郭亮，高聰，張麗，陳修來，劉立明

（1 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；2 江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；3 鹽城工學(xué)院海洋與生物工程學(xué)院，江蘇鹽城224051）

依靠微生物為基礎(chǔ)的生物煉制可以綠色、高效合成工業(yè)化學(xué)品，而且還可以通過原料和微生物的改造，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品升級[1-3]。整合代謝工程、系統(tǒng)生物學(xué)、合成生物學(xué)與進(jìn)化工程的系統(tǒng)代謝工程對微生物細(xì)胞進(jìn)行定向設(shè)計(jì)、改造乃至重構(gòu)，獲得的微生物細(xì)胞工廠以生物質(zhì)為原料，可高效合成能源化學(xué)品、營養(yǎng)化學(xué)品、醫(yī)藥化學(xué)品及材料等多種化學(xué)品，有效解決了化學(xué)煉制對環(huán)境的危害以及動植物提取對自然資源的依賴[3-9]。由人工代謝路徑效率決定的微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)性能，顯著影響工業(yè)化學(xué)品生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)適用性。然而，由于微生物細(xì)胞歷經(jīng)數(shù)百萬年，進(jìn)化出精密的調(diào)控機(jī)制，剪接代謝路徑引起的代謝流擾動，不僅降低了人工代謝路徑之間的適配性，而且降低了人工代謝路徑與底盤微生物細(xì)胞之間的適配性，影響人工代謝路徑效率[10]。一方面，由于酶的催化特性不同，引入的人工代謝路徑酶，常常導(dǎo)致人工代謝路徑代謝通量低與代謝通量不平衡[11]。因此，強(qiáng)化或平衡人工代謝路徑的代謝通量，為提高目標(biāo)化學(xué)品代謝路徑的適配性，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化學(xué)品的產(chǎn)量、生產(chǎn)強(qiáng)度和得率最大化提供了可能。另一方面，由于底盤微生物為合成目標(biāo)化學(xué)品提供反應(yīng)場所、底物和輔因子等，合成目標(biāo)化學(xué)品不僅增加了人工代謝路徑與細(xì)胞內(nèi)源代謝路徑之間的交互作用，而且還重編程了底盤微生物細(xì)胞的代謝流，增加了底盤微生物的代謝負(fù)荷[12,13]。因此，解除人工代謝路徑與底盤微生物內(nèi)源代謝路徑之間的交互作用，強(qiáng)化人工代謝路徑與底盤微生物細(xì)胞整體代謝網(wǎng)絡(luò)的適配性，為提高人工代謝路徑與底盤微生物之間的適配性提供了希望。

提高人工代謝路徑之間，以及人工代謝路徑與底盤微生物之間的適配性是解決上述問題的重要手段。適配性是構(gòu)建高效微生物細(xì)胞工廠的關(guān)鍵，受到越來越多研究者的關(guān)注，成為了系統(tǒng)代謝工程研究的熱點(diǎn)之一。本文圍繞如何提高人工代謝路徑的適配性，以及提高人工代謝路徑與底盤細(xì)胞的適配性這一目標(biāo)，系統(tǒng)綜述了近年來最新研究成果，并分析了不同代謝調(diào)控策略的優(yōu)缺點(diǎn)。隨著系統(tǒng)代謝工程的發(fā)展，人工代謝路徑之間以及人工代謝路徑與底盤微生物之間的適配程度也將逐漸加深，為提高微生物細(xì)胞工廠的生產(chǎn)性能提供了希望。

1 提高人工代謝路徑的適配性

基于天然或人工的代謝合成路徑，設(shè)計(jì)與組裝目標(biāo)化學(xué)品合成路徑是構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠的基礎(chǔ)。然而，由于路徑酶的催化性能不同以及目標(biāo)化學(xué)品合成路徑過長，導(dǎo)致化學(xué)品合成路徑效率低，代謝通量不平衡，積累中間代謝產(chǎn)物，降低人工代謝路徑的適配性。根據(jù)目標(biāo)化學(xué)品代謝合成路徑，發(fā)展了強(qiáng)化與平衡人工代謝路徑的代謝通量的新策略，提高人工代謝路徑的適配性。

1.1 強(qiáng)化人工代謝路徑的代謝通量

利用系統(tǒng)代謝工程在微生物細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建一條高效合成目標(biāo)化學(xué)品的代謝路徑，是提高微生物細(xì)胞工廠性能的關(guān)鍵。在化學(xué)品的代謝合成路徑中，當(dāng)?shù)孜锱c化學(xué)品之間合成路徑過長時，需要借助空間組織工程建立多酶復(fù)合結(jié)構(gòu)，在空間上拉近路徑酶之間的距離，減少中間代謝物的流失，增加代謝路徑的效率[14]。此外，當(dāng)路徑酶催化活性低或者無法催化底物生成目標(biāo)化學(xué)品時，需要借助蛋白質(zhì)工程或酶定向進(jìn)化策略，改造酶分子的空間結(jié)構(gòu)，提高路徑酶的催化效率，增加代謝路徑的合成效率[7,15,16]。

1.1.1 空間組織工程

為了提高多酶代謝路徑的催化效率，利用DNA、RNA 和蛋白質(zhì)腳手架可以將代謝路徑酶組裝成空間組織，減少中間代謝產(chǎn)物的流失、減弱競爭代謝支路、降低有毒中間代謝產(chǎn)物的積累[圖1(a)][7]。DNA腳手架借助鋅指蛋白將路徑酶特異性地錨定在DNA腳手架上[14]。例如，Chen等[14]將丙酮酸羧化酶和蘋果酸脫氫酶與鋅指蛋白融合，使其能夠特異性結(jié)合到相應(yīng)的DNA 腳手架上，當(dāng)丙酮酸羧化酶和蘋果酸脫氫酶的比例為1∶2 時，富馬酸的產(chǎn)量增加到28.64g/L。與DNA 腳手架不同，RNA 腳手架利用RNA 適配體與代謝路徑酶結(jié)合，組裝成復(fù)雜的多維空間結(jié)構(gòu)[17]。例如，在氫氣的生產(chǎn)過程中，將氫化酶和丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶與RNA 適配體融合，組裝的RNA 腳手架，使氫氣的產(chǎn)量增加了4倍[17]。此外，利用蛋白質(zhì)之間的相互作用也可以組成蛋白質(zhì)腳手架[18]。例如，利用蛋白質(zhì)腳手架將葡萄糖二酸合成路徑中的關(guān)鍵酶肌醇-1-磷酸合成酶、肌醇單加氧酶和糖醛酸脫氫酶進(jìn)行空間定位，使葡萄糖二酸的產(chǎn)量增加到2.5g/L[18]。

1.1.2 蛋白質(zhì)工程

蛋白質(zhì)工程通過對酶分子的設(shè)計(jì)與改造，提高了目標(biāo)化學(xué)品代謝合成路徑的效率[15]。蛋白質(zhì)工程的主要研究方向是提高酶的催化活性和改變酶的底物或產(chǎn)物特異性[15,19]。利用定點(diǎn)突變技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)酶分子的蛋白質(zhì)工程改造，提高酶分子的催化活性。例如，通過對比谷氨酸棒桿菌與產(chǎn)琥珀酸曼氏桿菌的蘋果酸脫氫酶催化特性以及晶體結(jié)構(gòu)，將產(chǎn)琥珀酸曼氏桿菌的蘋果酸脫氫酶第11 號氨基酸從甘氨酸突變?yōu)楣劝滨０?，使蘋果酸脫氫酶的活性提高了2.9 倍，將琥珀酸產(chǎn)量提高到84.19g/L[15][圖1(b)]。此外，利用蛋白質(zhì)工程可以對酶進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，改變酶的底物特異性，擴(kuò)展底物譜[19]。例如，利用計(jì)算機(jī)模擬酶與底物進(jìn)行對接，設(shè)計(jì)的二醇脫氫酶實(shí)現(xiàn)了對非天然底物1,2,4-丁三醇的催化，使1,4-丁二醇的產(chǎn)量增加到209mg/L[19]。

蛋白質(zhì)工程改造往往需要掌握酶的催化機(jī)理、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，而結(jié)構(gòu)與功能復(fù)雜的關(guān)系限制了蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用。為了解決這個問題，發(fā)展了定向進(jìn)化技術(shù)。定向進(jìn)化是通過對路徑酶進(jìn)行多輪突變，在實(shí)驗(yàn)室模擬并加速天然酶進(jìn)化過程，以期獲得一個或多個預(yù)期性能改進(jìn)的酶突變體[20]。例如，在異戊二烯生物合成途徑中，異戊二烯合酶活性不足，無法有效地將二甲基烯丙基焦磷酸催化為異戊二烯。研究人員通過易錯PCR 的定向進(jìn)化技術(shù)，使異戊二烯合酶的活性提高了3.8 倍，將異戊二烯的產(chǎn)量提高到3.7g/L[圖1(c)][20]。此外，DNA shuffling、增長截短法和交錯延伸PCR 也可以用于定向進(jìn)化中路徑酶的多輪突變[16]。

1.2 平衡人工代謝路徑的代謝通量

隨著系統(tǒng)代謝工程的不斷發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)平衡人工代謝路徑中的代謝通量，提高了人工代謝路徑的適配性，增加了代謝路徑的合成效率。多元模塊化工程[11]、體外代謝工程[21]和CRISPR系統(tǒng)[22]等技術(shù)是解決上述問題的重要途徑。

1.2.1 多元模塊化工程

圖1 強(qiáng)化代謝通量的策略

圖2 平衡代謝通量的策略

多元代謝工程的思路是將人工代謝路徑分為不同的模塊，再利用系統(tǒng)代謝工程對各個模塊的強(qiáng)度進(jìn)行精細(xì)化調(diào)控和協(xié)調(diào)不同模塊的表達(dá)，提高模塊與模塊間的適配性，最終對整個代謝路徑進(jìn)行優(yōu)化[14,23]?；谀K劃分的方法，可以將多元模塊化工程分為基于生化反應(yīng)的模塊化、基于代謝支路的模塊化和基于酶轉(zhuǎn)化速率的模塊化[圖2(a)]。基于中間代謝物的濃度作為生化指標(biāo)，將化學(xué)品合成路徑分為不同的模塊，例如，研究人員將紫杉醇的代謝合成路徑分為合成異戊烯焦磷酸與二甲基烯丙基焦磷酸的上游模塊與合成紫杉醇的下游模塊，利用不同強(qiáng)度的啟動子和不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒對其進(jìn)行組合優(yōu)化，使紫杉醇的產(chǎn)量增加15000 倍，達(dá)到1.02g/L[24]?；诨瘜W(xué)品合成代謝路徑，將化學(xué)品合成路徑分為中心代謝路徑和支路代謝路徑模塊，例如，研究人員通過重新剪接代謝網(wǎng)絡(luò)，將富馬酸合成路徑中的10 個基因分為還原模塊、氧化模塊和副產(chǎn)物模塊，并利用系統(tǒng)代謝工程優(yōu)化了上述模塊，使富馬酸的產(chǎn)量增加到33.13g/L[14]?；诖x合成路徑中酶轉(zhuǎn)換數(shù)為指標(biāo)，將不同酶促反應(yīng)劃分成不同模塊，例如，研究人員將(2S)-柚皮素合成路徑分為四個模塊：由葡萄糖合成L-苯丙氨酸/L-酪氨酸組成的模塊一、由L-苯丙氨酸合成肉桂酰輔酶A 或者由L-酪氨酸合成對香豆酰輔酶A 組成的模塊二；由丙二酸合成丙二酰輔酶A的途徑組成的模塊三、由肉桂酰輔酶A合成生松素或者由對香豆酰輔酶A合成柚皮素組成的模塊四[25]。經(jīng)多輪模塊優(yōu)化后，生松素和柚皮素的產(chǎn)量分別提高至84.2mg/L和105.1mg/L[25]。

1.2.2 體外代謝工程

體外代謝工程的原理是在無細(xì)胞體系中模擬細(xì)胞內(nèi)的級聯(lián)反應(yīng)，減少副反應(yīng)的發(fā)生，增加代謝路徑合成效率，同時也可以通過評估路徑酶對代謝通路的貢獻(xiàn)確定代謝瓶頸[26]。通過整合磷酸戊糖途徑（Pentose）、雙歧桿菌分流途徑（Bifido）與糖酵解途徑（Glycolysis），在體外組建了一個超過二十種酶組成的PBG 循環(huán)，可以有效地將葡萄糖轉(zhuǎn)換為乙酰輔酶A，并通過引入聚羥基丁酸酯合成路徑，使聚羥基丁酸酯對葡萄糖的得率達(dá)到90%[27]。此外，Gao 等[28]在體外構(gòu)建了合成蘋果酸的乙醛酸路徑，通過研究單個路徑酶對反應(yīng)速率的影響，鑒定出異檸檬酸裂解酶催化的反應(yīng)為限速步驟，并利用CRISPRi技術(shù)對路徑酶進(jìn)行理性調(diào)控，使蘋果酸的產(chǎn)量增加到36g/L[圖2(b)]。

1.2.3 CRISPR系統(tǒng)

依靠CRISPR-Cas9 基因編輯系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾和基因缺失三種基因操縱，為快速組裝有益的基因修飾提供可能[22]。在該研究中，研究人員分別將失活的CRISPR 核酸酶與激活結(jié)構(gòu)域融合，構(gòu)建了用于轉(zhuǎn)錄激活的CRISPRa；與抑制結(jié)構(gòu)域融合，構(gòu)建了用于轉(zhuǎn)錄干擾的CRISPRi；并使用具有活性的CRISPR 核酸酶，構(gòu)建了用于基因缺失的CRISPRd，并將三種系統(tǒng)組裝，構(gòu)建了可以同時實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾和基因缺失的CRISPR-AID系統(tǒng)[圖2(c)]。在釀酒酵母中利用CRISPR-AID 系統(tǒng)，使β-胡蘿卜素的產(chǎn)量提高了3倍，使釀酒酵母細(xì)胞表面葡聚糖內(nèi)切酶的表達(dá)水平提高2.5倍[22]。CRISPR-AID與高通量篩選相結(jié)合，將大大推動未來代謝工程發(fā)展。

2 提高人工代謝路徑與底盤細(xì)胞的適配性

在構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠時，通常需要引入人工代謝路徑用于目標(biāo)化學(xué)品的合成，人工代謝路徑與細(xì)胞內(nèi)源代謝路徑之間的交互作用，以及人工代謝路徑造成的代謝流擾動，降低了人工代謝路徑與底盤細(xì)胞的適配性。為了提高人工代謝路徑與底盤細(xì)胞的適配性，研究人員開發(fā)了區(qū)間工程[29]策略，解除了人工代謝路徑與底盤細(xì)胞內(nèi)源代謝路徑的交互作用；發(fā)展了生物傳感器技術(shù)[30-31]、輔因子工程[32]、菌落工程[33]、反向代謝工程[34]、基因組規(guī)模網(wǎng)絡(luò)模型[35]和進(jìn)化工程[36]等策略，強(qiáng)化了人工代謝路徑與底盤細(xì)胞整體代謝網(wǎng)絡(luò)的適配性。

2.1 解除人工代謝路徑與底盤細(xì)胞內(nèi)源代謝路徑的交互作用

區(qū)間工程可以將細(xì)胞質(zhì)中的代謝路徑在具膜細(xì)胞器中進(jìn)行重構(gòu)，不僅降低了人工代謝路徑與胞內(nèi)內(nèi)源代謝路徑的交互影響，而且縮短了底物與酶分子的空間距離提高了中間代謝物的傳輸效率[12,37]。具膜細(xì)胞器，例如線粒體[13]、過氧化物酶體[38,39]、葉綠體[40]、液泡[41]和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[42]等都已用于區(qū)間工程，提高了微生物細(xì)胞工廠的生產(chǎn)性能。例如，將異丁醇的代謝合成途徑在釀酒酵母的線粒體中進(jìn)行重構(gòu)[13]，使異丁醇的產(chǎn)量增加了260%，而相同的代謝路徑酶在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，使異丁醇的產(chǎn)量僅增加10%[圖3(a)]。此外，為了平衡線粒體和細(xì)胞質(zhì)中的代謝流分布，研究人員還開發(fā)了雙代謝工程策略，平衡細(xì)胞質(zhì)和線粒體的代謝流分布，充分改善乙酰輔酶A 供應(yīng)，使異戊二烯的產(chǎn)量增加到2527mg/L[43]。令人遺憾的是，原核微生物不存在這些具膜細(xì)胞器[44]，限制了區(qū)間工程的應(yīng)用。

圖3 解除人工代謝路徑與底盤細(xì)胞內(nèi)源代謝路徑的交互作用的策略

為了克服這些障礙，可以將代謝路徑定位到周質(zhì)空間來改善目標(biāo)化學(xué)品的生產(chǎn)。周質(zhì)空間是革蘭氏陰性菌外膜與細(xì)胞膜之間的狹窄空間，呈膠狀。越來越多的研究表明，原核生物的周質(zhì)空間也可以用于擴(kuò)展微生物細(xì)胞工廠的底物譜[45-46]、存儲目標(biāo)化學(xué)品[47-48]和降低副產(chǎn)物積累[49]。例如，Shin 等[46]通過在大腸桿菌的周質(zhì)空間中表達(dá)蔗糖纖維糊精酶，使大腸桿菌直接利用纖維糊精作為底物合成2,3-丁二醇；Jeschek等[47]在周質(zhì)空間中將鏈霉親和素蛋白支架引入到有機(jī)金屬催化劑中，制備了biot-Ru-SAV 人工金屬酶，biot-Ru-SAV 可以在周質(zhì)空間中催化碳碳雙鍵的形成和再分配；本文作者課題組通過將蘋果酸合成路徑中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PCK）和蘋果酸脫氫酶（MDH）在周質(zhì)空間中進(jìn)行重構(gòu)[50]，使蘋果酸的產(chǎn)量增加3.29倍，達(dá)到193mmol/L[圖3(b)]。此外，通過調(diào)節(jié)信號肽可以調(diào)節(jié)順反異構(gòu)酶在周質(zhì)空間中的表達(dá)，從而改造細(xì)胞膜上反式不飽和脂肪酸的含量，增加了大腸桿菌細(xì)胞的耐受性[51]。

2.2 強(qiáng)化人工代謝路徑與底盤細(xì)胞整體代謝網(wǎng)絡(luò)的適配性

2.2.1 生物傳感器技術(shù)

圖4 強(qiáng)化代謝路徑與底盤微生物整體代謝網(wǎng)絡(luò)適配性的策略

生物傳感器是指能夠感知物理信號（溫度、光、磁）、化學(xué)信號（pH、溶氧）與生物信號（小分子代謝物）的生物學(xué)元件[52-53]。在微生物細(xì)胞工廠的生產(chǎn)過程中，物理信號和化學(xué)信號是重要發(fā)酵參數(shù)，可以用于激活或者抑制各種轉(zhuǎn)錄因子，用于調(diào)控基因表達(dá)，平衡代謝流，增加了人工代謝路徑與底盤細(xì)胞整體代謝網(wǎng)絡(luò)的適配性[圖4(a)]。由于光信號可以瞬時移除，精確控制蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，光信號已經(jīng)用于生物傳感器的構(gòu)建。研究人員利用光敏感蛋白構(gòu)建一個光驅(qū)動的動態(tài)調(diào)控開關(guān)OptoExp，成功應(yīng)用于異丁醇的生產(chǎn)，通過優(yōu)化光脈沖周期，不僅改善了釀酒酵母的細(xì)胞生長，而且使異丁醇的產(chǎn)量提高了四倍[54]。微生物生長狀態(tài)也可以作為信號，例如，響應(yīng)細(xì)胞密度的群體感應(yīng)開關(guān)，可以在細(xì)胞生長到一定階段開啟或者關(guān)閉靶基因的表達(dá)，從而解偶聯(lián)細(xì)胞生長與產(chǎn)物合成，解除細(xì)胞生長與產(chǎn)物合成之間的代謝流競爭，從而優(yōu)化整體生產(chǎn)效率[55]。例如，研究人員利用群體感應(yīng)系統(tǒng)，調(diào)控莽草酸生產(chǎn)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)莽草酸激酶Ⅰ，使工程菌可以在基本培養(yǎng)基上生長，將莽草酸的產(chǎn)量增加到105mg/L，而對照菌株不生長[55]。但是，這種群體感應(yīng)控制模式對于控制靶點(diǎn)的穩(wěn)定性不高，因此可能需要與其他動態(tài)調(diào)控方法相結(jié)合，以便達(dá)到更為有效的調(diào)控效果[56]。為了解決個難題，Doong 等[56]開發(fā)了分層動態(tài)調(diào)控技術(shù)，他們將群體感應(yīng)開關(guān)與肌醇響應(yīng)的動態(tài)開關(guān)相結(jié)合，即產(chǎn)物合成途徑不僅受細(xì)胞密度控制，也受胞內(nèi)肌醇含量控制，從而實(shí)現(xiàn)更加穩(wěn)定的動態(tài)控制，并將該分層調(diào)控策略應(yīng)用于葡萄糖二酸生產(chǎn)，使葡萄糖二酸的產(chǎn)量增加到1.98g/L。不過該研究仍然存在一個明顯的缺陷，即肌醇感應(yīng)的動態(tài)開關(guān)是路徑依賴型，只適用于個別產(chǎn)品的生產(chǎn)，普適性非常有限。為了解除路徑依賴，Gao等[57]通過組合生長/穩(wěn)定期依賴性啟動子與蛋白降解決定子，發(fā)展了非路徑依賴型的動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)。該動態(tài)調(diào)節(jié)調(diào)控系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)酯水解酶應(yīng)用于木糖酸生產(chǎn)，解決了雙酶級聯(lián)生產(chǎn)木糖酸中細(xì)胞死亡的問題，使木糖酸的產(chǎn)量達(dá)199.44g/L[57]。

2.2.2 輔因子工程

輔因子可以提供氧化還原電子載體與生物合成的碳骨架，是化學(xué)品合成和細(xì)胞生長的基礎(chǔ)[32,58]。使微生物細(xì)胞工廠保持最大的碳通量用于目標(biāo)化學(xué)品的合成而沒有輔因子波動，對滿足工業(yè)生產(chǎn)至關(guān)重要。為了維持輔因子平衡，人們開發(fā)了修飾輔因子特異性與輔因子再生[59-60]的輔因子工程策略[圖4(b)]。例如，通過修飾輔因子特異性可以有效提高脂類化合物的得率[61]，該研究中，在解脂耶氏酵母中，將依賴NAD+的甘油醛-3-磷酸脫氫酶，替換為依賴NADP+的甘油醛-3-磷酸脫氫酶，使脂類化合物的得率提高了20%[61]。另一方面，基于輔因子再生系統(tǒng)可以顯著強(qiáng)化輔因子的供給，提高人工代謝路徑效率。輔因子再生可以有效增加莽草酸的生產(chǎn)[62]。在該案例中，研究人員將磷化銦納米材料與釀酒酵母相結(jié)合，構(gòu)建了生物雜合系統(tǒng)，在光照條件下使NADPH/NADP+的比例增加到87.1，為使3-脫氫莽草酸還原為莽草酸提供充足的輔因子，使莽草酸的純度達(dá)到90%[62]。

2.2.3 基因組規(guī)模網(wǎng)絡(luò)模型

基因組規(guī)模網(wǎng)絡(luò)模型提供一種通過評估理想條件與實(shí)際條件之間的差異[63]，以精確確定代謝瓶頸的方法，為精細(xì)調(diào)控代謝合成路徑，提高代謝合成路徑與微生物細(xì)胞的適配性，改善工業(yè)化學(xué)品的生產(chǎn)提供了希望[圖4(c)]。例如，借助大腸桿菌酶約束模型ec_i ML1515，可以預(yù)測微生物細(xì)胞的代謝狀態(tài)，模擬不同環(huán)境條件與基因工程改造后的輸出結(jié)果，篩選出過量合成賴氨酸的關(guān)鍵靶點(diǎn)，使賴氨酸的最終產(chǎn)量提高到193.6g/L[64]。此外，基因組規(guī)模網(wǎng)絡(luò)模型還可以用來評價細(xì)胞工廠的生產(chǎn)性能，例如，研究人員構(gòu)建了由1316 個代謝反應(yīng)和1270個代謝物組成的Rhodococcus opacus PD630 的基因組代謝網(wǎng)絡(luò)模型，通過比較實(shí)際產(chǎn)率與理論產(chǎn)率，發(fā)現(xiàn)三酰甘油、脂肪酸、脂肪酸乙酯和長鏈碳?xì)浠衔锏膶?shí)際最高產(chǎn)率分別為理論最高產(chǎn)率的93.8%、80.4%、31.8%和10.3%[65]。

2.2.4 菌落工程

許多結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然產(chǎn)物具有重要的藥用價值，一方面由于原核微生物難以有效表達(dá)來源于真核生物可催化合成天然產(chǎn)物的路徑酶，另一方面，改造酵母菌高效生產(chǎn)異戊二烯類化合物也非常困難[33]。為了合成天然產(chǎn)物，利用多菌種組成的微生物菌落，可以對復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分工協(xié)作[33]。例如，Zhou等[66]將紫杉醇前體的合成路徑劃分為兩個模塊，分別在釀酒酵母和大腸桿菌中構(gòu)建，利用大腸桿菌和釀酒酵母構(gòu)建的微生物群落，可以有效生產(chǎn)紫杉烷類化合物和異戊二烯類化合物[圖4(d)]。Kong等[67]通過模塊化代謝途徑重構(gòu)與模型預(yù)測相結(jié)合的方式，利用基因動態(tài)調(diào)控回路，創(chuàng)建了六個具有獨(dú)特相互作用模式的微生物菌落，包括共棲、偏害共生、中立、合作、競爭和捕食。在此基礎(chǔ)上，研究人員利用雙菌組成的模型，設(shè)計(jì)了三菌和四菌組成的微生物群落，增加了人們對微生物群落空間動力學(xué)的了解，可以用于指導(dǎo)人工合成微生物菌落的發(fā)展[67]。

2.2.5 進(jìn)化工程

進(jìn)化工程是指微生物種群在一定選擇壓力條件下不斷進(jìn)化，獲得有益突變的方法[圖4(e)][68]。進(jìn)化工程可以用于改善微生物細(xì)胞生長[68]，提高化學(xué)品的濃度、得率和生產(chǎn)強(qiáng)度[36]，發(fā)現(xiàn)未知的生物調(diào)控機(jī)制[69]。例如，在利用還原甘氨酸途徑改造大腸桿菌，一碳化合物生長的過程中，發(fā)現(xiàn)由于還原甘氨酸途徑與大腸桿菌適配性差，以及一碳化合物的生物毒性，降低了微生物細(xì)胞的生長速率與代謝速率。為了改善微生物細(xì)胞的生長，研究人員通過進(jìn)化工程，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)的微調(diào)，改善了微生物細(xì)胞的生長，使工程菌的對數(shù)期從65～80h 縮短到10h[68]。進(jìn)化工程也可以提高工程菌對3-羥基丁酮的耐受性，從而提高3-羥基丁酮的產(chǎn)量。在該研究中，研究人員開發(fā)了一種基于分層動態(tài)調(diào)控“高保真模塊”與“高突變模塊”的自主進(jìn)化突變系統(tǒng)，并結(jié)合進(jìn)化工程方法，獲得了高產(chǎn)3-羥基丁酮的耐受型突變株HS019，在30L 發(fā)酵罐中將3-羥基丁酮的產(chǎn)量提高到82.5g/L[36]。此外，進(jìn)化工程成功解除了由于基因組減少對大腸桿菌生長的影響，并發(fā)現(xiàn)了新的生物調(diào)控機(jī)制[69]，在Escherichia coli MG1655 基因組中刪除了110 萬個堿基對，構(gòu)建了基因組減少的工程菌MS56。在含有葡萄糖的基本培養(yǎng)基中，工程菌MS56的生長速率遠(yuǎn)小于野生型菌株。為了恢復(fù)細(xì)胞生長，將工程菌MS56在基本培養(yǎng)基中進(jìn)行了807 代的進(jìn)化，分離出與野生型菌株生長速率相當(dāng)?shù)木阤MS57。多組學(xué)分析結(jié)果表明，進(jìn)化后的菌株eMS57 重塑了轉(zhuǎn)錄和翻譯譜。

2.2.6 反向代謝工程

反向代謝工程的核心是“表型-基因型-表型”。反向代謝工程可以直接從已有的表型為出發(fā)點(diǎn)，并借助各種分析方法，分析差異表型所涉及的基因型，獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)基因或代謝途徑，然后將這些信息運(yùn)用到新菌株的遺傳改造，從而獲得期望表型[34,70]。在鏈霉菌生產(chǎn)聚酮類次級代謝產(chǎn)物的過程中，其產(chǎn)物合成所需要的胞內(nèi)代謝物來源一直是難以確定，而且也不了解鏈霉菌在穩(wěn)定期如何特異性地將代謝通量轉(zhuǎn)換到次級代謝產(chǎn)物的合成[70]。為了解析鏈霉菌合成聚酮類次級代謝產(chǎn)物的代謝機(jī)理，研究人員通過多組學(xué)的方法，揭示了胞內(nèi)三酰甘油是聚酮化合物合成所需要的關(guān)鍵胞內(nèi)代謝物，證明了調(diào)控胞內(nèi)三酰甘油可以提高聚酮化合物的產(chǎn)量。在此基礎(chǔ)上，研究人員設(shè)計(jì)了三酰甘油動態(tài)調(diào)控策略，有效提高了阿維菌素B1a、杰多霉素B30 和土霉素的產(chǎn)量[70]。此外，利用反向代謝工程也可以解析進(jìn)化工程獲得的理想表型，例如，研究人員通過進(jìn)化工程獲得耐受C8脂肪酸的進(jìn)化菌株，通過比較進(jìn)化菌株與親本菌株的基因組序列，發(fā)現(xiàn)進(jìn)化菌株有7個編碼序列發(fā)生了突變，在親本菌株中敲除OSH2（氧甾醇結(jié)合蛋白）和PDR1（調(diào)控多重耐藥基因的轉(zhuǎn)錄因子）獲得與進(jìn)化菌株ZWE03 相近的C8脂肪酸耐受性[圖4(e)][71]。

3 結(jié)語

通過采用自然或人工合成的代謝路徑定制微生物細(xì)胞工廠，為高價值化學(xué)品的生物合成提供了一種經(jīng)濟(jì)可行的方案[3-7]，其中提高人工代謝合成路徑之間以及人工代謝路徑與底盤微生物之間的適配性，成為提高微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)性能的關(guān)鍵。為了提高微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)性能，研究人員提出了強(qiáng)化與平衡人工代謝路徑的代謝通量以及解除人工代謝路徑與底盤細(xì)胞內(nèi)源代謝路徑的交互作用，強(qiáng)化人工代謝路徑與底盤細(xì)胞整體代謝網(wǎng)絡(luò)的適配性。然而，由于微生物細(xì)胞代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性以及代謝產(chǎn)物對微生物細(xì)胞的影響，現(xiàn)有的調(diào)控策略不能有效地提高微生物細(xì)胞工廠的適配性，從而影響目標(biāo)化學(xué)品地合成。因此，一方面，基于微生物細(xì)胞代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，開發(fā)高效的多重適配性調(diào)控技術(shù)，在細(xì)胞水平上重置代謝路徑的適配性。另一方面，根據(jù)代謝產(chǎn)物對微生物細(xì)胞的影響，有針對性地提高微生物細(xì)胞對代謝產(chǎn)物的耐受性，從而增強(qiáng)微生物細(xì)胞工廠對代謝產(chǎn)物的適配性。