趙婧，王盼，劉彥楠，傅榮湛，段志廣，范代娣

（1 西北大學(xué)化工學(xué)院陜西省可降解生物醫(yī)用材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安710069；2 西北大學(xué)化工學(xué)院陜西省生物材料與發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，陜西西安710069；3 西北大學(xué)生物醫(yī)藥研究院，陜西西安710069）

人參是我國傳統(tǒng)中藥，其用途及功效，如調(diào)節(jié)血壓、促進(jìn)新陳代謝、增強(qiáng)免疫力等早有記載。目前發(fā)現(xiàn)的人參屬植物有近十種，其中最為常見的三種是人參、三七和西洋參，這三種人參作為藥品和功能食品具有巨大的市場潛力[1]。2019年全球人參市場規(guī)模達(dá)到6.229億美元，預(yù)計2019—2027年間將保持4.8%的復(fù)合年增長率（CAGR）[2]。近年來，人參皂苷的抗癌活性日益受到關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷的次級代謝產(chǎn)物“稀有人參皂苷”具有更強(qiáng)的抗腫瘤活性。基于稀有人參皂苷Rg3的參一膠囊和基于Rh2的今幸膠囊已由國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市，而稀有人參皂苷CK、Rd等藥物也進(jìn)入了臨床實(shí)驗(yàn)階段[3]。然而這些稀有人參皂苷在總皂苷中的含量極低，通過化學(xué)和生物方法將常見人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷，能夠顯著提高人參皂苷生物利用度，為人參皂苷類藥物的規(guī)模生產(chǎn)提供方法。與化學(xué)方法相比，微生物、酶法具有選擇性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少、后處理簡單等優(yōu)勢，在人參皂苷轉(zhuǎn)化方面具有較強(qiáng)的應(yīng)用前景。為此，本文總結(jié)了近年來微生物、酶法轉(zhuǎn)化人參皂苷的最新進(jìn)展，著重強(qiáng)調(diào)了食品工業(yè)中益生菌、食藥用真菌在人參皂苷發(fā)酵中的應(yīng)用及協(xié)同增效作用，微生物糖苷酶的篩選及組合在總皂苷轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，以及溶劑工程、固定化酶等技術(shù)在提升人參皂苷轉(zhuǎn)化效率中的應(yīng)用，為提高稀有人參皂苷純度、降低生產(chǎn)成本、實(shí)現(xiàn)稀有人參皂苷量產(chǎn)提供基礎(chǔ)。

1 人參皂苷的結(jié)構(gòu)及功效

人參中的生物活性成分包括皂苷、多糖和酚類，其中人參皂苷因具有抗癌、抗炎、降血糖等多種功效而日益受到關(guān)注；對其構(gòu)效關(guān)系、藥效及藥代動力學(xué)性質(zhì)等方面的研究也逐漸深入。結(jié)構(gòu)方面，人參皂苷由甾體骨架和在其C3、C6和C20位上連接的糖基組成，根據(jù)甾體骨架的不同可以將人參皂苷分為三大類，即達(dá)瑪烷型、齊墩果型和奧克梯隆醇型，其中絕大多數(shù)人參皂苷屬于達(dá)瑪烷型[4]。根據(jù)糖基位置的不同，又可以將達(dá)瑪烷型人參皂苷分為原人參二醇（PPD）和原人參三醇（PPT）型。PPD 型人參皂苷的糖基位于達(dá)瑪烷的C3和C20位，而PPT型人參皂苷的糖基位于C6和C20位[5]。根據(jù)達(dá)瑪烷C20手性碳取代位置的不同，人參皂苷又可進(jìn)一步分為20S型和20R型[6]。

人參、三七和西洋參均有自己獨(dú)特的人參皂苷圖譜，其與人參的生理功能息息相關(guān)，中醫(yī)認(rèn)為人參為溫性，而西洋參則為涼性。人參中最為主要的皂苷類型為Rb1、Rg1 和Rd,西洋參中的主要皂苷類型為Rb1、Re 和Rd，而三七最為主要的皂苷類型則為Rb1、Rg1、Ra 和R1[7]。除常見人參皂苷外，人參中還存在多種稀有人參皂苷，其中一些稀有人參皂苷具有比常見人參皂苷更強(qiáng)的藥效和更理想的藥代動力學(xué)性質(zhì)。研究顯示，稀有人參皂苷Rg3和Rh2具有調(diào)節(jié)疲勞、舒張血管、提高免疫力及抗腫瘤等功效，目前作為抗腫瘤藥物已在我國獲批上市[3]。稀有人參皂苷CK 也展現(xiàn)出優(yōu)于常見人參皂苷的抗腫瘤、抗炎保肝、降血糖等功效，目前作為治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段（clinicaltrials.gov）。

為了進(jìn)一步明確稀有人參皂苷單體在不同疾病中發(fā)揮的作用，本文作者課題組針對不同癌癥、糖尿病、皮膚免疫疾病、肥胖、抑郁、失眠等疾病篩選稀有人參皂苷，并探究其背后的分子生物學(xué)機(jī)制。除了目前研究較為廣泛的Rg3、Rh2 和CK 以外，研究發(fā)現(xiàn)稀有人參皂苷Rk1[8-9]、Rk3[10-12]、Rh4[13-15]、Rg5[16-19]等也對相關(guān)疾病具有很好的治療效果。Deng 等[14]研究發(fā)現(xiàn)Rh4 具有比CK、Rg3 和Rh2更好的食管癌細(xì)胞體外抑制效果，其抑瘤率與一線化療藥順鉑無顯著性差異，但對裸鼠體重、免疫系統(tǒng)以及肝腎功能等均無明顯影響，機(jī)理研究顯示，人參皂苷Rh4 通過靶向作用于AKT 信號通路來抑制食管癌糖酵解，從而抑制食管癌生長。以自發(fā)性糖尿病db/db 小鼠為模型，本文作者課題組Deng 等研究發(fā)現(xiàn)，稀有人參皂苷Rg5 降糖效果優(yōu)于商用藥物二甲雙胍，并對損傷胰島細(xì)胞具有修復(fù)作用，通過抑制ROS介導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激的發(fā)生，激活胰島素受體介導(dǎo)的IRS-1/PI3K/AKT 信號通路，調(diào)節(jié)胰島素敏感性；同時激活線粒體生物合成途徑Sirt1/PGC-1α/Mfn2的表達(dá)，改善線粒體功能障礙[20]。除了藥效更強(qiáng)之外，稀有人參皂苷的藥代動力學(xué)性質(zhì)優(yōu)于常見人參皂苷。常見人參皂苷經(jīng)腸道代謝脫糖后，其口服生物利用率和生物活性都得到了大幅提升。盡管人本身的腸道菌群可以對人參皂苷進(jìn)行轉(zhuǎn)化，但其轉(zhuǎn)化效率較低，個體差異較大，且大部分轉(zhuǎn)化發(fā)生在大腸，影響了稀有人參皂苷的吸收。

除了依賴自身腸道菌群以外，還可以通過熱水解、酸水解、堿水解、微生物及酶法實(shí)現(xiàn)人參皂苷的轉(zhuǎn)化。熱處理可以改變?nèi)藚⒃碥盏某煞?，使得常見人參皂苷Rb1、Rc、Rd、Re 和Rg1 含量降低，稀有人參皂苷Rg5、Rk1、Rk2、Rk3 等含量升高，這些新生成的人參皂苷極性較低，生物活性更強(qiáng)。市面上銷售的紅參和黑參即為經(jīng)高溫處理，皂苷部分轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物。將高溫與酸處理相結(jié)合能夠促進(jìn)氧化、水解、脫水等反應(yīng)，提高人參皂苷轉(zhuǎn)化效率。本文作者課題組通過酸轉(zhuǎn)化、柱分離方法制備了一系列稀有人參皂苷及其組合物，增加了人參皂苷的多樣性，發(fā)現(xiàn)水解、脫水后生成的新型稀有人參皂苷Rk1、Rg5、Rh4等極具生物活性，在癌癥、糖尿病、肥胖等多種復(fù)雜疾病的治療中具有較強(qiáng)的潛在應(yīng)用價值[21-25]。但是，化學(xué)方法存在價格高、副產(chǎn)物多、反應(yīng)條件劇烈等問題。與化學(xué)方法相比，微生物及酶法轉(zhuǎn)化人參皂苷具有選擇性強(qiáng)、條件溫和、副產(chǎn)物少、后處理簡單等優(yōu)勢，適用于稀有人參皂苷Rg3、Rh2、CK等的轉(zhuǎn)化制備。

2 微生物法轉(zhuǎn)化人參皂苷

微生物能夠通過不同代謝途徑產(chǎn)生糖苷酶對原人參二醇類皂苷的C3和C20位、原人參三醇型皂苷的C6和C20位的糖基進(jìn)行水解，實(shí)現(xiàn)人參皂苷的定向轉(zhuǎn)化（見圖1）。微生物直接轉(zhuǎn)化法條件溫和，一般都在20～40℃，中性條件下進(jìn)行催化轉(zhuǎn)化，設(shè)備簡單，安全性高。微生物本身生長速度快，反應(yīng)量大，適應(yīng)大規(guī)模生產(chǎn)，不需對酶進(jìn)行分離提取，生產(chǎn)成本低于酶轉(zhuǎn)化法和化學(xué)轉(zhuǎn)化法。常用于轉(zhuǎn)化人參皂苷的細(xì)菌主要包括乳酸桿菌（Lactobacillus）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）、芽孢桿菌（Bacillus）屬等，這些細(xì)菌包含去糖基化所需的多種糖苷酶，可以通過全細(xì)胞或細(xì)胞裂解液將常見人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷。其中益生菌（probiotics）被廣泛應(yīng)用于食品級人參皂苷的轉(zhuǎn)化，以提高產(chǎn)品的安全性及患者接受度[26]。 多種乳酸桿菌如Lactobacillus rhamnosus GG、 Lactobacillus paralimentarius LH4、Lactobacillus paracasei subsp.tolerans MJM60396等均可實(shí)現(xiàn)人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化（見表1）。Jung 等研究發(fā)現(xiàn)，利用乳酸桿菌Lactobacillus plantarum KCCM 11613P 對紅參提取物進(jìn)行發(fā)酵，能夠?qū)⑷藚⒃碥誖b2 和Rb3 轉(zhuǎn)化為Rd，增強(qiáng)紅參的抗氧化作用[27]。多家生物藥企和食品集團(tuán)申請了益生菌轉(zhuǎn)化人參皂苷的專利，并依賴益生菌本身的功能性及其對人參皂苷的轉(zhuǎn)化作用，開發(fā)出多款功能食品。盡管乳酸桿菌Lactobacillus pentosus DC101 及Lactobacillus paralimentarius LH4 發(fā)酵可以實(shí)現(xiàn)Rb1→CK 的 轉(zhuǎn) 化[28]， 乳 酸 桿 菌 Lactobacillus paracasei subsp.tolerans MJM60396 發(fā)酵可以將人參皂苷Rb1 轉(zhuǎn)化為Rg3 和Rh2[29]，但是多數(shù)情況下益生菌發(fā)酵人參皂苷Rb1、Rb2 和Rc 的產(chǎn)物以Rd 為主，產(chǎn)物中功能性更強(qiáng)的人參皂苷Rg3、Rg2和CK含量較少。此外，益生菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化人參皂苷底物濃度低，轉(zhuǎn)化時間長，轉(zhuǎn)化率低。研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化MRS 培養(yǎng)基能夠提高人參皂苷的轉(zhuǎn)化效率。Ku等[30-31]證明在無糖MRS 培養(yǎng)基中添加20g/L 的纖維二糖可以使β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)量提高25 倍，有利于提高Rb1→Rd 的轉(zhuǎn)化效率，而在MRS 培養(yǎng)基中添加20g/L抗壞血酸則可提高α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-L-阿拉伯吡喃糖苷酶的活性，有助于將Rb2 和Rc 轉(zhuǎn)化為Rd。Li 等[32]通過基因工程方法分別將來源于芽孢桿菌Paenibacillus mucilaginosus 和約氏黃桿菌Flavobacterium johnsoniae 的β-葡萄糖苷酶基因BglPm和BglBX10轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌中，通過單一細(xì)菌發(fā)酵及兩種細(xì)菌順序發(fā)酵實(shí)現(xiàn)了Rb1→Rd→Rg3 及Rb1→Rd→F2→CK 的生物轉(zhuǎn)化，提高了轉(zhuǎn)化效率并將轉(zhuǎn)化時間縮短到了24h。

圖1 常見人參皂苷定向生物轉(zhuǎn)化示意圖

除了腸道益生菌，食藥用真菌、食品級微生物、土壤微生物、植物內(nèi)生菌等也被應(yīng)用于人參皂苷的定向轉(zhuǎn)化（見表1）。隋新課題組[33]對長白山地區(qū)的野生蟲草屬真菌進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)藥用真菌Cordyceps sinensis 和Ascomycota sp. 能 夠 通 過Rb1→Rd→Rg3和Rb1→Rd→F2→CK路徑將常見人參皂苷Rb1 轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷Rg3 和CK。馬子君等[34]發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草蝙蝠蛾擬青霉能將人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為Rd，與此同時人參中的糖類、氨基酸、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和微量元素等也為蝙蝠蛾擬青霉的菌絲體生長提供C 源、N 源和生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)蟲草功效成分腺苷、蟲草素和甘露醇的合成，起到了協(xié)同增效作用。趙余慶課題組[35]通過甘蔗鐮孢Fusarium sacchari 將人參莖葉中的Rb1 和Rb3 轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷CK、C-Mx 和C-Mc，轉(zhuǎn)化結(jié)束后，CK 占到產(chǎn)物的82.2%，但轉(zhuǎn)化時間較長，超過80h。黑曲霉Aspergillus niger 是工業(yè)發(fā)酵常用菌種，其繁殖能力較強(qiáng)，自身生長代謝旺盛，發(fā)酵周期短，能夠產(chǎn)生淀粉酶、果膠酶、葡萄糖苷酶等多種酶系，且不會產(chǎn)生毒素，是美國食藥監(jiān)局（FDA）認(rèn)證的安全菌種（GRAS）。黑曲霉是人參內(nèi)生菌，也存在于三七土壤中，Liu 等[36]發(fā)現(xiàn)黑曲霉能將人參果漿中的原人參二醇型皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rd轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷CK。吳秀麗等[37]從長白山人參根際土壤中分離出68 種真菌，發(fā)現(xiàn)其中黑曲霉具有最強(qiáng)的轉(zhuǎn)化活性，能夠?qū)⑷藚⒃碥誖e轉(zhuǎn)化為Rg1、Rg2 和Rh1；而同樣獲得GRAS 認(rèn)證的米曲霉Aspergillus oryzae 則能夠?qū)⒃藚⑷夹驮碥誖e轉(zhuǎn)化為Rh1[38]。其他食品級微生物如米酒中分離出的釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae HJ-014，能夠發(fā)酵紅參乙醇提取物，將常見人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷[39]。此外，酒曲中多種微生物也具有人參皂苷轉(zhuǎn)化能力， 其中纖維微細(xì)菌屬Cellulosimicrobium 具有最強(qiáng)的人參皂苷轉(zhuǎn)化活性，Zuo 等[40]發(fā)現(xiàn)Cellulosimicrobium aquatile Lyp51 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶能夠?qū)⑷藚⒃碥誖c 轉(zhuǎn)化為Rd，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)90%。植物內(nèi)生菌和人參栽培土壤菌也是皂苷轉(zhuǎn)化微生物的重要來源。Zhou等[41-42]從野山參土壤中分離篩選出了具有高人參皂苷轉(zhuǎn)化效率的擬青霉菌Paecilomyces bainier sp. 229，通過菌種誘變和發(fā)酵工藝優(yōu)化，提高了人參皂苷轉(zhuǎn)化效率，并將發(fā)酵體積擴(kuò)大至6L。Fu等[43-44]分別從多種人參內(nèi)生細(xì)菌及內(nèi)生真菌中篩選出GE17-7和GE17-18，GE17-7 能夠在15h 內(nèi)將98%的Rb1（1mg/mL）轉(zhuǎn)化為Rg3,而GE17-18則能將Rb1轉(zhuǎn)化為CK。

表1 微生物法轉(zhuǎn)化人參皂苷

3 酶法轉(zhuǎn)化人參皂苷

3.1 酶的篩選及聯(lián)合

酶法轉(zhuǎn)化人參皂苷選擇性強(qiáng)、催化效率高、催化過程清晰，能夠通過重組酶、酶結(jié)構(gòu)修飾及代謝工程等手段提高底物濃度及酶的催化效率，從而縮短處理時間及生產(chǎn)成本，成為了近年來的研究熱點(diǎn)。稀有人參皂苷和常見人參皂苷之間相差1～3個糖基分子，因此人參皂苷轉(zhuǎn)化一般通過糖苷酶水解實(shí)現(xiàn)（見圖1）。糖苷酶的選擇很大程度上取決于原料及產(chǎn)物的糖基類型，主要包括葡萄糖、L-阿拉伯吡喃糖、L-阿拉伯呋喃糖、D-木糖、L-鼠李糖等。廣泛分布于微生物中的糖苷酶如β-糖苷酶、纖維素酶、乳糖酶、果膠酶、橙皮苷酶、柚皮酶等具有廣泛的底物特異性，可同時水解多種人參皂苷[5]（見表2）。因此，從不同微生物中篩選能夠選擇性轉(zhuǎn)化多種常見人參皂苷的糖苷酶是提高人參總皂苷利用率、降低成本的有效方法。為此Deok-Kun Oh課題組[45-47]以大腸桿菌為底盤細(xì)胞，通過導(dǎo)入嗜熱微生物β-糖苷酶基因，致力于將多種常見人參皂苷同時轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷CK。通過對多種微生物中的β-糖苷酶進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)來源于Caldicellulosiruptor bescii 的β-糖苷酶能夠同時水解人參皂苷C20位的D-葡萄糖、L-阿拉伯呋喃糖和L-阿拉伯吡喃糖，實(shí)現(xiàn)常見原人參二醇型皂苷Rb1、Rb2 和Rc 向稀有人參皂苷CK 的集體轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)化效率和產(chǎn)率均高于Microbacterium esteraromaticum、 Paecilomyces bainer、 Sulfolobus acidocaldarius、 Sulfolobus solfataricus、 Aspergillus niger等微生物中的糖苷酶[48]。Kim Myung-Kon 課題組[49-51]從食用菌中篩選出能夠分別將Rb1、Rb2、Rc轉(zhuǎn)化為CK的蜜環(huán)菌Armillaria mellea糖苷酶，反應(yīng)條件為45～55℃、72～96h、pH 4.0～4.5。由于蜜環(huán)菌本身是一種功能食品，具有神經(jīng)保護(hù)作用，能夠治療麻痹、頭痛、高血壓、失眠、眩暈和神經(jīng)衰弱等癥狀，因此利用蜜環(huán)菌糖苷酶轉(zhuǎn)化人參皂苷有望實(shí)現(xiàn)協(xié)同增效作用。但目前文獻(xiàn)中未對轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率進(jìn)行評估，產(chǎn)物中除了CK 以外還包括較為大量的C-Mc 和CY，副產(chǎn)物的出現(xiàn)會對CK 的功效產(chǎn)生怎樣的影響目前還尚不明確。

表2 酶法轉(zhuǎn)化人參皂苷

通過篩選獲得的微生物糖苷酶可以實(shí)現(xiàn)多種人參皂苷的同時轉(zhuǎn)化，但是由于反應(yīng)中涉及不同種類糖苷鍵的水解，往往難以找到一種糖苷酶對各種常見人參皂苷均具有高選擇性和高轉(zhuǎn)化效率。因此研究者們通過將不同糖苷酶進(jìn)行組合，從而提高人參總皂苷的轉(zhuǎn)化效率和產(chǎn)率（見表2）。由于高溫反應(yīng)體系能夠提高底物溶解度、防止細(xì)菌污染，近年來嗜熱菌糖苷酶因其高轉(zhuǎn)化效率及熱穩(wěn)定性常被用于構(gòu)建復(fù)合酶體系。Kim 等[52]在大腸桿菌E. Coli ER2566 中表達(dá)硫礦硫化葉菌Sulfolobus solfataricus β-糖苷酶和嗜巖熱菌Thermotoga petrophila α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，將兩種酶相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了人參皂苷Rb1、Rb2和Re的同時高效轉(zhuǎn)化。嗜巖熱菌糖苷酶的引入可以實(shí)現(xiàn)Re 向CK 的高效轉(zhuǎn)化，從而將人參提取物、紅參提取物及人參葉提取物向CK 的轉(zhuǎn)化率提高到100%，并將產(chǎn)率分別提升至276mg/(L·h)、 196mg/(L·h) 以 及420mg/(L·h)。Zhang 等[53]利用重組蛋白技術(shù)在大腸桿菌中表達(dá)三種耐高溫糖苷酶，這三種酶包括能夠?qū)b1和Rb2轉(zhuǎn)化為Rd 的Thermotoga petrophlia β-葡萄糖苷酶Tpebgl1， 能 夠 將Rc 轉(zhuǎn) 化 為Rd 的Thermotoga thermarum DSM5069 α-1,6-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，以及能將Rd 轉(zhuǎn)化為20(S) -Rg3 的Thermotoga petrophlia β-葡萄糖苷酶，通過這三種酶的協(xié)同轉(zhuǎn)化，能夠在3h 內(nèi)、90℃、pH 5.0 條件下將10g/L PPD 型總皂苷轉(zhuǎn)化為3.93g/L 20(S)-Rg3，轉(zhuǎn)化率高達(dá)98.19%，產(chǎn)率達(dá)到1.31g/(L·h)。此方法轉(zhuǎn)化效率高、產(chǎn)量大，具有規(guī)?；a(chǎn)潛力。

3.2 溶劑工程

除了微生物篩選以外，溶劑工程也是提高糖苷酶催化轉(zhuǎn)化效率，實(shí)現(xiàn)人參皂苷量產(chǎn)的重要手段。影響糖苷酶催化效率的因素包括酶的降解、酶的低選擇性、底物抑制、產(chǎn)物抑制等。人參皂苷在水中的溶解度與其糖基數(shù)量相關(guān)，大多數(shù)人參皂苷在含水正丁醇中溶解度較大；次級人參皂苷由于糖基數(shù)目減少、極性減小，在水中溶解度較低，苷元則難溶于水。在緩沖液中添加如二甲基亞砜、甲醇等有機(jī)溶劑作為助溶劑能夠提高底物濃度和酶促反應(yīng)速率[49,54]，但這類有機(jī)溶劑生物毒性較大，揮發(fā)性強(qiáng)，且易使酶失活。由特定有機(jī)陽離子與無機(jī)或有機(jī)陰離子構(gòu)成的離子液體（ionic liquid，IL）具有飽和蒸氣壓低、不可燃、兩親性、可設(shè)計等特性，且相較于有機(jī)溶劑具有更低的生物毒性和更好的酶相容性，被廣泛應(yīng)用于脂肪酶、酯酶、蛋白酶等水解酶催化反應(yīng)[3,55]?；诤憠A鹽和酰胺、醇和糖等三類氫鍵供體的低共熔溶劑（deep eutectic solvent，DES）是一種生物可降解溶劑，具有比傳統(tǒng)離子液體更低的成本和更高的生物相容性，還具備抗菌性能，是一種新型綠色溶劑[56-57]。DES 的引入提高了β-葡萄糖苷酶活性以及原料/產(chǎn)物的溶解性，從而提高了催化轉(zhuǎn)化效率和產(chǎn)率[58]。本文作者課題組Han等[59]首次將DES應(yīng)用于人參皂苷的催化轉(zhuǎn)化中，與批次進(jìn)料相結(jié)合，在底物濃度為12mmol/L的條件下將黑曲霉糖苷酶催化轉(zhuǎn)化Rb1→CK 的轉(zhuǎn)化效率提高至91.3%，產(chǎn)率提升至142mg/(L·h)。研究發(fā)現(xiàn)，在乙酸緩沖液體系中，當(dāng)?shù)孜餄舛雀哂?mmol/L 時轉(zhuǎn)化效率開始下降，當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到8mmol/L 時，轉(zhuǎn)化效率降低至74.5%，并繼續(xù)呈下降趨勢。這種轉(zhuǎn)化效率的降低是底物抑制、中間產(chǎn)物抑制、終產(chǎn)物抑制以及體系黏度增加等多種原因造成的。通過采用DES/緩沖液體系，提升了底物及產(chǎn)物的溶解度，并利用批次進(jìn)料降低了體系的黏稠度，顯著提升了高底物濃度下的轉(zhuǎn)化效率，為工業(yè)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)稀有人參皂苷CK提供了基礎(chǔ)。此外，本文作者課題組Ma等[60]從人參根際土壤中篩選出底物耐受型植物內(nèi)生菌Talaromyces purpureogenus，研究了12 種酶和4 種有機(jī)溶劑（30%，體積分?jǐn)?shù)）對T.purpureogenus β-葡萄糖苷酶活性的影響規(guī)律，發(fā)現(xiàn)與乙酸緩沖液相比，ChCl∶EG=2∶1（30%，體積分?jǐn)?shù)）DES 緩沖液提高了β-葡萄糖苷酶與底物的親和力，同時將β-葡萄糖苷酶的半衰期延長了96%，提高了底物的溶解度和反應(yīng)速率，將CK 的產(chǎn)量提升了54%。以上研究顯示，溶劑工程方法可以有效提高糖苷酶轉(zhuǎn)化人參皂苷的轉(zhuǎn)化效率和產(chǎn)率，改善底物/產(chǎn)物抑制問題。

3.3 固定化酶

酶法轉(zhuǎn)化人參皂苷選擇性強(qiáng)，轉(zhuǎn)化效率高，反應(yīng)條件溫和，綠色環(huán)保，但是酶造價較高，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定且難以重復(fù)利用，提高了生產(chǎn)成本。酶的固定化可以提高酶的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)酶的有效回收和再利用，同時能夠?qū)崿F(xiàn)酶和產(chǎn)物的高效分離，最大程度地減少產(chǎn)品被蛋白污染。通過固定化提高酶的性能，實(shí)現(xiàn)重復(fù)利用，是提高催化劑生產(chǎn)率、降低成本的有效手段[61]。酶固定化的方法主要包括載體結(jié)合、包覆和交聯(lián)（無載體）[62]。常用載體材料包括天然生物聚合物如海藻酸鈉、殼聚糖、纖維素、瓊脂糖等，以及多孔材料如二氧化硅、金屬有機(jī)框架（metal organic framework，MOF）材料、共價有機(jī)框架（covalent organic framework，COF）材料等[61,63-64]。Cui等[65]以廣泛應(yīng)用于食品添加劑工業(yè)生產(chǎn)的谷氨酰胺棒狀桿菌Corynebacterium glutamicum ATCC1303為底盤細(xì)胞，表達(dá)具有高催化活性以及纖維素結(jié)合能力的Microbacterium testaceum ATCC 15829 β-葡萄糖苷酶(MT619)-Clostridium thermocellum 纖維素結(jié)合模塊（C3a）融合蛋白（C3a-MT619），實(shí)現(xiàn)了高蛋白濃度再生纖維素固定化，將酶濃度提高了286 倍，從而將以人參提取物為底物的CK和F1 的轉(zhuǎn)化效率分別提升至316.3mg/(L·h)和392.5mg/(L·h)[65]。從蝸牛嗉囊及消化道中提取的蝸牛酶含有纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、蛋白酶等20 多種酶，能夠選擇性地切斷人參皂苷Rb1 中的β-D-吡喃葡萄糖糖苷鍵，具有較強(qiáng)的催化活性[66]。本文作者課題組研究發(fā)現(xiàn)，在反應(yīng)中添加1.0mmol/L的鐵離子可顯著提高蝸牛酶活性，將蝸牛酶對人參皂苷的轉(zhuǎn)化效率提升至89.7%[67]。蝸牛酶造價較高，為了降低生產(chǎn)成本，于兆慧等[68]先利用多孔二氧化硅吸附固定化蝸牛酶，再利用氯化鈣與海藻酸鈉交聯(lián)制備微球，蝸牛酶在15℃環(huán)境下保存30d后，酶活回收率為55.17%，轉(zhuǎn)化時間為36h，轉(zhuǎn)化次數(shù)為5次，平均轉(zhuǎn)化率為36.79%，較游離酶有所下降。Hassan等[69]通過席夫堿鍵將蝸牛酶連接于卡拉膠（carrageenan gel）微粒表面，發(fā)現(xiàn)固定化酶連續(xù)使用10 次后仍可保持96%的初始活性，但與游離酶相比轉(zhuǎn)化效率有所下降[69]。本文作者課題組設(shè)計制備了基于四氧化三鐵納米粒子和天然生物聚合物的固定化蝸牛酶，在不顯著影響轉(zhuǎn)化效率的前提下，提高了酶穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)了蝸牛酶的多次重復(fù)使用。

4 展望

人參在傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中有著舉足輕重的地位，近年來隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，人參皂苷抗炎、抗腫瘤、降血糖機(jī)理逐漸清晰，作為藥品和功能食品具有廣闊的前景。將常見人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷是提高其生物利用率、增強(qiáng)藥效、改善藥代動力學(xué)性質(zhì)的關(guān)鍵。微生物及酶法轉(zhuǎn)化人參皂苷具有選擇性強(qiáng)、安全環(huán)保等優(yōu)勢，但仍存在微生物發(fā)酵及自身酶系對人參皂苷糖苷鍵催化效率低、催化機(jī)制不明確、生產(chǎn)成本高等問題。益生菌及食藥用真菌在轉(zhuǎn)化人參皂苷制備功能食品中顯示出巨大的潛力。篩選能夠同時轉(zhuǎn)化多種常見人參皂苷的微生物糖苷酶以及水解不同糖苷鍵的糖苷酶組合，是提高人參總皂苷利用率的有效方法。此外，基于離子液體的溶劑工程及固定化酶技術(shù)的應(yīng)用，有望進(jìn)一步提高人參皂苷的轉(zhuǎn)化效率及產(chǎn)率。

糖苷酶催化特性與其活性結(jié)構(gòu)域拓?fù)鋵W(xué)構(gòu)象包括口袋、裂隙和隧道關(guān)系密切，基于同源建模、分子對接、定點(diǎn)突變等蛋白質(zhì)工程方法研究酶催化機(jī)制，改善酶選擇性、提高酶活和穩(wěn)定性是實(shí)現(xiàn)專一、高效人參皂苷轉(zhuǎn)化的方法，也是未來的重要研究方向。除了從自然界中篩選糖苷酶，利用合成生物學(xué)方法構(gòu)建高效細(xì)胞工廠生產(chǎn)稀有人參皂苷也是未來一個重要的發(fā)展方向。以釀酒酵母、畢赤酵母為底盤細(xì)胞，構(gòu)建稀有人參皂苷的轉(zhuǎn)化、合成途徑，并通過高密度發(fā)酵提升產(chǎn)率，實(shí)現(xiàn)中試及量產(chǎn)，有可能徹底解決原料來源問題，以簡單糖類甚至其他廉價物質(zhì)為碳源，實(shí)現(xiàn)稀有人參皂苷的全合成。此外，將基因工程、溶劑工程和固定化酶技術(shù)相結(jié)合有望同時改善酶催化效率和穩(wěn)定性，提高人參皂苷轉(zhuǎn)化效率和產(chǎn)率。另外，深入研究人參皂苷的作用機(jī)制，明確其靶向信號通路，對皂苷的推廣應(yīng)用具有重要意義。隨著藥理學(xué)分子機(jī)制的不斷明晰，定向、高效生物轉(zhuǎn)化工藝的不斷升級，人參皂苷在重大復(fù)雜疾病的預(yù)防及治療方面必將發(fā)揮更加重要的作用。