居述云，吳堅(jiān)平，楊立榮

（1 浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，浙江杭州310027；2 浙江大學(xué)杭州國(guó)際科創(chuàng)中心，浙江杭州311200）

D- 氨基酸氧化酶（D-amino acid oxidase,DAAO,EC 1.4.3.3）是一類(lèi)含有黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的黃素蛋白。有氧條件下，該類(lèi)酶能夠?qū)τ丑w選擇性催化D-氨基酸氧化脫氫，生成亞胺酸。后者自發(fā)水解生成相應(yīng)的α-酮酸和氨，見(jiàn)圖1。反應(yīng)過(guò)程中，還原型輔酶FADH2經(jīng)氧氣再氧化，產(chǎn)生過(guò)氧化氫。

圖1 DAAO催化D-氨基酸氧化脫氫反應(yīng)示意圖

迄今為止，已報(bào)道的DAAO主要來(lái)源于真核生物，如絲狀真菌、酵母菌、哺乳動(dòng)物等[1]。其中，典型的DAAO 包括豬腎（porcine kidney）來(lái)源的pkDAAO[2]、紅酵母（Rhodotorula gracilis）來(lái)源的RgDAAO[3]和三角酵母（Trigonopsis variabilis）來(lái)源的TvDAAO[4]。此外，在放線(xiàn)菌屬的原核生物中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了DAAO[5]，例如源自原玻璃蠅節(jié)桿菌（Arthrobacter protophormiae）的ApDAAO。這些不同來(lái)源的DAAO 不僅在D-氨基酸代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用[6]，同時(shí)也為該類(lèi)酶在生物技術(shù)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

DAAO通常具有寬泛的底物譜和高度的對(duì)映體選擇性，已被成功用于多種生化反應(yīng)過(guò)程，相關(guān)研究引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛的關(guān)注[7-8]。多年來(lái)，DAAO在生物催化方面的應(yīng)用主要見(jiàn)于7-氨基頭孢烷酸、手性氨基酸以及α-酮酸的合成。最近，研究人員基于該類(lèi)酶的蛋白結(jié)構(gòu)以及催化機(jī)制，通過(guò)蛋白質(zhì)工程改造酶的催化性能，使其能夠選擇性催化氧化胺類(lèi)化合物并用于制備手性胺，不僅成功拓展了底物特異性，而且為后續(xù)以DAAO為蛋白骨架創(chuàng)制新的酶類(lèi)提供了重要的理論依據(jù)。

本文介紹了DAAO的蛋白結(jié)構(gòu)特征及其催化機(jī)制，闡述了DAAO底物特異性和熱穩(wěn)定性分子改造的代表性成果。最后，總結(jié)了DAAO在生物催化與轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用進(jìn)展。

1 D-氨基酸氧化酶的結(jié)構(gòu)特征及催化機(jī)制

1.1 D-氨基酸氧化酶的蛋白結(jié)構(gòu)特征

到目前為止，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（protein data bank，PDB）中已披露的DAAO 登錄號(hào)共有39 個(gè)，包括4 個(gè)RgDAAO[9-10]、16 個(gè)pkDAAO[11-12]以及19 個(gè)人體來(lái)源的hDAAO[13]。這些結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)都是基于X 射線(xiàn)晶體衍射技術(shù)而獲得，分辨率在1.2～3.2?（1?=10－10m）。

RgDAAO、pkDAAO和hDAAO蛋白分子量大小相近，單個(gè)亞基所含有的氨基酸數(shù)目分別為368、347 和347，見(jiàn)表1。序列比對(duì)結(jié)果表明，pkDAAO（或hDAAO） 與RgDAAO 的序列一致性分別為28.73%（或27.73%）。

雖然RgDAAO、pkDAAO 和hDAAO 的氨基酸序列具有一定的差異，但在三維結(jié)構(gòu)上卻頗為相似[14-15]。一般而言，它們均為同源二聚體，每一個(gè)亞基都含有一個(gè)非共價(jià)結(jié)合的輔酶FAD。催化活性中心處與配體相互作用的氨基酸殘基具有高度的保守性。例如，在RgDAAO 與D-三氟丙氨酸的復(fù)合體晶體結(jié)構(gòu)（PDB登錄號(hào)：1C0L[9]）中，D-三氟丙氨酸的α-羧基與R285位的精氨酸殘基以及Y223位的酪氨酸殘基相互作用，形成了鹽橋和氫鍵，見(jiàn)圖2(a)。pkDAAO與苯甲酸（PDB登錄號(hào)：1VE9[12]）[見(jiàn)圖2(b)]以及hDAAO與2-氨基苯甲酸（PDB登錄號(hào)：2E4A[13]）[見(jiàn)圖2(c)]的復(fù)合體晶體結(jié)構(gòu)解析結(jié)果表明，與配體羧基作用的正是R283 位的精氨酸殘基以及Y228 位的酪氨酸殘基。此外，配體的取代基團(tuán)都朝向由疏水性氨基酸殘基（如苯丙氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸等）形成的口袋。DAAO蛋白晶體結(jié)構(gòu)的解析不僅有利于該類(lèi)酶催化機(jī)制的研究，而且為后續(xù)蛋白質(zhì)工程改造酶的催化性能提供了重要的理論支撐。

1.2 D-氨基酸氧化酶的催化機(jī)制

Walsh 等[16]和Hersh 等[17]早 期 針 對(duì)DAAO 催 化的氧化脫氫反應(yīng)，分別提出了“負(fù)碳離子”和“Cα-H氫轉(zhuǎn)移”機(jī)制。隨著pkDAAO和RgDAAO的蛋白結(jié)構(gòu)相繼被解析，目前普遍認(rèn)可的是“氫轉(zhuǎn)移”機(jī)制[9,18]。DAAO 利用輔酶FAD 在底物和O2之間進(jìn)行電子和氫的轉(zhuǎn)運(yùn)（見(jiàn)圖3），所催化的氧化脫氫反應(yīng)由兩個(gè)半反應(yīng)組成。①還原半反應(yīng)，底物進(jìn)入DAAO 的活性中心后，以兼性離子的狀態(tài)與活性中心底物結(jié)合口袋處的氨基酸殘基相互作用，形成氫鍵、離子鍵等。這種狀態(tài)會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)平衡，底物Cα上的氫轉(zhuǎn)移到輔酶FAD 異咯嗪環(huán)的N(5)上，而氨基上的一個(gè)氫則釋放到反應(yīng)體系中，從而形成亞胺酸。該化合物不穩(wěn)定，自發(fā)水解生成相應(yīng)的α-酮酸和氨。②氧化半反應(yīng)，還原型輔酶被O2氧化，生成過(guò)氧化氫。整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中，活性中心處的氨基酸殘基并沒(méi)有直接參與催化反應(yīng)，僅僅與底物的結(jié)合及其保持正確定向有關(guān)[7,9,19]。

表1 RgDAAO、pkDAAO和hDAAO的基本性質(zhì)比較

圖2 RgDAAO、pkDAAO和hDAAO分別與不同配體相互作用的二維平面圖

圖3 DAAO催化D-氨基酸氧化脫氫的反應(yīng)機(jī)制示意圖

2 D-氨基酸氧化酶的蛋白質(zhì)工程

2.1 D-氨基酸氧化酶底物特異性的分子改造

2.1.1 基于理性設(shè)計(jì)改變底物結(jié)合口袋處關(guān)鍵氨基酸殘基的帶電性質(zhì)

RgDAAO 的底物特異性偏好中性或堿性D-氨基酸。為提高該酶對(duì)酸性氨基酸的催化活力，Pollegioni 等[20]將D-天冬氨酸（1，見(jiàn)表2）分別與牛腎來(lái)源D-天冬氨酸氧化酶DASPO（同源模建）和RgDAAO（PDB 登錄號(hào):1C0L）進(jìn)行分子對(duì)接，選取底物結(jié)合口袋處的M213進(jìn)行定點(diǎn)突變。結(jié)果表明M213 位甲硫氨酸殘基對(duì)于RgDAAO 正確識(shí)別D-天冬氨酸側(cè)鏈基團(tuán)中帶負(fù)電荷的羧基具有重要影響，而在DASPO 模擬結(jié)構(gòu)中，與之相對(duì)應(yīng)的是側(cè)鏈基團(tuán)帶正電荷的精氨酸殘基。當(dāng)甲硫氨酸被精氨酸取代后，突變體M213R對(duì)D-天冬氨酸(1)和D-谷氨酸(2)的催化效率（kcat/Km值）分別是原始酶的74倍和37倍，而對(duì)D-丙氨酸(3)的催化效率卻顯著降低。

近年來(lái)，Asano 等[21]通過(guò)分析苯甲酸與pkDAAO的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，選取與苯甲酸的羧基形成鹽橋的R283作為定點(diǎn)飽和突變位點(diǎn)。當(dāng)R283位側(cè)鏈基團(tuán)帶正電荷的精氨酸殘基突變?yōu)椴粠щ姾傻母拾彼釟埢鶗r(shí)，突變體R283G 轉(zhuǎn)變成了具有嚴(yán)格(R)-構(gòu)型選擇性的胺氧化酶，能夠?qū)τ丑w選擇性識(shí)別(R)-α-苯乙胺(9)，同時(shí)喪失了對(duì)天然底物D-苯丙氨酸的催化活力，從而將pkDAAO的底物特異性由氨基酸拓展到了胺類(lèi)化合物。

上述研究表明，DAAO底物結(jié)合口袋處關(guān)鍵氨基酸殘基的帶電性質(zhì)能夠顯著影響該酶對(duì)底物的識(shí)別能力。因此，對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行改造可以進(jìn)一步拓展DAAO的底物特異性。

2.1.2 基于理性設(shè)計(jì)改變底物結(jié)合口袋處關(guān)鍵氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的大小

Pollegioni等[22]基于已有的RgDAAO晶體結(jié)構(gòu)和虛擬篩選，發(fā)現(xiàn)M213位氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的大小顯著影響該酶對(duì)大位阻底物的催化活力。當(dāng)M213 位側(cè)鏈基團(tuán)較大的甲硫氨酸突變?yōu)檩^小的甘氨酸時(shí)，疏水性底物結(jié)合口袋的空間變大，突變體M213G對(duì)于D-1-萘基丙氨酸(4)和D-1-萘基甘氨酸(6)的催化效率相較于原始酶分別提高了8.4 倍和10.5倍。此外，對(duì)于結(jié)構(gòu)剛性較大的苯甘氨酸類(lèi)衍生物(5)和(7)，該突變體的催化效率也有不同程度的提高[23]。

Asano 等[21]在pkDAAO 突變體R283G 的基礎(chǔ)之上，對(duì)與苯甲酸羧基相互作用的另一位點(diǎn)Y228 進(jìn)行突變。其中，突變體Y228L/R283G 對(duì)(R)-9 的催化活力提高到了21.5U/mg。蛋白晶體結(jié)構(gòu)解析結(jié)果表明在輔酶FAD 二甲苯環(huán)的旁邊產(chǎn)生了一個(gè)疏水口袋，從而有足夠的空間能夠容納(R)-9 的苯環(huán)。盡管底物特異性發(fā)生了改變，突變體Y228L/R283G依然通過(guò)α-質(zhì)子氫轉(zhuǎn)移機(jī)制來(lái)進(jìn)行氧化脫氫反應(yīng)[24]。底物(R)-9 的Cα原子上的氫（α-質(zhì)子）更靠近輔酶FAD 的N(5)原子，而(S)-9 的α-質(zhì)子則朝向Y224，從而使得(R)-構(gòu)型底物的氧化脫氫反應(yīng)更容易進(jìn)行。第一性原理計(jì)算結(jié)果表明，突變體Y228L/R283G 與(R)-9 的相互作用能比(S)-9 的相互作用能強(qiáng)達(dá)13kcal/mol（1kcal/mol=4.1840kJ/mol）。這些差異導(dǎo)致突變體Y228L/R283G 能夠特異性識(shí)別外消旋體中的(R)-構(gòu)型胺類(lèi)化合物[25]。該課題組同時(shí)也發(fā)現(xiàn)pkDAAO 突變體Y228L/R283G 活性中心處F242 位氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的大小顯著影響該酶對(duì)較大位阻底物的催化活力，見(jiàn)表2。當(dāng)該位點(diǎn)的苯丙氨酸突變?yōu)閭?cè)鏈基團(tuán)較小的異亮氨酸時(shí)，活性中心處形成了更大的疏水口袋，突變體Y228L/R283G/F242I 對(duì)(R)-1-(2-萘基)-乙胺(10)的催化活力達(dá)4U/mg，催化效率相較于突變體Y228L/R283G 提高了0.6 倍[25]。雖然突變體Y228L/R283G 能夠催化氧化(R)-9 和(R)-10，但對(duì)于具有更大取代基的底物4-氯-二苯甲胺(11)卻沒(méi)有催化活力。Asano 等[26]根據(jù)已有的突變體Y228L/R283G晶體結(jié)構(gòu)以及構(gòu)效關(guān)系分析，推測(cè)活性中心處L51、I215和I230位氨基酸殘基可能在該酶催化大位阻底物氧化脫氫的反應(yīng)過(guò)程中起重要作用。因此，分別以突變體R283G 和Y228L/R283G 作為親本，對(duì)上述三個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變。突變體I230A/R283G 對(duì) rac-11 的催化效率最高（122.7mmol/L·min），并且具有嚴(yán)格(S)-對(duì)映體選擇性，見(jiàn)表2。

表2 DAAO底物特異性改造的代表性成果

續(xù)表2

由此可見(jiàn)，DAAO底物結(jié)合口袋的大小受關(guān)鍵氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)空間位阻的影響。利用具有較小側(cè)鏈基團(tuán)的氨基酸代替大位阻側(cè)鏈基團(tuán)的氨基酸殘基，可以有效擴(kuò)大底物結(jié)合口袋，增強(qiáng)酶與底物的相互作用，進(jìn)而提高該類(lèi)酶的催化活力。

2.1.3 基于理性設(shè)計(jì)改變底物結(jié)合口袋處氨基酸殘基的極性

到目前為止，TvDAAO的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)還未有報(bào)道。因此，通過(guò)同源建模獲得較為可靠的三維模型，考察酶與底物的相互作用，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行突變，可以獲得具有目標(biāo)性能的突變體。

為進(jìn)一步提高TvDAAO 對(duì)頭孢菌素C(8)的催化活力，Wong 等[27]基于底物8 與TvDAAO（同源模建）的分子對(duì)接結(jié)果，選取底物結(jié)合口袋處鄰近底物氨基的F54 位苯丙氨酸殘基作為定點(diǎn)突變位點(diǎn)。當(dāng)疏水性苯丙氨酸殘基變?yōu)闃O性相對(duì)較大的酪氨酸殘基時(shí)，側(cè)鏈基團(tuán)中的酚羥基與底物8的氨基形成了氫鍵，穩(wěn)定了底物在結(jié)合口袋處的構(gòu)象，突變體F54Y 對(duì)底物8 的催化效率相較于原始酶提高了1倍。

2.1.4 基于定向進(jìn)化改變非底物結(jié)合口袋處的氨基酸殘基

理性設(shè)計(jì)主要基于酶與底物相互作用的氨基酸殘基而展開(kāi)改造工作。此外，通過(guò)定向進(jìn)化，可以發(fā)掘一些非活性中心處的氨基酸殘基對(duì)DAAO底物特異性的影響。

除上述疏水性底物結(jié)合口袋處的氨基酸殘基以外，Sacchi 等[28]通過(guò)易錯(cuò)PCR 構(gòu)建了隨機(jī)突變體庫(kù)，結(jié)合過(guò)氧化物酶/鄰聯(lián)茴香胺介導(dǎo)的顯色法，進(jìn)行高通量篩選。結(jié)果表明：位于RgDAAO 蛋白表面的L118，T60 以及Q144 位氨基酸殘基能夠顯著影響該酶的催化活力,見(jiàn)表2。例如，突變體L118H對(duì)底物3和1的催化效率分別是原始酶的1.9倍和2 倍。突變體T60A/Q144R/K152E 對(duì)1 的催化效率是原始酶的5.6倍。

2.2 D-氨基酸氧化酶熱穩(wěn)定性的分子改造

酶的熱穩(wěn)定性是影響生物催化反應(yīng)的重要因素。Bakke 等[29]通過(guò)易錯(cuò)PCR 建立突變體庫(kù)，利用過(guò)氧化物酶/4-氨基安替比林介導(dǎo)的顯色反應(yīng)進(jìn)行高通量篩選，獲得了熱穩(wěn)定性顯著提高的pkDAAO。55℃條件下孵育1h 后，突變體F42C 對(duì)(R)-3的殘余酶活達(dá)70%以上，而原始酶僅為10%。此外，2.1.3 節(jié)中通過(guò)理性設(shè)計(jì)獲得的突變體TvDAAO F54Y 不僅提高了該酶對(duì)底物8 的催化活力，而且也增強(qiáng)了熱穩(wěn)定性。55℃條件下保溫30min，突變體F54Y 對(duì)8 的殘余活力幾乎沒(méi)有影響，而原始酶卻喪失了40%。

3 D-氨基酸氧化酶在生物催化中的應(yīng)用

3.1 D-氨基酸氧化酶介導(dǎo)的兩步酶法催化合成7-氨基頭孢烷酸

7-氨基頭孢烷酸(14)是制備半合成頭孢菌素類(lèi)抗生素的前體化合物。自20 世紀(jì)90 年代以來(lái)，以DAAO 和戊二?；?7-氨基頭孢烷酸?；笧樯锎呋瘎?，已成功建立了兩步酶法催化轉(zhuǎn)化頭孢菌素C(8)合成14 的生產(chǎn)工藝（見(jiàn)圖4），并進(jìn)行了工業(yè)化生產(chǎn)[30]。在此過(guò)程中，DAAO催化8的D-α-氨基己二?；鶊F(tuán)氧化脫氫生成α-酮己二酰-7-氨基頭孢烷酸(12)，后者經(jīng)脫羧反應(yīng)轉(zhuǎn)化成戊二酰-7-氨基頭孢烷酸(13)。最終，酰化酶催化13進(jìn)行脫?；磻?yīng)生成產(chǎn)物14[31-32]。

3.2 D-氨基酸氧化酶催化合成手性氨基酸和胺類(lèi)化合物

手性氨基酸和胺類(lèi)化合物是合成眾多醫(yī)藥、農(nóng)藥等高值化學(xué)品的前體化合物。例如，以(S)-1,2,3,4-四氫異喹啉-1-甲酸(16)為底物，經(jīng)多步化學(xué)反應(yīng)，可合成一種靶向Keap1-Nrf2 相互作用的小分子抑制劑，從而有望用于癌癥、糖尿病等疾病的治療和預(yù)防[33]。(S)-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酸(17)是降壓藥喹那普利的重要組成部分[34]，L-2-氨基丁酸(21)是抗癲癇藥物左乙拉西坦的前體化合物[35]。利用D-氨基酸氧化酶介導(dǎo)的去消旋化反應(yīng)制備該類(lèi)化合物具有外消旋底物來(lái)源簡(jiǎn)單、底物譜廣泛、反應(yīng)對(duì)映體選擇性高、反應(yīng)條件溫和等顯著特點(diǎn)。到目前為止，該方法主要有兩種反應(yīng)方式：①化學(xué)-酶法去消旋化；②多酶催化氧化還原級(jí)聯(lián)去消旋化。

圖4 兩步酶法合成7-氨基頭孢烷酸

3.2.1 化學(xué)-酶法去消旋化

DAAO 介導(dǎo)的化學(xué)-酶法去消旋化包含兩步反應(yīng)。①選擇性生物催化反應(yīng)：以外消旋氨基酸或胺為底物，利用氧化酶選擇性催化其中的一個(gè)構(gòu)型進(jìn)行Cα-N 鍵氧化脫氫反應(yīng)生成亞胺，另一構(gòu)型保持不變。②非選擇性化學(xué)還原反應(yīng)：亞胺被非選擇性化學(xué)還原劑轉(zhuǎn)化為外消旋底物。兩步反應(yīng)在“一鍋”反應(yīng)體系中高效協(xié)同進(jìn)行，見(jiàn)圖5。亞胺（特別是鏈狀亞胺）在水溶液中通常不穩(wěn)定，易水解開(kāi)環(huán)生成醛（酮）和胺。因此，反應(yīng)需加入過(guò)量化學(xué)還原劑，如硼氫化鈉（NaBH4）[36]、氰基硼氫化鈉（NaCNBH3）[37]、氨硼烷（NH3·BH3）[38]等，以確保亞胺能夠直接轉(zhuǎn)化為外消旋底物，盡可能避免副產(chǎn)物（如酮或醇）的生成。

Chen 等[39]利用硅藻土固定化的TvDAAO 和NH3·BH3（10個(gè)當(dāng)量）進(jìn)行去消旋化反應(yīng)，制備糖尿病藥物合成中間體(S)-α-氨基-6-(2-甲基苯)3-吡啶丙酸(15)，產(chǎn)率為68%，ee值＞99%。本文作者所在課題組[40]以來(lái)源于茄病鐮刀菌（Fusarium solani）M-0718 的FsDAAO 作為生物催化劑，構(gòu)建了“一鍋法”FsDAAO-NH3·BH3（4 個(gè)當(dāng)量）去消旋化反應(yīng)體系，將外消旋四氫異喹啉羧酸類(lèi)化合物轉(zhuǎn)化成了(S)-對(duì)映體，轉(zhuǎn)化率達(dá)98%以上，產(chǎn)率達(dá)82%，ee 值＞99%。Asano 等[21]利用pkDAAO Y228L/R283G 和NaBH4（20 個(gè)當(dāng)量）進(jìn)行去消旋化反應(yīng)，(R)-9完全轉(zhuǎn)化為(S)-對(duì)映體，產(chǎn)率為65%，ee值達(dá)99%。底物為rac-11 時(shí)，以pkDAAO I230A/R283G作為生物催化劑進(jìn)行去消旋化反應(yīng)，產(chǎn)物(R)-11的產(chǎn)率為46%，ee值為96%[26]。

該方法通常只需要一種氧化還原酶參與反應(yīng)，并且所用化學(xué)還原劑來(lái)源簡(jiǎn)單。不足之處在于反應(yīng)過(guò)程中通常需要加入過(guò)量的化學(xué)還原劑，不利于環(huán)境友好。反應(yīng)結(jié)束后，需要額外的分離純化步驟，用于除去剩余的化學(xué)還原劑，導(dǎo)致最終的產(chǎn)率有所下降。

3.2.2 多酶催化氧化還原級(jí)聯(lián)去消旋化

多酶催化氧化還原級(jí)聯(lián)去消旋化反應(yīng)是在上述D-氨基酸氧化酶介導(dǎo)的選擇性生物催化反應(yīng)的基礎(chǔ)上，利用生物催化不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)來(lái)代替非選擇性化學(xué)還原反應(yīng)，從而將外消旋底物（通常為氨基酸及其衍生物）轉(zhuǎn)化成單一構(gòu)型的產(chǎn)物。當(dāng)?shù)孜餅殒湢畎被釙r(shí)，其氧化脫氫產(chǎn)物亞胺酸通常不穩(wěn)定，易自發(fā)水解生成酮酸。后者可在氨基酸脫氫酶或者轉(zhuǎn)氨酶的催化下，進(jìn)行不對(duì)稱(chēng)還原胺化反應(yīng)，見(jiàn)圖6。

Findrik 等[41]利 用 ApDAAO 和 紅 球 菌 屬（Rhodococcus sp.） 來(lái)源的L-苯丙氨酸脫氫酶（L-PheDH） 進(jìn)行生物催化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將D-甲硫氨酸(18)幾乎全部轉(zhuǎn)化成了L-甲硫氨酸。Chen等[39]以TvDAAO 和脲芽孢八疊球菌（Sporosarcina ureae）來(lái)源的(S)-選擇性氨基酸脫氫酶（AADH）作為催化劑進(jìn)行去消旋化反應(yīng)，產(chǎn)物(S)-15的最終分離產(chǎn)率為54%，ee 值＞99%。此外，該作者也利用伯克霍爾德菌（Burkholderia sp.）來(lái)源的(S)-選擇性轉(zhuǎn)氨酶（TA）替代上述氨基酸脫氫酶，進(jìn)行“一鍋法”去消旋化反應(yīng)，產(chǎn)物(S)-15 的產(chǎn)率達(dá)73%，ee值＞99%。Qi 等[42]以外消旋氨基酸為底物，利用TvDAAO 與谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）來(lái)源的亮氨酸酸脫氫酶（CgLeuDH）進(jìn)行“一鍋法”去消旋化反應(yīng)，制備L-氨基酸。通過(guò)批次補(bǔ)料，反應(yīng)體系中產(chǎn)物L(fēng)-正纈氨酸(19)的濃度達(dá)54.09g/L，轉(zhuǎn)化率＞96%，ee 值＞99%。Green等[43]利用RgDAAO和大腸桿菌來(lái)源轉(zhuǎn)氨酶EcgabT進(jìn)行去消旋化反應(yīng)，將DL-草銨膦(20)轉(zhuǎn)化成了L-草銨膦，轉(zhuǎn)化率達(dá)85%，ee 值＞99%。Seo 等[44]在兩相體系中，利用表達(dá)VHb-RgDAAO 融合蛋白的全細(xì)胞與表達(dá)河流孤菌（Vibrio fluvialis）來(lái)源ω-轉(zhuǎn)氨酶（VfTA）的全細(xì)胞進(jìn)行“一鍋法”去消旋化反應(yīng)，將底物rac-21 （500mmol/L）轉(zhuǎn)化成了(S)-21，轉(zhuǎn)化率達(dá)97%，ee 值＞99%。Liu 等[45]以基因組上攜帶有TvDAAO 和L-PheDH 基因的釀酒酵母作為宿主細(xì)胞，將前體化合物DL-甲硫氨酸經(jīng)L-甲硫氨酸轉(zhuǎn)化成了S-腺苷-L-甲硫氨酸，產(chǎn)物積累量達(dá)10.3g/L。

不同于上述鏈狀亞胺酸，環(huán)狀亞胺酸在水溶液中較為穩(wěn)定，可被(S)-選擇性還原酶直接轉(zhuǎn)化為(S)-構(gòu)型環(huán)狀氨基酸，見(jiàn)圖7。例如，Yasuda 等[46]以外消旋哌啶酸(22)為底物，利用pkDAAO 與惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）KT2440 來(lái)源的還原酶PpDpkA 進(jìn)行去消旋化反應(yīng)，產(chǎn)物為(S)-22，轉(zhuǎn)化率和ee 值均＞99%。本文作者課題組[47]基于反應(yīng)可行性及兼容性評(píng)估，成功耦合FsDAAO催化的對(duì)映體選擇性氧化脫氫反應(yīng)和PpDpkA介導(dǎo)的不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)，構(gòu)建了“一鍋法”多酶級(jí)聯(lián)去消旋化反應(yīng)體系，將底物rac-16轉(zhuǎn)化成了(S)-對(duì)映體，產(chǎn)率為89%，ee值＞99%。相較于化學(xué)-酶法去消旋化反應(yīng)，該反應(yīng)體系中的亞胺酸被直接轉(zhuǎn)化成了目標(biāo)手性化合物，從而使得整個(gè)去消旋化反應(yīng)效率更高，并且反應(yīng)結(jié)束后，分離純化步驟簡(jiǎn)單，產(chǎn)物的收率更高。不足之處在于具有相反對(duì)映體選擇性的氧化還原酶篩選困難，需要優(yōu)化獲得合適的反應(yīng)條件，以確保整個(gè)去消旋化反應(yīng)高效協(xié)同進(jìn)行。

3.3 D-氨基酸氧化酶催化合成α-酮酸

圖7 DAAO介導(dǎo)的多酶催化級(jí)聯(lián)去消旋化制備手性環(huán)狀氨基酸

作為一種重要的化工原料，α-酮酸綠色高效的合成方法是近年來(lái)的熱點(diǎn)研究?jī)?nèi)容之一。DAAO催化D-氨基酸氧化脫氫是合成相應(yīng)α-酮酸的重要途徑。例如，Orrego 等[48]以外消旋氨基酸為底物，利用霍亂弧菌（Vibrio cholera）來(lái)源的氨基酸消旋酶BsrV 將L-氨基酸轉(zhuǎn)化成D-氨基酸，后者經(jīng)TvDAAO 催化生成α-酮酸(23～25)，轉(zhuǎn)化率＞99%，見(jiàn)圖8。該方法的優(yōu)勢(shì)在于反應(yīng)效率高，環(huán)境友好，并且避免了使用價(jià)格昂貴的D-氨基酸作為原料。然而，相較于L-氨基酸氧化酶或氨基酸脫氨酶催化的“一步法”合成α-酮酸[49-52]，該三酶體系仍然較為復(fù)雜。

圖8 DAAO催化合成α-酮酸

4 結(jié)語(yǔ)

DAAO作為一種重要的生物催化劑，已成功用于制備7-氨基頭孢烷酸、手性氨基酸和胺類(lèi)化合物等過(guò)程?；钚灾行奶幣c底物相互作用的氨基酸殘基主要與底物的正確定向有關(guān)。目前DAAO的分子改造工作也主要基于該處關(guān)鍵氨基酸殘基的突變而展開(kāi)，相關(guān)成果加深了該酶構(gòu)效關(guān)系的理解。然而，到目前為止，能夠滿(mǎn)足生物合成需求的DAAO種類(lèi)仍然相對(duì)較少，底物范圍主要集中于頭孢菌素C 和結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單的D-氨基酸及其衍生物。后續(xù)的研究工作或許可以從以下三方面展開(kāi)。

（1）挖掘具有不同底物特異性的DAAO，解析蛋白結(jié)構(gòu)，結(jié)合計(jì)算化學(xué)闡明其對(duì)映體選擇性及底物識(shí)別的分子機(jī)制。

（2）基于理性設(shè)計(jì)，對(duì)該類(lèi)酶進(jìn)行分子改造，以期獲得能夠催化不同非天然底物的突變體。此外，目前可用于生物催化過(guò)程的L-氨基酸氧化酶仍然稀少，如能翻轉(zhuǎn)現(xiàn)有DAAO 的對(duì)映體選擇性，使其能夠催化氧化L-氨基酸及其衍生物，必將擴(kuò)大該類(lèi)酶的應(yīng)用范圍。

（3）設(shè)計(jì)新穎的化學(xué)-酶或多酶耦合催化體系，以挖掘或改造獲得的DAAO作為催化劑，從而實(shí)現(xiàn)功能化學(xué)品生物催化合成新途徑的構(gòu)建。