散。

3.1.3病毒病的檢測 LAMP技術(shù)現(xiàn)已用于DNA病毒和RNA病毒的快速檢測。RNA病毒檢測中常用的技術(shù)為RT-PCR，需要先用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA，然后以其為模板通過PCR擴增檢測，耗費了大量時間，增加了成本，而LAMP技術(shù)在檢測RNA病毒時加入逆轉(zhuǎn)錄酶，將逆轉(zhuǎn)錄步驟與擴增檢測步驟同時進(jìn)行，大大節(jié)省了時間成本，更便于RNA病毒的檢測[25]。瓜類壞死斑病毒(Melonnecroticspotvirus, MNSV)、小蒼蘭花葉病毒(Freesiamosaicvirus, FreMV)、百合無癥病毒(Lilysymptomlessvirus, LSV)、百合斑駁病毒(Lilymottlevirus, LMoV)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus, CMV)等嚴(yán)重危害植物的生長與觀賞價值，運用RT-LAMP可特異性快速檢測這些病毒，操作簡單、檢測效率高，非常適用于進(jìn)口植物、田間樣品的檢測，且已研制出相應(yīng)試劑盒，更利于在基層進(jìn)行推廣應(yīng)用[26-28]。

3.1.4線蟲病害的檢測 近年來，關(guān)于運用LAMP技術(shù)檢測植物線蟲病害的文獻(xiàn)報道較少。根結(jié)線蟲是分布最廣、危害最重的植物寄生線蟲，針對不同根結(jié)線蟲的種類特異基因區(qū)段設(shè)計特異性LAMP引物，加入熒光染料可直接可視化檢測植物或土壤中相關(guān)線蟲的存在，無需“先分離線蟲，再提取DNA”步驟，更簡便且靈敏度更高[29-30]。

綜上所述，選擇合適的靶基因設(shè)計高特異性引物是LAMP能否成功的重要條件。LAMP技術(shù)已經(jīng)廣泛用于植物病害的檢測，其靈敏度遠(yuǎn)高于普通PCR技術(shù)，且對于樣品的純度、用量要求更低，結(jié)合顯色指示劑能夠?qū)崿F(xiàn)可視化檢測，操作更加簡單快速，可滿足田間現(xiàn)場的檢測要求，有利于對田間病害的早期快速診斷治理。LAMP技術(shù)有望成為植物病害診斷的常用方法，廣泛用于農(nóng)村基層和條件相對落后的地區(qū)。

3.2 在人類疾病檢測中的應(yīng)用

由病原物侵染造成的動物病害，尤其是人類疾病，對人類生命安全和發(fā)展有著重大的影響。LAMP技術(shù)作為新興的技術(shù)手段，具有快速特異的優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于臨床疾病的檢測，給患者提供及時有效的醫(yī)療方案[31]。

3.2.1病毒檢測 人類歷史上曾出現(xiàn)過許多造成大規(guī)模影響的流行性病毒病，其中RNA病毒居多[32]。H7N9禽流感病毒、寨卡病毒(Zikavirus)、登革熱病毒(Denguevirus)、埃博拉病毒(Ebolavirus)、日本乙腦病毒(Japaneseencephalitisvirus, JEV)、諾如病毒(Norwalkvirus, NV)、水痘帶狀皰疹病毒(Varicella-zostervirus，VZV)等都嚴(yán)重危害人類健康，在世界范圍內(nèi)造成過一定的影響，選擇合適的靶基因結(jié)合反轉(zhuǎn)錄酶構(gòu)建RT-LAMP技術(shù)，再結(jié)合熒光染料可實現(xiàn)對RNA病毒的特異性可視化檢測，最短15 min內(nèi)即可完成，且敏感度和特異性分別可達(dá)到96.8%及100%，利于醫(yī)療衛(wèi)生場所現(xiàn)場快速診斷，可為疾病流行的預(yù)警與早期治療提供有效保障[33-37]。這表明RT-LAMP是一種簡便、快速、高靈敏和高特異的核酸擴增方法。

此外，病毒不僅危害著人類的健康安全，還對養(yǎng)殖動物造成危害，如牛白血病病毒(bovineleukaemiavirus, BLV)、對蝦白斑綜合征病毒(whitespotsyndromevirus, WSSV)等，直接影響經(jīng)濟效益，利用LAMP技術(shù)可分別對這些DNA病毒進(jìn)行檢測，最低檢測限可達(dá)到2.25 copies·μL-1，靈敏度比普通PCR技術(shù)高出10倍，且與其他病毒、細(xì)菌等病原無交叉反應(yīng)，特異性極好[38-39]。

3.2.2細(xì)菌檢測 大多數(shù)的人類呼吸道等常見疾病如結(jié)核病、細(xì)菌性肺炎等都是由細(xì)菌感染引起的，其控制的關(guān)鍵因素是通過監(jiān)測預(yù)防傳染以及快速診斷和有效治療。LAMP技術(shù)已在臨床中用于多數(shù)該類疾病的檢測和診斷。

結(jié)核病是世界上最具傳染性的呼吸道疾病之一，LAMP技術(shù)結(jié)合橫向流動試紙條(lateral flow dipstick，LFD)能夠?qū)崿F(xiàn)可視化檢測其病原菌，如結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、腸出血性大腸桿菌(Escherichiacoli)，不存在交叉反應(yīng)，特異性好，且檢出限為1.3 CFU·mL-1,高出PCR方法2個數(shù)量級，對結(jié)核病的早期快速診斷和及時治療具有積極作用[40-41]。LAMP技術(shù)對引起肺炎疾病的多種病原細(xì)菌也均能完成檢測[42-44]。

3.2.3寄生蟲檢測 以LAMP為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)已廣泛應(yīng)用于原生動物寄生蟲的檢測，包括蠕蟲(helminth)、錐蟲(Trypanosomaspp.)、瘧原蟲(Plasmodiumspp.)、巴貝蟲(Babesiaspp.)、血吸蟲(Schistosomespp.)、隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum)等寄生蟲[45-48]。

總結(jié)用于蠕蟲、吸蟲等寄生蟲檢測的LAMP方法，并與PCR方法進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)LAMP技術(shù)檢測寄生蟲的靈敏度平均比PCR技術(shù)高約100倍，最高可相差10 000倍；而且LAMP技術(shù)檢測成本低廉，更加快速簡便[46-47]。利什曼原蟲(Leishmaniaspp.)作為一種重要寄生蟲，能引起多種不同癥狀的利什曼病，嚴(yán)重危害人類健康。利用LAMP方法可以檢測不同癥狀的利什曼病，且已開發(fā)出相應(yīng)的檢測試劑盒，有利于發(fā)展中國家及落后地區(qū)及時診斷治療利什曼病[47]。

可見，LAMP技術(shù)在人類疾病的診斷中具有眾多優(yōu)勢，其檢測效率和靈敏度高、操作簡便、要求低、結(jié)果可視化、檢測時間短，這為疾病監(jiān)測和及時診斷治療提供了必要的保障，使疾病能夠得到更有效的控制。

3.3 在食品安全檢測中的應(yīng)用

食品安全是當(dāng)前社會關(guān)注的熱點話題，而要保障食品安全需要快速精確的技術(shù)方法來檢測食品中是否含有不利于人類健康的物質(zhì)。相較于傳統(tǒng)檢測方法，LAMP技術(shù)擁有眾多優(yōu)點，使得其在食源性致病菌的檢測和食品成分分析方面得到了廣泛應(yīng)用[49]。

3.3.1食源性致病菌的檢測 利用LAMP技術(shù)可以檢測食品中可疑的真菌、細(xì)菌等病原微生物，防止受污染的食品流入市場，保障食品安全。

食源性真菌的主要致病方式是產(chǎn)生真菌毒素，對人類食品或動物飼料供應(yīng)鏈構(gòu)成潛在風(fēng)險，危害人畜健康。棒曲霉素是一種廣泛存在于食品中的有毒的真菌次生代謝產(chǎn)物，基于棒曲霉素生物合成途徑的異環(huán)氧脫氫酶基因設(shè)計LAMP引物，可以特異性檢測出產(chǎn)生棒曲霉素的青霉菌種(Penicillium)，檢測限達(dá)到2.5 pg基因組DNA[50]。

目前，LAMP已經(jīng)成功用于多種食源性致病細(xì)菌，如金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[51]、單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)[52]、沙門氏菌(Salmonellaspp.)[53]、志賀氏菌(Shigellacastellani)[53]、大腸桿菌(Escherichiacoli)[54]等的檢測，檢測靈敏度可達(dá)10 fg·μL-1，與基于同源加尾系統(tǒng)(homo-tag assisted non-dimer, HAND)的高分辨率熔解曲線技術(shù)(high-resolution melting curve technique, HRM)聯(lián)用可同時檢測多種致病細(xì)菌，實現(xiàn)了設(shè)備落后地區(qū)快速檢測的要求，降低了食源性致病細(xì)菌產(chǎn)生中毒反應(yīng)甚至致死的威脅?？梢奓AMP檢測技術(shù)對于食品飲料行業(yè)的質(zhì)量控制是一種有前途的快速診斷工具。

3.3.2食品成分分析 利用LAMP技術(shù)，可對食品的組成成分進(jìn)行檢測，以打擊食品摻假等不法行為。

加工肉類中常含有的鹽分、香料、食用油等，雖然會影響PCR的檢測，但是不影響LAMP的檢測[55]。將DNA的堿性裂解法和LAMP技術(shù)結(jié)合，能夠檢測出牛肉中含量0.1%的豬肉，并排除相關(guān)物種(如牛、羊、雞)的交叉影響，可有效打擊市場上的肉品摻假現(xiàn)象[56]。

利用熒光染料，能夠可視化檢測羊奶制品中摻入的牛源性奶成分，特異性極好，熒光效果明顯，能檢測出羊乳中摻假0.1%的牛乳，完全滿足市場摻假量5%的檢測需要，可作為乳品市場監(jiān)督檢驗的可行方法[57]。

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品和食品的應(yīng)用越來越廣泛。LAMP技術(shù)憑借其良好的特異性、操作簡單快速等優(yōu)點，在轉(zhuǎn)基因生物(genetically modified organisms, GMOs)檢測中得到了廣泛應(yīng)用。近年來已經(jīng)開發(fā)了一系列可視化和實時LAMP檢測方法，用于現(xiàn)場快速、經(jīng)濟、高效地檢測GMOs，無需耗時的電泳分析，可檢測出高達(dá)0.005%～0.1%的轉(zhuǎn)基因含量，靈敏度遠(yuǎn)高于PCR技術(shù)[58]。

綜上所述，相較于其他檢測方法，LAMP技術(shù)具有明顯的靈敏度優(yōu)勢；和其他技術(shù)的聯(lián)用，不僅能同時對多種不同的食源性致病菌進(jìn)行檢測，極大地降低了檢測成本，還能進(jìn)行食品成分分析，有效打擊市場上的“摻假”亂象?？梢奓AMP技術(shù)在食品安全檢測上的應(yīng)用前景非常廣闊。

4 展望

作為分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究手段之一，傳統(tǒng)的PCR擴增技術(shù)由于存在所需儀器設(shè)備昂貴、反應(yīng)時間過長等缺點，難以在現(xiàn)場快速檢測和基層的應(yīng)用中實現(xiàn)推廣普及；而LAMP技術(shù)作為近年來新興的擴增檢測方法，擁有許多傳統(tǒng)擴增方法難以達(dá)到的優(yōu)勢，更有希望在基層和現(xiàn)場檢測中得到廣泛利用。

但是LAMP的擴增產(chǎn)物為不同長度的莖環(huán)DNA和花椰菜狀DNA的混合物，電泳呈階梯形條帶，明顯無法達(dá)到克隆基因的目的[7]。盡管該方法無法作為克隆基因的手段，但作為檢測方法，LAMP技術(shù)擁有眾多傳統(tǒng)方法難以達(dá)到的優(yōu)勢，使其成為近年來的研究熱點。綜合前人研究，本文認(rèn)為，LAMP技術(shù)未來的研究發(fā)展重點在以下方面：針對LAMP技術(shù)的多對引物設(shè)計，可以進(jìn)一步優(yōu)化引物設(shè)計程序，使LAMP引物設(shè)計更加便捷精準(zhǔn)，節(jié)約篩選時間；針對LAMP技術(shù)的極高靈敏度、開蓋易造成污染，可以將LAMP產(chǎn)物的檢測置于其他技術(shù)儀器中，使其閉管即能完成檢測；目前LAMP技術(shù)已產(chǎn)生了許多試劑盒、檢測儀器等，但為了得到更廣泛的推廣與利用，LAMP檢測儀器應(yīng)該向小型化、便攜化發(fā)展，才能更好的服務(wù)于基層和現(xiàn)場檢測工作。

總之，LAMP技術(shù)作為一種新型核酸擴增檢測技術(shù)，在動植物病原物檢測、食品衛(wèi)生檢測等領(lǐng)域的應(yīng)用前景非常廣闊，但也需要不斷完善與發(fā)展，才能更好的服務(wù)于社會。