張曉健，劉倩，柳志強，鄭裕國

（1 浙江工業(yè)大學生物工程學院，手性生物制造國家地方聯(lián)合工程研究中心，浙江杭州310014；2 浙江工業(yè)大學生物工程學院，浙江省生物有機合成重點實驗室，浙江杭州310014）

立體選擇性羰基還原酶（carbonyl reductase,EC 1.1.1.148）可在還原型輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸）[NAD(P)H]存在的情況下，催化手性酮不對稱還原得到手性醇[1]。手性醇含有一個手性羥基官能團，是有機合成中重要的手性砌塊，廣泛應用于醫(yī)藥中間體、精細化工等領域[2-3]。傳統(tǒng)的手性醇合成需要昂貴的手性貴金屬催化劑、嚴苛的反應條件、易燃易爆的硼氫化物還原劑，且具有產(chǎn)物光學純度低、分離純化工藝復雜、“三廢”處理困難、生產(chǎn)成本居高不下等缺點。立體選擇性羰基還原酶催化的羰基不對稱還原反應具有酶來源廣泛、活性與立體選擇性突出、反應條件溫和、產(chǎn)物光學純度高、生產(chǎn)成本低廉、環(huán)境友好等突出優(yōu)勢，在手性醇的合成中應用前景廣闊。近年來，立體選擇性羰基還原酶的篩選、改造與應用研究備受各界重視并不斷取得進展，有力地推動了手性醫(yī)藥中間體與精細化學品綠色制造領域的發(fā)展。

1 羰基還原酶的發(fā)現(xiàn)與分類

1.1 羰基還原酶的篩選

羰基還原酶廣泛存在于細菌、真菌與動植物體內，種類與數(shù)量眾多，來源廣泛。因微生物易于獲得、生長周期短且具有豐富的多樣性，科學家常直接從環(huán)境樣品，如土壤、海水等中篩選含羰基還原酶的微生物，并進一步分離、鑒定，獲得對應的羰基還原酶。釀酒酵母、克魯維酵母、假絲酵母、畢赤酵母、不動桿菌、假單胞菌、乳酸桿菌等細菌或真菌來源的羰基還原酶已得到分離、鑒定，并應用于手性醇產(chǎn)品的不對稱合成。Chen等[4]開發(fā)了一種改進的手性高效液相色譜酶活性分析方法，成功分離出了一株能夠將2-苯甲酰胺基1-3-氧代丁酸酯還原為(2S,3R)-甲基-2-苯甲酰胺基甲基1-3-羥基丁酸酯的含羰基還原酶新菌株Burkholderia gladioli ZJB-12126。Luo 等[5]克隆并表達了來自黏紅酵母R.glutinis XP1463的羰基還原酶CaAKR和來自乳酸克魯維酵母K. lactis XP1461 的KlAKR，催化6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯的不對稱還原，e.e.值均大于90%。

傳統(tǒng)從環(huán)境樣品中篩選含酶微生物的方法往往工作效率低下，時間與經(jīng)濟成本高昂。近年來，隨著DNA 測序技術、分子生物學等的快速發(fā)展，公共基因數(shù)據(jù)庫的容量快速擴充，生物信息學分析與發(fā)掘技術日益成熟，從基因數(shù)據(jù)庫中分析挖掘目的酶已成為發(fā)現(xiàn)新酶、新基因的主流技術?；蚪M狩獵是常用的生物信息學分析手段之一，可基于已知的酶/基因序列信息，對某種微生物的全基因組序列進行搜索、比對與分析，獲得潛在的新酶/基因，對其進行克隆、表達與功能分析，即可獲得所需新酶。多種新型羰基還原酶已經(jīng)得到分析與鑒定。Kaluzna 等[6]利用釀酒酵母（S.cerevisiae）全基因組信息，成功獲得18 種關鍵的羰基還原酶。Xu 等[7]通過分析Yarrowia lipolytica 基因組，獲得羰基還原酶YlCR2，可催化3mol/L 的4-氯-3-羰基丁酸乙酯（COBE）不對稱還原，制備產(chǎn)物(S)-CHBE，e.e.＞99%。Chen 等[8]對唐菖蒲伯克霍爾德氏菌B.gladioli ZJB12126 和圓紅冬孢酵母R. toruloides ZJB2014212 進行基因組狩獵分析，獲得22 種新型羰基還原酶。

基因挖掘則是以已知酶/基因序列為探針，在含海量信息的DNA 數(shù)據(jù)庫中進行搜索、比對，獲得具有較高相似度的酶/基因，進行克隆、表達與活性測定，從而篩選獲得所需要的酶[2]。Wang 等[9]將已知能催化4-氯乙酰乙酸乙酯生成(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的羰基還原酶序列作為出發(fā)序列，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST，獲得具有高活力與高選擇性的羰基還原酶ScCR。Chen 等[10]以來自于L.brevis 的LbADH 為探針序列，根據(jù)序列、結構和功能的相互關系，從多個公共數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)庫（GenBank、SwissProt 和Brenda 等）中進行挖掘，獲得立體選擇性羰基還原酶RtSCR9，可用于度洛西汀手性中間體的生物合成。

1.2 羰基還原酶的分類

羰基還原酶是一類能夠催化醇與醛/酮之間雙向可逆氧化還原反應的酶類，需要輔酶NAD(H)或NADP(H)作為氫傳遞體[11]。目前羰基還原酶主要分布于三個超家族：短鏈脫氫酶/還原酶（short-chain dehydrogenase/reductases,SDRs）[12]，中鏈脫氫酶/還原 酶 （medium-chain dehydrogenases/reductases,MDRs）[13]和 醛 酮 還 原 酶（aldo-ketoreductases,AKRs）[14]。雖然三者的催化功能相似，但在結構上差異較大。

1.2.1 短鏈脫氫酶

短鏈脫氫酶（SDRs）是一種非金屬依賴酶，一般含有250～350 個氨基酸殘基。自19 世紀70 年代發(fā)現(xiàn)昆蟲乙醇脫氫酶和細菌核糖醇脫氫酶以來，短鏈脫氫酶數(shù)量不斷擴充，目前GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的短鏈脫氫酶的數(shù)量已超過99000 種[15-16]。短鏈脫氫酶來源廣泛，序列多樣性高，自然界中25%的脫氫酶屬于短鏈脫氫酶家族[17]。據(jù)輔酶結合域及催化活性位點的序列結構特征，科學家將短鏈脫氫酶 分 為“classical”“extended”“intermediate”“complex”“divergent”“atypical”和“unassigned”7 種，其中“classical”和“extended”是研究最清楚的兩類短鏈脫氫酶[18-19]。雖然該家族成員的不同種類蛋白之間序列一致性較低（20%～30%），但其高級結構高度保守。短鏈脫氫酶通常以單體、二聚體、四聚體、八聚體或十聚體等同源多聚體的形式存在。每個亞基均由含有多條β折疊交替α螺旋的Rossman 折疊結構組成，底物結合區(qū)域位于C 端，輔酶結合區(qū)域位于N 末端[20]，輔酶的類型[NAD(H)/NAD(P)H]由N 末端的GXXXGXG 下游20 個氨基酸左右的氨基酸殘基決定，酸性氨基酸殘基可特異性結合NAD(H)核糖環(huán)上2’和3’位羥基，堿性氨基酸殘基則在與NADP(H)的結合中起重要作用[21]，底物特異性由高變異區(qū)C 末端片段決定。Asn-Ser-Tyr-Lys 是SDRs 的催化四聯(lián)體，Tyr 起著Lewis 酸/堿催化的作用，Lys 以及氧化型輔酶能降低Tyr 的pka值，推動羰基還原反應進行。Lys ε 位的氨基與輔酶核糖環(huán)上的羥基形成氫鍵，Ser 則與底物的羰基氧形成氫鍵，促進底物羰基的極化，利于還原反應發(fā)生。Asn 能形成一個特征螺旋扭結（helical kink），其羰基與Lys 周圍的水分子結合并與Lys 形成氫鍵，激發(fā)Lys的活性（圖1）[22-24]。

1.2.2 中鏈脫氫酶

中鏈脫氫酶（MDRs）是一類約含350 個氨基酸殘基的鋅或非鋅-依賴型脫氫酶。根據(jù)迭代隱馬爾可夫模型（HMMs），中鏈脫氫酶可分為86 類，包括MDR001-ADH、MDR002-PTGR、MDR003-FAS 及MDR010-CAD 等，不同種類間序列同源性在40%～90%之間。中鏈脫氫酶一般是以單聚體、二聚體或四聚體的形式存在。每個亞基含有兩個結構部分[圖2(a)][25]，N端與C端共折疊區(qū)域形成一個裂縫結構，為活性中心口袋，輔酶結合域覆蓋了包括Rossman 結構在內的C 端大部分區(qū)域[26-28]。細菌中的中鏈脫氫酶通常為非鋅-依賴型，而真核生物中的中鏈脫氫酶一般為鋅-依賴型[29-30]。鋅離子有多種結合方式，有的輔酶結合域和活性中心均結合一個鋅離子，有的只有活性中心結合一個鋅離子，有的則不需要鋅離子。中鏈脫氫酶的催化過程往往需要鋅離子的參與，鋅離子一般與Cys、His、Asp及一個水分子形成一個含羧基配體的四面體結構，參與酶與底物的結合過程[27]。中鏈脫氫酶催化醛酮還原的過程中，羰基底物首先進入活性中心，與活性中心His、Ser 和His 殘基連接的Zn+及輔酶核糖環(huán)上的兩個羥基作用穩(wěn)定構象，接收來自還原型輔酶C4位上的[H]，轉化為對應的醇產(chǎn)物[圖2(b)][28]。

圖1 人類激素3-β-脫氫酶的結構示意圖［19］及短鏈脫氫酶的催化機理［22］

1.2.3 醛酮還原酶

醛酮還原酶（AKRs）是一類含有320 個左右氨基酸的非金屬依賴型羰基還原酶，廣泛存在于動物、植物、原核生物中，并大多以單體形式存在[31-33]。目前其超家族成員超過190 個，分布于AKR1-AKR15 的15 個家族[34]，每個家族成員之間的序列同一性大于40%。根據(jù)功能又可分為醛糖還原酶（aldose reductases）、醛還原酶（aldehyde reductases）以及羥類固醇脫氫酶（hydroxysteriod dehydrogenases）等。醛酮還原酶底物譜廣，不僅參與內源性物質如糖醛、醛類脂以及酮前列腺素等的代謝，也可催化烷基、芳基醛酮、多環(huán)芳香族烴、黃曲霉毒素醛等外源性物質的代謝[35-40]。醛酮還原酶在功能上與短鏈脫氫酶類似，但三維結構與其差異較大。醛酮還原酶主要結構框架為(α/β)8桶狀結構，又稱TIM 結構，即中央由8 個β 折疊旋轉交錯排列，周圍由8 個α 螺旋圍繞，TIM 結構外圍還存在H1 和H2 兩條α 螺旋鏈[圖3(a)][32,40-42]。醛酮還原酶的輔酶結合區(qū)域位于TIM結構中央，活性中心則位于TIM結構的C端及延伸出的三個高變異的loop 區(qū)。醛酮還原酶活性中心關鍵催化位點為Asp-Tyr-Lys-His。Tyr 起Lewis 酸/堿 催 化 作 用，Asp和Lys通過降低Tyr的pKa促進氫的傳遞，His與底物形成氫鍵[圖3(b)][43-45]。

圖2 來源于Thermus sp.ATN1的中鏈脫氫酶TADH三級結構示意圖［27］及中鏈脫氫酶催化機理［28］

2 羰基還原酶立體選擇性催化機制與分子改造

2.1 羰基還原酶催化立體選擇催化機制

圖3 家蠶醛酮還原酶AKR2E4的三級結構示意圖［42］及醛酮還原酶不對稱還原的原理［44］

立體選擇性羰基還原酶遵循順序Bi-Bi 動力學催化機制催化手性醇的合成，酶與輔酶NAD(P)H結合組成全酶，底物進入酶的活性中心，形成酶-底物復合體，底物獲得輔酶傳遞的質子被還原為手性醇，NAD(P)H 失去質子被氧化為NAD(P)+，手性醇與NAD(P)+隨后與酶分離，NAD(P)+可通過輔酶再生途徑轉化為NAD(P)H進入下一次催化反應[46]。由于底物酮的羰基C屬于sp2雜化，呈平面結構，其平面前側為re-面（re-face），后側為si-面（si-face），如圖4。輔酶NAD(P)H煙酰胺環(huán)C4上的[H]可通過4條途徑傳遞給底物的羰基C，[H]傳遞途徑取決于底物與酶結合的構象。當[H]以E1或E2的方式從底物羰基C 的si-面進攻時，反應遵循anti-Prelog 規(guī)則，獲得(R)-醇；反之，當[H]以E3或E4途徑從羰基C 的re-面進攻羰基C 時，反應遵循Prelog 規(guī)則，得到(S)-醇。此外，酶的類型與結構決定了輔酶煙酰胺環(huán)C4上的pro-(R)-H 還是pro-(S)-H 傳遞給底物。Martins等獲得NADH依賴型(R)-2-羥基戊二酸脫氫酶（HGDH）的晶體結構，揭示該酶在催化2-酮戊二酸生成(R)-2-羥基戊二酸中的氫傳遞機理，NADH 煙酰胺環(huán)C4 上pro-(R)-H 進攻底物si-面，生成R型產(chǎn)物[23]。

2.2 羰基還原酶的分子改造

圖4 NAD（P）H煙酰胺環(huán)上的［H］向底物羰基傳遞的立體化學途徑示意圖

從自然環(huán)境篩選或數(shù)據(jù)庫挖掘獲得的野生羰基還原酶活性、穩(wěn)定性與選擇性一般較差，不能滿足高強度工業(yè)生產(chǎn)的要求。對野生羰基還原酶進行改造，提升酶在有機合成過程中的催化性能，尤其是對非天然底物的活性與選擇性成為手性醇生物合成領域的關鍵。近年來，隨著對羰基還原酶分類、結構與立體選擇性催化機制研究的不斷深入，羰基還原酶的底物通道、輔酶結合域、活性中心結構、酶-底構效關系、質子傳遞過程及分子熱、動力學原理逐步得到揭示，對羰基還原酶的理性/半理性改造不斷取得可喜進展。Wei 等[47]通過半理性設計提高了羰基還原酶AcCR 對11 種前手性底物的活性，獲得了三個陽性雙突變體(mut-E144A/G152 L、mut-G152 L/ Y189 N 和mut-I147 V/G152 L)，這 些突變體縮短了底物與Tyr155 的羰基的氧原子之間的距離，比酶活提高了17～61 倍，催化效率（kcat/Km）也得到了明顯的提高。Gong等[48]通過定向進化對來自Lactobacillus brevis 的天然酮還原酶LbCR 進行分子改造，獲得了最佳突變體LbCRM8（M154I/A155D/V198I/A201D/A202L），40℃下半衰期增加了1944倍，催化效率提高了3.2倍，導致熱穩(wěn)定性提高是由于V198I/M154I/A155D的突變，酶活性增加是A201D/A202L 導致的。Honda 等[49]通過定向進化提高了來自于Ogataea minuta 的羰基還原酶OCR的穩(wěn)定性，50℃時的半衰期得到了明顯提高，酶穩(wěn)定性的提高主要是由于V166A 的氨基酸取代。Qin等[50]以來自于Lactobacillus fermentum 的短鏈脫氫酶（LfSDR1）作為出發(fā)酶，確定了幾種SDR酶序列中控制立體選擇性的關鍵位置，這種方法應用于與LfSDR1具有21%～48%序列相似性的其他五種SDR酶，它們不對稱還原的立體選擇性也可以在Prelog和anti-Prelog之間切換，可以有效地提高酶的立體選擇性。Zhang 等[51]通過分析晶體結構和多序列比對，確定了關鍵位點F25 和W113，通過對這兩個位點定點突變進一步提高了醛酮還原酶YvgN 的催化活性和立體選擇性。

3 羰基還原反應的輔酶再生

羰基還原酶為輔酶NAD(P)H 依賴型酶，其催化的手性醇制備過程需要輔酶參與。但外源輔酶價格昂貴，無法大量添加，細胞內的天然輔酶再生系統(tǒng)又無法滿足高強度工業(yè)催化的需要，高效的輔酶再生技術成為手性醇生物合成的重要研究方向。目前主要的輔酶再生技術包括酶法、電化學法、光化學法和化學法等。酶促輔酶再生技術工藝簡單、成本低廉，與羰基生物不對稱還原過程相容性好，在羰基還原酶催化領域應用最為廣泛。根據(jù)酶與底物偶聯(lián)方式的不同，可將其分為“酶-偶聯(lián)”法和“底物-偶聯(lián)”法[52-55]?！懊?偶聯(lián)”法即雙酶雙底物偶聯(lián)法，需要脫氫酶以及輔底物參與氧化型輔酶NAD(P)+轉化為還原型輔酶NAD(P)H，或將還原型輔酶轉化成氧化型。目前已報道的脫氫酶包括甲酸脫氫酶（FDH）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（GDPH）、葡萄糖脫氫酶（GDH）及醇脫氫酶（ADH）等。對應的輔底物分別為甲酸、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖、乙醇和異丙醇等（表1）。Liu 等[56]成功構建了羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶共表達的重組大腸桿菌，在水-有機兩相反應體系中催化4-氯-3-氧代丁酸乙酯（COBE）不對稱還原，(S)-4-氯-羥基丁酸乙酯(S)-CHBE 的產(chǎn)率為97.2%，e.e.為99%。“底物-偶聯(lián)”法即單酶雙底物輔酶再生體系，與“酶-偶聯(lián)”法相比較為簡單，僅需一種羰基還原酶同時催化羰基不對稱還原與輔酶再生，具有較高的催化效能，該技術常用的輔底物有異丙醇、乙醇等[55]。Zhang 等[57]利用來源于Lactobacillus kefiri 的羰基還原酶，構建酶-輔酶共固定化技術，以異丙醇為底物實現(xiàn)輔酶循環(huán)利用，催化(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯的合成，底物濃度達200g/L，無需外源輔酶添加，固定化酶重復利用40 批次，各批次產(chǎn)物產(chǎn)率均大于96%，e.e.＞99%。

表1 “酶-偶聯(lián)”法輔底物再生體系

4 立體選擇性羰基還原酶在手性醇醫(yī)藥中間體合成中的應用

4.1 降血脂藥物

他汀類藥物是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑，可通過抑制肝臟內膽固醇合成降低低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）濃度，是治療高膽固醇血癥的首要藥物種類。阿托伐他汀鈣是第三代全合成他汀藥物，降血脂效果突出，在心腦血管疾病防治領域應用廣泛，是目前唯一累積銷售額超過1500 億美元的處方藥。6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯是生產(chǎn)阿托伐他汀鈣的關鍵雙手性醇中間體，構成阿托伐他汀鈣的藥效基團。由于其含有兩個手性羥基中心、四個對映異構體，立體選擇性構筑難度極大。傳統(tǒng)的手性羥基合成方法是以硼氫化物為還原劑，利用手性過渡金屬催化劑催化羰基不對稱還原。該方法立體專一性不足，導致反應過程非對映誘導不充分、產(chǎn)物光學純度低，且該反應存在需深低溫等苛刻反應條件、硼氫化物易燃易爆、安全隱患大、硼化物廢物處理困難、生產(chǎn)成本昂貴等突出問題。采用羰基還原酶順序催化構建雙手性羥基（如圖5），代表了阿托伐他汀鈣雙手性醇中間體合成技術開發(fā)與應用的發(fā)展方向。

阿托伐他汀鈣第一個手性羥基的構建是以4-氯-3-氧代丁酸乙酯（COBE）為原料，酶促不對稱還原制備(S)-4-氯-羥基丁酸乙酯(S)-CHBE。Codexis 公司及其他研究團隊[58-61]利用含羰基還原酶的假絲酵母、畢赤酵母、念珠菌等成功進行了(S)-CHBE 的不對稱還原。Cai 等[62]描述了來自Candida albicans NADPH 依賴型山梨糖還原酶的生物催化過程，可將2.5mol/L 的COBE 轉化為(S)-CHBE，產(chǎn)率為93.6%，e.e.為99.6%。Wang等[9]用含有來自于Streptomyces coelicolor 還原酶的E.coli BL21工程菌細胞催化合成(S)-CHBE，采用2-丙醇進行輔酶再生，3.6mol/L COBE 在水/甲苯雙相系統(tǒng)反應22h，產(chǎn)率為93%，e.e.＞99%。Luo 等[63]通過基因挖掘手段獲得羰基還原酶BsCR，催化4-氯乙酸乙酯不對稱還原，(S)-CHBE收率達到89.9%，e.e.＞99%。最近，Yang 等[64]將來自Stenotrophomonas maltophilia 的SmADH31 與來自Bacillus subtilis 的葡萄糖脫氫酶共表達并催化合成(S)-CHBE，660g/L（4.0mol/L）的底物完全轉化，產(chǎn)物e.e.＞99%，時空產(chǎn)率達2664g/(L·d)，顯示了在(S)-CHBE 工業(yè)生產(chǎn)中的良好應用潛力。

6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯的第二個手性羥基是以(R)-6-氰基-3-羥基-5-羰基己酸叔丁酯（R-HN）為底物，利用羰基還原酶不對稱還原構筑。Luo 等[5,65]從K.lactis XP1461中挖掘一株野生型醛酮還原酶KlAKR，催化R-HN 立體選擇性還原，產(chǎn)物d.e.和e.e.值均大于99%。通過兩輪位點飽和誘變，KlAKR 的催化效率（kcat/Km）提高了11.25 倍。基于來源于K. marxianus ZJB14056 的醛酮還原酶KmAKR 進行定向改造，獲得突變酶KmAKRW297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M，與GDH 構建輔酶再生耦聯(lián)體系，可催化450g/L底物濃度7h完全轉化，產(chǎn)物d.e.＞99.5%，時空產(chǎn)率為1.24kg/(L·d)[66-68]。Gong 等[48]使 用1g/L LbCRM8和 葡 萄 糖 脫 氫 酶（BmGDH）共表達的凍干大腸桿菌細胞，6h 內催化300g/L R-HN完全轉化，產(chǎn)物d.e.＞99.5%，時空產(chǎn)率為1.05kg/(L·d)。Wu 等發(fā)現(xiàn)了來自于Acinetobacter baylyi ATCC 33305 的二酮還原酶（rDKR），能夠立體選擇性還原(3R,5S)-6-羥基-3,5-O-異亞丙基- 3,5-二羥基己酸酯，d.e.和e.e.均大于99.5%。為了使該酶可用于工業(yè)用途，以葡萄糖為共底物，可以在3h內完成轉化，底物濃度為5g/L，產(chǎn)率為83.9%。進一步降低成本構建并優(yōu)化了由重組DKR和葡萄糖脫氫酶組成的共表達體系，可以催化80g/L 的 底 物[69-71]。 He 等[72]利 用 來 源 于Lactobacillus kefir DSM 20587 的 醇 脫 氫 酶LkADH 催化6-氯-3,5-二氧代己酸叔丁酯（CDOH）到(S)-6-氯-3-羥基-5-羰基己酸叔丁酯[(S)-CHOH]的不對稱還原，底物濃度為100g/L，產(chǎn)率達94%，e.e.＞99.5%。

瑞舒伐他汀鈣是新一代他汀藥物，具有療效顯著、副作用小的突出優(yōu)勢，自上市以來臨床應用迅速擴大，被譽為“超級他汀”。(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯[(3R,5S)-CDHH)]是降血脂藥物瑞舒伐他汀鈣手性側鏈合成的重要手性砌塊。羰基還原酶催化(S)-6-氯-5-羥基-3-氧代己酸叔丁酯[(S)-CHOH]不對稱還原合成(3R,5S)-CDHH 具有反應條件溫和、立體選擇性高等特點。Wu 等[73-74]從羰基還原酶RtSCR9 出發(fā)，通過隨機突變和定點飽和突變獲得突變體mut-Gln95As、mut-Ile144Lys和mut-Phe1156Gln，比酶活分別提高了2.47、4.00和2.26 倍，催化效率kcat/Km分別提高了1.93 倍、3.15 倍和1.97 倍。催化1mol/L(S)-CHOH 不對稱還原，產(chǎn)率達98.9%，e.e.＞99%，最高時空產(chǎn)率為542.83mmol/(L·h·g)濕細胞。在此基礎上，Zheng等[75]在大腸桿菌工程菌中構建羰基還原酶-葡萄糖脫氫酶共表達體系，實現(xiàn)輔酶高效再生，并采用底物分批補料技術，總底物濃度達400g/L，反應12h，底物轉化率達98.5%，產(chǎn)物e.e.值大于99%。

依澤替米貝（Ezetimibe）也稱依折麥布，是首個β-內酰胺單環(huán)類的膽固醇吸收抑制藥物[76]，廣泛應用于心腦血管疾病的治療。(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羥基戊酸]-4-苯基-1,3-唑烷-2-酮[(S)-ET-5]手性中間體的制備是合成依澤替米貝的關鍵步驟（圖6）。Liu等[77]將Lactobacillus kefir 來源的羰基還原酶CR125在E.coli工程菌中異源過表達，在水-甲苯雙相反應體系中對150g/L前體酮底物進行不對稱還原合成(S)-ET-5，轉化率99.1%，d.e.值大于99.9%。進一步構建羰基還原酶CR125-葡萄糖脫氫酶GDH 雙酶共表達系統(tǒng)，通過對雙酶催化體系優(yōu)化，同時實現(xiàn)了羰基不對稱還原與輔酶高效再生，底物濃度225g/L，輔底物葡萄糖濃度150g/L，反應12h，產(chǎn)物得率達98.9%，e.e.＞99.9%，最高時空產(chǎn)率為24.7g/(L·d)，為目前文獻報道最高水平[78]。

4.2 碳青霉烯類抗生素

圖5 阿托伐他汀雙手性醇的酶法合成路線

圖6 依澤替米貝關鍵手性中間體（S）-ET-5的酶法合成

新一代的β-內酰胺類抗生素青霉烯和碳青霉烯具有廣泛的抗菌譜、突出的抗菌活性以及對大多數(shù)β-內酰胺酶的穩(wěn)定性，被認為是治療嚴重醫(yī)院感染的“一線藥物”。4-乙酰氧基氮雜環(huán)丁酮[(2R,3R)-3-(R)-1-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)乙基-4-氧雜氮雜丁-2-基乙酸酯]是生產(chǎn)青霉烯和碳青霉烯的關鍵手性中間體，其中(R)-1,3-丁二醇[(R)-2]則是生產(chǎn)4-乙酰氧基氮雜環(huán)丁酮衍生物的關鍵前體物質[圖7(a)]。(R)-2 的生物合成主要是通過不對稱還原4-羥基-2-丁酮(1)制備。Matsuyama等[79]利 用 Candida parapsilosis IFO 1396 和Kluyveromyces lactis IFO 1267細胞還原前體酮1分別產(chǎn)生(R)-和(S)-2，e.e.分別為97%和99%。Yamamoto等[80]報道了一種來自C.parapsilosis 的新型(S)-特異性醇脫氫酶CpSADH，催化(R)-2 合成的產(chǎn)量達72.6g/L，e.e.為95%。此外，Zheng 等[81]分離獲得C. krusei ZJB-09162 菌株，實現(xiàn)了酶催化1 不對稱還原為(R)-2，底物濃度45.0g/L，轉化率為83.9%，產(chǎn)物e.e.為99.0%。

(2S,3R)-2-苯甲酰胺甲基-3-羥基丁酸酯衍生物3a-3c[圖7(b)]也是合成4-乙酰氧基氮雜環(huán)丁酮的關鍵中間體。傳統(tǒng)的(2S,3R)-4a-4c 的制備是使用釕催化劑催化外消旋3a-3c的不對稱拆分，反應成本昂貴，反應條件苛刻[82]。條件溫和、反應成本低廉的酶促合成過程已有報道[83-84]。Rimoldi 等[85]使用P. glucozyma CBS 5766 和K. marxianus CBS 1553細胞以高產(chǎn)率和高立體選擇性將3c 還原為4c，前者生成的(2R,3S)-4c具有＞99%e.e.和70%d.e.，而后者提供催化制備的(2R,3R)-4c 具有高于99%的e.e.和88%的d.e.。Codexis公司利用來源于Lactobacillus brevis 的醇脫氫酶作為催化劑催化3a 合成(2S,3R)-4a，e.e.＞99%，d.e.＞89%[86]。Chen等[8]從Burkholderia gladioli鑒定一株新型羰基還原酶BgADH2，它可用于不對稱合成(2S, 3R)-4a，e.e.為99%，d.e.為98.5%。

(R)-3-羥基硫雜環(huán)戊烷是碳青霉烯藥物舒侖培南合成的關鍵中間體[87]。Codexis 公司針對來源于Lactobacillus kefir 的羰基還原酶ADH 進行蛋白質工程改造，獲得系列突變體，對四氫噻吩-3-酮不對稱還原的立體選擇性大幅提升，產(chǎn)物(R)-3-羥基噻吩e.e.＞99%。該工藝經(jīng)放大至100kg 水平驗證后，已應用于工業(yè)生產(chǎn)[88]。

4.3 抑郁癥治療藥物

圖7 4-乙酰氧基氮雜環(huán)丁酮手性中間體的生物催化制備工藝［84-85］

度洛西汀，化學名(S)-N-(+)-甲基-3-(1-萘氧基)-3-(2-噻吩基)-丙胺鹽酸鹽，是一種新型的抗抑郁藥，為5-羥色胺和去甲腎上腺素再攝取的雙重抑制劑，不僅可以治療抑郁癥，還可用于治療壓力性尿失禁、肥胖和糖尿病周圍神經(jīng)病性疼痛，對抑郁癥伴發(fā)慢性疼痛也有一定的療效。度洛西汀合成過程中，N,N-雙甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)-1-丙胺的還原反應是一個關鍵步驟。美國Eli Lilly 公司首先報道了由前體酮5a-5f 不對稱還原制備(S)-度洛西汀手性醇中間體6a-6f 的化學合成技術[89]（圖8）。但該技術存在反應條件嚴苛、產(chǎn)物光學純度低、產(chǎn)率低、生產(chǎn)成本居高不下等問題。利用羰基還原酶催化制備手性醇中間體6a-6f具有反應條件溫和、產(chǎn)物光學純度高、生產(chǎn)成本低廉等突出優(yōu)點。Soni 等[90]篩選到了一株含羰基還原酶的Candida viswanathii，并應用于(S)-6b 的不對稱合成，底物轉化率達81%，產(chǎn)物e.e.＞99%。Codexis公司開發(fā)羰基還原酶ADH 突變體，大幅提升不對稱還原制備(S)-6a的活性，進一步采用異丙醇為輔底物實現(xiàn)NAD(P)H 再生，底物5a 濃度達150g/L，產(chǎn)物 產(chǎn) 率 大 于90%， e. e. ＞99%[91]。 Wang 等[92]從Candida albicans XP1463 （CCTCC M 2014382） 中鑒定一株醛酮還原酶CaAKR，對度洛西汀中間體的催化活性高達160U/mg，產(chǎn)物e.e.值＞99%。Chen等[10]篩選獲得一株來源于R. toruloides 的羰基還原酶，利用葡萄糖構建輔酶再生體系，底物5a 濃度為100g/L，轉化率100%，產(chǎn)物e.e.值＞99%。

貝氟沙通（Befloxatone），化學名5(R)-(甲氧甲基)-3-[4-[4,4,4-三氟基-3(R)-羥基丁氧基]苯基]-2-唑烷酮，是一種唑烷酮衍生物，可選擇競爭性抑制人體內單胺氧化A（MAO-A），阻止腦內5-羥色胺和去甲腎上腺素降解，同時增加腦內突觸間隙5-羥色胺和去甲腎上腺素的濃度，起到強效抗抑郁作用[93]。4,4,4-三氟乙酰乙酸乙酯（EOTB）不對稱還原制備(R)-4,4,4-三氟-3-羥基丁酸乙酯[(R)-EHTB]為貝氟沙通合成的關鍵步驟。Zhang等[94]首次利用含NADPH依賴型羰基還原酶與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（GPDH）的Bacillus pumilus Phe-C3 細胞催化EOTB 合成(R)-EHTB，底物濃度為60mmol/L，產(chǎn)率為67%，e.e.達95% （圖9）。He 等[95]利用Saccharomyces uvarum SW-58 全細胞為催化劑，構建水-有機兩相反應體系，底物EOTB 濃度0.2mmol/L，反應4h，轉化率達85%，產(chǎn)物e.e.為85.2%。含羰基還原酶的Kluyveromyces marxianus 細胞也被應用于(R)-EHTB的合成，但產(chǎn)物產(chǎn)率與e.e.值 均 較 低[96]。 Kara 等[97]最 近 利 用 來 源 于Lactobacillus kefir 的ADH evo-1.1.200 在無水介質中催化該反應，底物濃度5mmol/L，反應24h，轉化率為39.2%，選擇性明顯提高（e.e.＞99.9%）。

圖8 度洛西汀關鍵手性中間體的酶法合成［89］

圖9 貝氟沙通手性中間體不對稱合成［94-95］

丁螺環(huán)酮是一種強效的5-羥色胺5HT1A受體部分激動劑，在腦中側縫際區(qū)與5-HT1A受體高度結合，能減少體內5-羥色胺受體敏感性起到抗抑郁的作用。丁螺環(huán)酮無鎮(zhèn)靜、催眠、中樞性肌肉松弛等副作用，無成癮性，廣泛應用于抑郁癥、焦慮癥等的臨床治療。丁螺環(huán)酮在體內代謝活化為6-羥基丁螺環(huán)酮，并發(fā)揮藥理功能，研究顯示(R)-6-羥基丁螺環(huán)酮與(S)-6-羥基丁螺環(huán)酮在藥效、藥物代謝動力學與毒副作用方面并無明顯差異，6-羥基丁螺環(huán)酮成為潛在的抗抑郁藥物。Patel 等[98]從150余株菌株中篩選到含羰基還原酶Rhizopus stolonifer SC 13898 細胞，催化6-酮丁螺環(huán)酮不對稱還原合成(S)-6-羥基丁螺環(huán)酮，產(chǎn)率達53%，e.e.＞96.6%。同時篩選到的Candida maltose SC 16112可催化制備(R)-6-羥基丁螺環(huán)酮，產(chǎn)率大于57%，e.e.＞97%。Goldberg 等[99]從Hansenula polymorpha SC 13845中篩選得到一株NADPH 依賴性羰基還原酶，與來源于Saccharomyces cerevisiae 的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶重組共表達后，可催化50g/L 6-酮丁螺環(huán)酮還原制備(R)-6-羥基丁螺環(huán)酮，產(chǎn)率與e.e.值均達99%以上。另外一株來源于Pseudomonas putida SC 16269 的羰基還原酶，可在相同底物濃度下催化制備(S)-6-羥基丁螺環(huán)酮，產(chǎn)率＞98%，e.e.＞96.9%。

陳衛(wèi)平對后勤保障的期望，就是預防患者就醫(yī)過程的不安全因素，避免二次傷害，減少了醫(yī)院在患者安全方面的財務支出。

4.4 抗哮喘藥物

孟魯斯特（Montelukast）是第三代白三烯受體拮抗劑藥物，由Merk 公司開發(fā)，用于成人及兒童哮喘的預防和長期治療，具有療效穩(wěn)定持久、安全性高、副作用少等突出優(yōu)勢。由2-[3-[3-[(E)-2-(7-氯-2-喳琳基)乙烯基]苯基]-3-氧代丙基]苯甲酸甲酯（酮酯M）不對稱還原制備2-[3-(S)-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羥基丙基]苯甲酸甲酯[(S)-羥酯]是孟魯司特合成的關鍵環(huán)節(jié)（圖10）。1996 年，Microbacterium sp.MB 5614 被首次應用于(S)-羥酯的合成，產(chǎn)物e.e.＞95%[100]。Codexis 公司基于羰基還原酶ADH 進行定向進化，開發(fā)了系列突變體，催化(S)-羥酯合成效率提高了2000倍，底物濃度為100g/L 時，產(chǎn)率為99.3%，e.e.達99.9%[101]。來源于 Candida albicans XP1463 (CCTCC M 2014382)的醛酮還原酶CaAKR，也對(S)-羥酯不對稱合成展現(xiàn)出高催化活性與立體選擇性，比酶活達145U/mg，產(chǎn)物e.e.＞99%[92]。

(R)-(-)-3-奎寧醇含有一個含氮雙環(huán)，是抗哮喘藥物他沙利定、瑞伐托酯等藥物合成的重要前體。不同的(R)-(-)-3-奎寧醇化學制備方法包括外消旋3-奎寧醇的動力學拆分、3-奎寧酮不對稱還原等都已獲報道[102-103]。Chen 等[104]利用奎寧酮還原酶（QNR）與葡萄糖脫氫酶（GDH）制備酶聚集體催化劑，催化3-奎寧酮不對稱還原，底物濃度33g/L，反應3h，轉化率達100%，產(chǎn)物e.e.＞99.9%。該團隊進一步構建了羰基還原耦聯(lián)輔酶再生全細胞催化劑，催化(R)-(-)-3-奎寧醇的合成，反應速率較天然純酶提升3 倍，底物濃度達468g/L，產(chǎn)物e.e.＞99.9%，時空產(chǎn)率達1505.5g/(L·d)，均為文獻報道最高值，具有良好的應用前景[105]。

4.5 抗高血壓藥物

(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯是合成重要的抗高血壓藥物血管緊張素轉換酶（angiotensinconverting enzyme，ACE）抑制劑，如貝那普利、賴諾普利和依那普利等的重要手性中間體（圖11）。包括外消旋2-羥基-4-苯基丁酸乙酯動力學拆分、2-氧代-4-苯基丁酸乙酯的不對稱還原等在內的方法都已得到報道。具有不對稱還原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯活性的菌株有Candida boidinii CIOC21、 C. krusei SW2026、 Rhodotorula mucilaginosa CCZU-G5 與C. magnoliae CGMCC 2.1919 等多種[106-110]。Qian 等[111]將來自C.glabrata 的酮還原酶CgKR2重組表達于P.pastoris工程菌細胞，并進行(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的不對稱合成，底物濃度1.0mol/L 時，產(chǎn)物產(chǎn)率達77.9%，e.e.為97.3%。Wang 等[112]對Thermotoga maritima 來源的羰基還原酶進行半理性設計改造，獲得突變體Tm1743，催化2-氧代-4-苯基丁酸乙酯還原的選擇性由(S)型轉變?yōu)?R)型，產(chǎn)物e.e.值由76.5%(S)轉變 為99.6%(R)，催 化 效 率 提 升 至0.81mL/(mol·s)。Candida glabrata 來源的羰基還原酶與葡萄糖脫氫酶BmGDH(M6)耦聯(lián)以提高輔酶再生效率，催化2-氧代-4-苯基丁酸乙酯的不對稱還原，總轉化數(shù)（total turnover number） 達18000，應 用 前 景 巨大[113]。羰基還原酶不對稱合成(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯技術反應效率高、成本低廉、綠色環(huán)保，代表了ACE抑制劑類藥物合成技術的發(fā)展方向。

4.6 抗凝血藥物

圖10 羰基還原酶不對稱還原制備孟魯司特手性中間體［100］

圖11 貝那普利、利諾普利和依那普利中間體合成［104］

(S)-氯吡格雷（Plavix）是一種選擇性血小板凝集抑制劑，由法國賽諾菲（Snaofi）公司開發(fā)，用于治療因血栓引起的心肌梗死和缺血性卒中，是目前世界上最暢銷的藥物之一。在已報道的(S)-氯吡格雷合成途徑中，(R)-鄰氯扁桃酸甲酯的合成是關鍵步驟（圖12）。Jeong等[114]利用鄰氯苯乙酮酸甲酯為底物，以Saccharomyces cerevisiae全細胞為催化劑，不對稱還原獲得(R)-鄰氯扁桃酸甲酯，e.e.達96.1%。一株來源于Thermus thermophilus 的羰基還原酶也得到純化與鑒定，使用該酶催化鄰氯苯乙酮酸甲酯的還原，產(chǎn)率達95%，產(chǎn)物e.e.為92%[115]。Ma 等[116]對C. glabrata 基因組進行分析，挖掘獲得一株新型羰基還原酶CgKR1，在與葡萄糖脫氫酶共表達構建輔酶再生體系后，催化鄰氯苯乙酮酸甲酯不對稱還原生成(R)-鄰氯扁桃酸甲酯，底物濃度達300g/L，產(chǎn)率為87%，e.e.達98.7%。Ni 等[117]將來源于Bacillus sp.的醛酮還原酶與葡萄糖脫氫酶共表達后，催化(R)-鄰氯扁桃酸甲酯的合成，底物濃度進一步提升至500g/L，時空產(chǎn)率達812g/(L·d)，e.e.＞99%。Xu 等[39]發(fā)現(xiàn)，甘油可提升NADPH 依賴型醛酮還原酶YtbE 的熱穩(wěn)定性與操作穩(wěn)定性，在1mol/L底物濃度下，使(R)-鄰氯扁桃酸甲酯的產(chǎn)率由70.5%提高到96.6%。Zheng 等[118]對羰基還原酶CgKR1 進行分子改造，獲得CgKR1-F92C/F94W，用于系列手性醇醫(yī)藥中間體的制備，其中催化(R)-鄰氯扁桃酸甲酯合成的活性提高了8倍。

凝血酶直接作用于血液凝固過程的最后一步，促使血漿中的可溶性纖維蛋白原轉變成不溶的纖維蛋白，并可誘發(fā)血小板聚集及繼發(fā)釋放反應，是抗凝血藥物開發(fā)的重要靶點。(R)-3,3-二甲基-2-羥基丁酸[(R)-DHBA]是凝血酶抑制劑合成的關鍵中間體。 Nelson 等[119]利用商業(yè)化醛酮還原酶KRED1001，以3,3-二甲基-2-氧代丁酸乙酯為底物，經(jīng)羰基不對稱還原、產(chǎn)物分離純化及皂化脫酯后，產(chǎn)物(R)-DHBA的收率達82%，e.e.達99.5%。

4.7 抗癲癇藥物

他侖帕奈（Talampanel）是新型癲癇治療藥物，作為一種高選擇性、非競爭性的α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid（AMPA）型受體拮抗劑，可通過靶向抑制神經(jīng)突觸后膜AMPA受體的谷氨酸活性，減少與癲癇發(fā)作相關神經(jīng)元的過度興奮，從而達到預防和治療癲癇疾病的目的。(S)-α-甲基-1,3-苯并二唑-5-乙醇[(S)-MBE]是他侖帕奈合成的關鍵中間體，利用羰基還原酶催化3,4-亞甲基二氧苯基丙酮（MDA）不對稱還原制備(S)-MBE 的技術受到科學家的關注。Zygosaccharomyces rouxii 和Debaryomyces hansenii 首先被用于催化合成(S)-MBE，產(chǎn)率可達到90%以上，e.e.＞99%[120]。Simon 等[121]研究了多種羰基還原酶催化還原MDA 的能力，獲得兩種高活性羰基還原酶：來源于Rhodococcus ruber的ADH-A和來源于Theromanaerobacter的ADH-T，底物濃度75mmol/L，(S)-MBE 產(chǎn)率達95%以上，e.e.＞99%。Haq 等[122]利用來源于Z.rouxii 的酮還原酶構建細胞催化劑，同步催化羰基還原與輔酶再生，用于(S)-MBE 的合成，反應效率較游離酶大幅提升，產(chǎn)率達95%，e.e.＞99%。

圖12 （S）-氯吡格雷手性中間體的酶法合成

4.8 非甾體抗炎藥物

布洛芬類藥物是非甾體抗炎藥物的重要種類，作為環(huán)氧化酶的非特異性抑制劑，可通過花生四烯酸途徑抑制前列腺素的合成，從而起到抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛的作用。(2S)-2-芳丙醇（8a-8f）是布洛芬類藥物合成的關鍵手性中間體（圖13）。2007年，Giacomini 等[123]發(fā)現(xiàn)馬心醇脫氫酶（HLADH）可在有機溶劑或磷酸鹽緩沖液中催化不對稱拆分反應制備8a 和8b。接下來，針對未反應的另一構型醛基底物，科學家開發(fā)了化學消旋技術，將原料利用率突破了傳統(tǒng)動力學拆分技術理論轉化率不高于50%的限制[124]。來源于Sulfolobus solfataricus的羰基還原酶SsADH-10 被鑒定與純化，并用于8a-8f 的動力學拆分制備，展現(xiàn)了較高的產(chǎn)率與良好的立體選擇性[125]。接下來純化的與固定化的HLADH 被報道用于催化2-芳基丙醛(7a-7f)的不對稱還原制備(2S)-2-芳丙醇8a-8f[124,126]，展現(xiàn)了羰基還原酶在布洛芬類藥物合成中的良好應用潛力。

圖13 酶法不對稱合成布洛芬類藥物中間體［124-126］

4.9 抗癌藥物

紫杉醇是二萜生物堿類化合物，通過穩(wěn)定細胞微管結構抑制癌細胞的有絲分裂并觸發(fā)細胞凋亡，進而有效阻止癌細胞的增殖，起到抗癌作用。臨床應用于乳腺癌、卵巢癌、頭頸癌、肺癌等的治療。(2R,3S)-N-苯甲酰-3-苯基異絲氨酸乙酯[(2R,3S)-10]是紫杉醇C-13 側鏈合成的手性中間體。關于(2R,3S)-10 的酶法制備技術研究開始較早，1994年，酵母細胞催化的2-酮-3-(N-苯甲酰氨)-3-苯基異絲氨酸乙酯(9)不對稱還原制備(2R,3S)-10過程（圖14）已經(jīng)得到報道[127]。Patel等[128]利用含羰基還原酶的Hansenula polymorpha 13865 與H. fabianii 13894 細胞催化(9)不對稱還原制備(2R,3S)-10，產(chǎn)率＞80%，e.e.＞98%。近年來，來源于Clostridium acetobutylicum 的一種新型羰基還原酶被用于催化3-苯基-2-氯-3-氧代丙酸乙酯(11)的羰基不對稱還原，制備紫杉醇C-13側鏈合成的手性砌塊(2S,3R)-2-氯-3-羥基-3-苯基丙酸乙酯[(2S,3R)-12]，產(chǎn)率達95%，e.e.達99%，d.e.為95%[129]。

圖14 紫杉醇側鏈中間體的生物還原制備工藝［127，129］

布立尼布是一種新型血管內皮細胞生長因子VEGF 受體與成纖維細胞生長因子FGF 受體拮抗劑，臨床用于肝癌及其他實體瘤的治療。(R)-1-[4-(4-氟-2-甲基-1H-吲哚-5-乙氧基)-5-甲基吡格[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-乙氧基]-丙烷-2-醇[(R)-MPO]是布立尼布合成的重要前體。Codexis 公司利用基于醇脫氫酶ADH-LK 和ADH-LB 開發(fā)的多個羰基還原酶突變體催化1-[4-(4-氟-2-甲基-1Hindol-5-吲哚)-5-甲基-吡格[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-乙氧基]-丙烷-2-酮的羰基不對稱還原，在以葡萄糖或異丙醇為輔底物促進輔酶再生的條件下，底物濃度12g/L，產(chǎn)物(R)-MPO e.e.＞99%[132]。

4.10 抗艾滋病藥物

阿扎那韋是蛋白酶抑制劑類的抗逆轉錄病毒藥物，用于治療人類免疫缺陷病毒（HIV）的感染。(1S,2R)-[3-氯-2-羥基-1-(苯甲基)丙基]氨基甲酸,1,1-二甲基乙酯[(1S,2R)-CADE]是阿扎那韋合成的關鍵手性中間體。生物法合成催化(1S,2R)-CADE技術已得到開發(fā)。采用R. erythropolis SC 13845 細胞，可催化(1S)-[3-氯-2-氧代-1-(苯甲基)丙基]氨基甲酸,1,1-二甲基乙酯不對稱合成(1S,2R)-CADE，產(chǎn)率與e.e.值分別達95%與99.4%[133]。Wu等[134]基于來源于Novosphingobium aromaticivorans 的短鏈脫氫酶NaSDR 進行分子改造，獲得突變體muSDR(G141V/I195L)，kcat較野生酶提高3.57倍，于甲苯-水兩相反應體系中，底物濃度500mmol/L，底物基本轉化，e.e.＞99%。

4.11 腎上腺素受體激動劑

(R)-地諾帕明、(R)-(-)-α-(3,4-二甲氧基苯乙基氨甲基)-4-羥基苯甲醇與(R)-沙美特羅、(R)-4-羥基-α-1-[[[6-(4-苯基丁氧基)己基]氨基]甲基]-1,3-苯二甲醇是新型選擇性β-腎上腺素受體激動劑，是充血性心衰、哮喘的重要治療藥物。以前體酮13a-13e為底物，可通過酶促不對稱羰基還原反應制備對應的手性醇中間體(R)-14a-14e，并進而合成(R)-地諾帕明與(R)-沙美特羅（圖15）。來源于Daucus carota根部的羰基還原酶最先報道用于催化(R)-14a 與(R)-14b 手性醇的高立體選擇性合成[135]。以前體酮13c 和13d 為底物，以Rhodotorula rubra 細胞為催化劑，可立體選擇性制備(R)-14c 和(R)-14d，產(chǎn)率達78%～80%，e.e.值為95%[136]。近年來Rhodococcus sp.1-0130細胞被報道可用于催化底物13d、13e分別制備(R)-14d與(R)-14e，并進一步用于(R)-沙美特羅的合成，產(chǎn)物e.e.＞99%[137]。

圖15 合成（R）-地諾帕明和（R）-沙美特羅中間體的生物還原過程［129-131］

其他手性純的α-鹵醇在β-腎上腺素受體激動劑的合成中也起著重要作用。含羰基還原酶的微生物細胞如Saccharomyces cerevisiae CGMCC 2.396、Aspergillus sydowii Ce19和Pichia minuta JCM 3622等對(R)-或者(S)-α-鹵醇的不對稱合成均具有良好的活性與立體選擇性[138-140]。Xu 等[141]利用來源于Kluyveromyces thermotolerans 的底物耐受性羰基還原酶KrtCR 催化多種前體酮制備手性α-鹵醇，當以苯氯乙酮為底物時，KrtCR 的催化轉化數(shù)達到5000，反應濃度達154g/L，產(chǎn)物濃度達92%，e.e.達99%。

(R)-苯腎上腺素[(R)-PE]是一種選擇性α1-腎上腺素受體激動劑，作為偽麻黃堿的安全性替代藥物，臨床上廣泛用于感冒等癥狀的緩解。Codexis公司利用基于Lactobacillus kefir ADH 改造獲得的系列羰基還原酶，催化1-(3-羥苯基)-2-(甲胺)乙酮（HPMAE）不對稱還原合成(R)-PE，相對原始酶，突變酶活力提升10 倍以上，產(chǎn)物e.e.可達99%以上[142]。 Peng 等[143]篩 選 獲 得 來 源 于 Serratia marcescens BCRC 10948的短鏈脫氫酶SM_SDR可立體選擇性制備(R)-PE，底物濃度為10mmol/L，產(chǎn)物產(chǎn)率達51.06%，e.e.＞99%，時空產(chǎn)率達0.57mmol/h。進一步，利用SM_SDR，經(jīng)大腸桿菌重組表達與啟動子替換后，全細胞催化(R)-PE 合成的底物濃度提升至50mmol/L，產(chǎn)物e.e.＞99%，產(chǎn)率達47.5%，時空產(chǎn)率達1.98mmol/h[144]。而來源于S.quinivorans BCRC 14811 的短鏈脫氫酶催化制備(S)-PE 的e.e.＞99%,產(chǎn)率達86.6%，時空產(chǎn)率為20.2mmol/h[143]。

5 立體選擇性羰基還原酶在精細化工品合成中的應用

5.1 手性γ-戊內酯

γ-戊內酯（GVL）可用作樹脂溶劑、增塑劑、潤滑劑、燃料添加劑，并可用于香精、色素及燃料添加劑的合成。使用ADH 從乙酰丙酸甲酯生產(chǎn)γ-戊內酯已得到報道。Díaz-Rodríguez 等[145]使用分別來自Rhodococcus ruber 的ADH-A、Lactobacillus brevis 的LBADH和Ralstonia sp.的RasADH催化合成一系列手性純的羥基酯和內酯，轉化率＞99%，產(chǎn)物e.e.＞99%。

5.2 (2S,3S)-2,3-丁二醇

2,3-丁二醇是一種有具有廣泛工業(yè)應用前景的化學品，具有兩個鄰近立體中心的光學純2,3-丁二醇被用作手性化合物的重要組成部分。羰基還原酶能夠將二乙酰還原為乙酰丁酸酯，然后還原為2,3-丁二醇的不同異構體[146]（圖16）。Wang 等[147]分離獲得的Rhodococcus erythropolisWZ010菌株，可將二乙酰還原為光學純的(2S,3S)-2,3-丁二醇，從該菌株中分離純化的羰基還原酶催化制備(2S,3S)-2,3-丁二醇不對稱合成，產(chǎn)率為98%，e.e.為100%。He 等[148]構建了大腸桿菌工程菌共表達(2S,3S)-2,3-丁二醇脫氫酶和甲酸脫氫酶，用于從(S)-3-羥基丁酮生產(chǎn)(2S,3S)-2,3-丁二醇，產(chǎn)率達38.41g/L，e.e.達98.03%。

圖16 羰基還原酶催化不對稱合成（R）-1，3-丁二醇［147］

5.3 苯乙醇

光學活性苯乙醇及其衍生物是合成手性醇藥物和精細化學品的重要中間體。Singh 等[149]使用Metschnikowia koreensis 全細胞來不對稱還原具有各種取代基的苯乙酮，以25mmol/L 苯乙酮為底物，轉化率可達92%，產(chǎn)物手性苯乙醇e.e.＞99%。此外，Vitale 等[150]發(fā)現(xiàn)一種耐熱Kluveromyces marxianus 菌株，可用于不同的苯乙酮衍生物生物還原為(S)-醇。來自hermus thermophilusHB27 的短鏈脫氫酶可將2,2,2-三氟苯乙酮不對稱還原為(S)-α-(三氟甲基)芐醇，e.e.為96%[151]。從Thermococcus kodakarensis KOD1 中純化的羰基還原酶TkADH 可催化2,2,2-三氟苯乙酮還原為(R)-2,2,2-三氟-1-苯基乙醇，也顯示了良好的立體選擇性(產(chǎn)物e.e.＞99.6%)[152]。Zhang等[153-155]從Candida parapsilosis中發(fā)現(xiàn)了一種(S)-選擇性的羰基還原酶SCRII，通過定點突變獲得E228S，進一步與葡萄糖脫氫酶共表達后，在12h 內，產(chǎn)物(R)-苯乙醇的化學純度為99.5%，產(chǎn)率為92.2%。而后將E228S/SCRII 和GDH共同固定在S.cerevisiae AN120 osw2Δ中，在乙酸乙酯中經(jīng)4～6 次循環(huán)后，產(chǎn)率超過70%且e.e.＞99%。Qin 等[156]對來自于Candida glabrata 的CgKR1進行工程改造，可催化不同取代基的α-鹵素取代苯乙酮（e.e.＞99%）。

6 結語

本文介紹了立體選擇性羰基還原酶的催化機制、篩選與改造技術及在手性醇醫(yī)藥與精細化工品合成中的應用。作為工業(yè)應用最為廣泛的氧化還原酶，羰基還原酶在心腦血管疾病、抑郁癥、重癥感染等疾病治療藥物及手性苯乙醇等精細化工品的綠色制造技術發(fā)展中起到重要作用。隨著社會和經(jīng)濟的不斷發(fā)展，手性藥物與精細化學品的需求迅速增加，手性醇作為醫(yī)藥與化工中間體的重要性將不斷增強。立體選擇性羰基還原酶是手性醇制造領域最重要和最有前景的生物催化劑，基于生物信息學和人工智能的數(shù)據(jù)挖掘、篩選與探索酶的活性與立體選擇性的分子機制，以期獲得適合工業(yè)化強度生產(chǎn)的魯棒性生物催化劑。近年來，多酶組合催化及多手性中心復雜化合物的合成成為研究熱點，實現(xiàn)高性能、精準調控的羰基還原酶催化劑的創(chuàng)制，為我國手性藥物制造業(yè)轉型升級和可持續(xù)發(fā)展提供重要助力。