楊 婧，王傳華，曾春函，王洋洋，侯云波，楊 林

(1 三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部工程研究中心，湖北宜昌443002；2 湖北省三峽地區(qū)生態(tài)保護(hù)與治理國(guó)際聯(lián)合研究中心，湖北宜昌443002；3 三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，湖北宜昌443002；4 貴州健康職業(yè)學(xué)院，貴州銅仁 554300)

天麻(GastrodiaelataBl.)是一種具有很高藥用價(jià)值的異養(yǎng)型蘭科植物[1]，需要與萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌共生才能完成生活史[2]。蜜環(huán)菌隸屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycota)傘菌目(Agaricales)小皮傘科(Marasmiaceae)蜜環(huán)菌屬[Armillaria(Vahl) P.Kumm.][3]，廣泛分布于歐洲、亞洲、非洲、北美洲等地。蜜環(huán)菌具有兼性寄生特性，需從朽木或活樹(shù)根汲取營(yíng)養(yǎng)[4-5]，目前世界上已知有近40 個(gè)生物種[6]，部分種是重要的食藥用真菌[7]。天麻與蜜環(huán)菌具有特殊的共生關(guān)系，天麻球莖一方面依賴于真菌的侵染而獲得營(yíng)養(yǎng)，另一方面又具有強(qiáng)有力的阻止或限制真菌侵染的防衛(wèi)機(jī)制以避免自身感病[8]。

海拔(溫度)是影響天麻生產(chǎn)的重要因素。天麻適宜在夏季涼爽且冬季溫和的環(huán)境中生長(zhǎng)[9]，其自然分布具有明顯的海拔地帶性，垂直分布的高度由南到北逐漸下降[10]，適宜溫度為-4～20 ℃[11]。外界溫度為14 ℃左右時(shí)，天麻開(kāi)始生長(zhǎng)；升高到20 ℃時(shí)，天麻進(jìn)入迅速生長(zhǎng)期；但達(dá)到28 ℃時(shí)，溫度會(huì)抑制天麻的生長(zhǎng)，因此，天麻的最適生長(zhǎng)溫度是15～24 ℃。另一方面，當(dāng)溫度低于8 ℃或高于28 ℃時(shí)，天麻將停止生長(zhǎng)，進(jìn)入休眠狀態(tài)[10,12-14]。生產(chǎn)實(shí)踐中，在低海拔地區(qū)栽培天麻常因蜜環(huán)菌過(guò)量繁殖導(dǎo)致其腐爛[15]，同時(shí)海拔不同也導(dǎo)致藥用化學(xué)物質(zhì)含量不同[16]。因此，深入研究溫度對(duì)天麻-蜜環(huán)菌共生關(guān)系的影響并揭示其作用機(jī)制，對(duì)提高天麻產(chǎn)量、改善天麻品質(zhì)具有重要意義。

天麻抵御蜜環(huán)菌的入侵機(jī)制中，多種消化酶和抗真菌蛋白扮演著重要角色。研究表明，天麻皮層的抗真菌蛋白(GAFP)是抵御蜜環(huán)菌入侵的主要物質(zhì)[17-20]，而皮層細(xì)胞與消化細(xì)胞溶酶體細(xì)胞釋放的消化酶及幾丁質(zhì)酶(EC3.2.1.14)在消化入侵菌絲流過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[10,21-22]。研究還發(fā)現(xiàn)，幾丁質(zhì)酶作為一種糖苷水解酶，在蜜環(huán)菌的生長(zhǎng)發(fā)育及其與天麻的共生過(guò)程中發(fā)揮重要作用[23-25]，而β-1,3-葡聚糖酶(EC3.2.1.39)在天麻初生球莖消化蜜環(huán)菌菌絲的過(guò)程中起重要作用[13]。同時(shí)，植物病理學(xué)的研究表明，一些酶類如多酚氧化酶(PPO,EC1.10.3.1)、苯丙氨酸解氨酶(PAL，EC4.3.1.5)，也參與植物的抗病過(guò)程。王曼玲等認(rèn)為，PPO在水稻、煙草、棉苗及蘋果抵御各種病菌的過(guò)程中起重要作用[26]，而植株感染真菌后PPO 活性明顯增強(qiáng)，且其活性沿著感染部位到未感染的邊緣有明顯的梯度變化[27]。另外，當(dāng)植物受到病原菌的侵染時(shí)，PAL活性也有明顯的變化，因此，PAL活性的變化與植物的抗病性也密切相關(guān)[28]。迄今，溫度變化對(duì)天麻抗侵染及消化酶系統(tǒng)影響的研究仍未見(jiàn)報(bào)道，有關(guān)植物抗病酶類是否在天麻-蜜環(huán)菌的共生機(jī)制中扮演角色尚不清楚。

那么，天麻的產(chǎn)量及品質(zhì)隨海拔升高呈現(xiàn)何種變化趨勢(shì)？溫度升高對(duì)天麻體內(nèi)消化酶、防御酶及組織液抑制菌絲體生長(zhǎng)的活性有何影響？進(jìn)而對(duì)天麻-蜜環(huán)菌共生關(guān)系有何影響？為了回答以上問(wèn)題，本研究以在中國(guó)廣泛種植的烏紅雜交天麻作為實(shí)驗(yàn)材料，在不同海拔開(kāi)展天麻栽培實(shí)驗(yàn)，以考察海拔影響天麻生物量與藥用品質(zhì)(天麻素、對(duì)羥基苯甲醇含量)的效應(yīng)；同時(shí)，在室內(nèi)控制條件下測(cè)定溫度變化對(duì)天麻消化酶、防御酶活性，以及天麻組織液抗蜜環(huán)菌菌絲體生長(zhǎng)效果的影響，揭示溫度對(duì)天麻-蜜環(huán)菌共生體的生長(zhǎng)與存活的作用機(jī)制。本研究結(jié)果對(duì)于揭示蜜環(huán)菌-天麻的共生機(jī)制具有重要科學(xué)價(jià)值，并對(duì)天麻栽培的區(qū)劃具有重要實(shí)際指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 研究區(qū)域概況

本研究選擇湖北宜昌市五峰縣五峰鎮(zhèn)和牛莊鄉(xiāng)開(kāi)展天麻田間栽培實(shí)驗(yàn)。近30年來(lái)，該地區(qū)已經(jīng)形成了成熟的天麻栽培管理技術(shù)體系，是中國(guó)著名的天麻主產(chǎn)區(qū)之一。試驗(yàn)場(chǎng)地處鄂西南的武陵山余脈，境內(nèi)山地資源豐富，最高海拔達(dá)到2 320.3 m，年均日照1 533 h，年均氣溫13～17 ℃，無(wú)霜期240 d，年均降水量1 600 mm，部分地區(qū)擁有獨(dú)特的沙性壤土。

1.2 試驗(yàn)材料

供試的天麻種質(zhì)為烏紅雜交天麻。父本烏天麻(G.elataB1. f.glauca)和母本紅天麻(G.elataB1. f.elata)種源均為野生天麻的自交系。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇CBS F二倍體菌株用于培養(yǎng)天麻栽培用蜜環(huán)菌材；選擇CBS A、CBS B、CBS D、CBS F、CBS H、CBS J、CBS M和CBS N的單倍體菌絲作為天麻組織液抑菌效果的蜜環(huán)菌株(表1)。

表1 參試天麻組織液抑制蜜環(huán)菌菌絲體生長(zhǎng)試驗(yàn)的蜜環(huán)菌生物種

1.3 海拔對(duì)天麻生物量與品質(zhì)的影響試驗(yàn)

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)本試驗(yàn)采用單因素3水平設(shè)計(jì)，以海拔為固定因子。由于中國(guó)雜交天麻適生海拔為800～1 900 m[27]，故在研究區(qū)域內(nèi)五峰縣五峰鎮(zhèn)、牛莊鄉(xiāng)選擇850 m、1 600 m和1 900 m 三個(gè)海拔梯度，地勢(shì)較為平坦、坡向一致的撂荒農(nóng)地(5年以上)設(shè)置試驗(yàn)場(chǎng)。

1.3.2 大田栽培2018年元月，采用熟料段木法準(zhǔn)備蜜環(huán)菌材。具體方法為：選擇長(zhǎng)20 cm、直徑約15 cm、鮮重約2 500 g(±50 g)的白櫟(QuercusfabriHance)段木，裝入聚氯乙烯袋常壓滅菌8 h，接種CBS F后在25 ℃下培養(yǎng)60 d備用。烏紅雜交天麻種麻的質(zhì)量約10 g/頭，用種量每段木為m0(約50 g)。2018年4月初，參考徐錦堂的方法[10]，采用單棒法栽培天麻。行寬30 cm，每根菌材作為一個(gè)處理單位，處理間距離30 cm，每個(gè)處理20個(gè)重復(fù)。

1.3.3 生物量測(cè)定2018年10月收獲栽培的天麻。以菌棒為單位，測(cè)定天麻的鮮重(m1)和個(gè)體數(shù)，計(jì)算增殖率[G= (m1-m0)/ m0×100%]。帶回實(shí)驗(yàn)室后，分揀個(gè)體鮮重大于50 g的所有個(gè)體，用天平(精度0.01g)測(cè)定總鮮重(W1)，然后在常壓下將天麻樣品蒸制20 min，在60 ℃的烘箱內(nèi)烘干至恒重[28]，用天平(精度0.01 g)測(cè)定干重(W2)，計(jì)算折干率(D= W2/ W1×100%)。將每一菌棒產(chǎn)生的天麻烘干后，粉碎過(guò)60目篩，烘干后低溫保存，用于天麻素和對(duì)羥基苯甲醇的含量測(cè)定。

1.3.4 天麻有效藥用成分的測(cè)定取樣品粉末，準(zhǔn)確稱定1.0 g，置于具塞錐形瓶中，用移液管加入稀乙醇25 mL，超聲處理30 min，放至室溫，5 000 r/min離心20 min；取上清液5 mL，在50 ℃旋蒸濃縮至近干無(wú)醇味，殘?jiān)右译?0.05%磷酸溶液(5∶95)混合溶解，定容至10 mL容量瓶，用1 mL一次性無(wú)菌注射器吸入，從0.22 μm的微孔濾膜濾頭過(guò)濾至EP管。從EP管中吸取15 μL樣品液，注入色譜儀進(jìn)樣器中，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，測(cè)定峰面積[29]。

精密量取對(duì)照品天麻素和對(duì)羥基苯甲醇原溶液適量，加乙腈-0.05%磷酸溶液(5∶95)溶液制成質(zhì)量濃度梯度的溶液，依次測(cè)定出峰面積，建立峰面積(y)與質(zhì)量濃度(x)間的標(biāo)準(zhǔn)曲線及其方程(表2)。根據(jù)樣品的出峰面積按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的天麻素和對(duì)羥基苯甲醇含量。根據(jù)每棒的天麻總鮮重(m1)、增值率(G)和天麻樣品藥用成分含量C(%)計(jì)算每菌棒所產(chǎn)天麻含有的天麻素總量、對(duì)羥基苯甲醇總量及二者合量。

表2 天麻素和對(duì)羥基苯甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.4 溫度對(duì)天麻抗蜜環(huán)菌侵染及消化系統(tǒng)的影響試驗(yàn)

1.4.1 天麻消化酶和防御酶活性對(duì)溫度的響應(yīng)1)天麻樣品的采集 2018年10月，從海拔1 900 m、1 600 m和800 m三處野外種植的烏紅雜交天麻中隨機(jī)選取5窩，每窩取100 g同一規(guī)格(長(zhǎng)約2～3 cm大小)的白麻放入自封袋，置-80 ℃保存[30]，用于背景值測(cè)定；另在海拔1 600 m處(3個(gè)海拔點(diǎn)表現(xiàn)最好)的每窩取100 g規(guī)格一致的白麻用于溫度脅迫實(shí)驗(yàn)。2)溫度處理 將天麻樣品置于15 ℃、25 ℃和30 ℃的濕潤(rùn)河沙中暗培養(yǎng)7 d[31-32]。 3)粗酶液的制備 分別參考Boller T[33]、史益敏[34]、張溫典[35]及胡月[36]的研究方法制備β-1,3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)的粗酶液。4)酶活性測(cè)定 采用用酶免ELISA試劑盒測(cè)定4種酶的活性(江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)LOT NO.：1909P)。將試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成濃度梯度為12.5、25、50、100、200 U/L的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，根據(jù)說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)物濃度為橫坐標(biāo)(x)，其吸光度值(OD)為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(表3)。然后，測(cè)定樣品的OD值，計(jì)算各酶的活性。

表3 4種酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程與活性計(jì)算公式

1.4.2 不同培養(yǎng)溫度天麻粗提物對(duì)蜜環(huán)菌生長(zhǎng)的抑制作用1)天麻材料收集與處理 2018年10月選取野外海拔1 600 m處栽培(3個(gè)海拔點(diǎn)表現(xiàn)最好)的烏紅雜交天麻3窩，每窩選取長(zhǎng)度約2～3 cm的白麻1～1.5 kg，4 ℃保存?zhèn)溆谩?)溫度處理 設(shè)15 ℃、25 ℃和30 ℃ 三個(gè)溫度梯度[39]。每個(gè)處理約700 g鮮天麻，裝入透氣的泡沫盒中，處理時(shí)濕沙覆蓋[38]，處理時(shí)間1周。每處理3個(gè)重復(fù)。3)天麻組織粗提液制備 參考胡忠等的方法提取天麻具有抗真菌蛋白活性的組織粗提液[18,39]。將提取液分為兩部分，2/3體積提取液用于實(shí)驗(yàn)組，1/3的提取液121 ℃高溫高壓滅菌20 min，作為對(duì)照組；試驗(yàn)和對(duì)照組均采用0.22 μm微孔濾膜抽濾制備無(wú)菌濾液，得到抗真菌蛋白(GAFP)粗提液。4)抑菌效果測(cè)定 在無(wú)菌環(huán)境下將抗真菌蛋白粗提液添加到PDA培養(yǎng)基中[20,40]，并接入8個(gè)種的蜜環(huán)菌生物種單倍菌絲體(表1)，放入恒溫培養(yǎng)箱24～25 ℃恒溫培養(yǎng)20 d。然后用掃描儀(EPSON PERFECTION 4870 PHOTO)掃描并用根系分析系統(tǒng)WinRHIZO測(cè)定菌落面積，計(jì)算菌落面積變化比率(HC)，HC=(Si-Sa)/Sa×100，其中Si和Sa分別為試驗(yàn)組和對(duì)照組各蜜環(huán)菌生物種的菌落面積。將長(zhǎng)有蜜環(huán)菌單倍體的培養(yǎng)基放入沸水中煮至培養(yǎng)基融化，然后將菌索65 ℃烘干至恒重，稱重。計(jì)算生物量變化比率(HB)，HB=(Bi-Ba)/Ba×100，其中Bi和Ba分別為試驗(yàn)組和對(duì)照組的菌索生物量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

以海拔為固定因子，采用SPSS20.0軟件對(duì)增長(zhǎng)率(G)、折干率(D)、天麻素含量、對(duì)羥基苯甲醇含量和總藥用成分含量(S,天麻素含量+對(duì)羥基苯甲醇含量)進(jìn)行單因素方差分析；采用Duncan進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)置為0.05。另外，對(duì)β-1,3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶、PPO、PAL活性、蜜環(huán)菌菌落面積、生物量及抑菌效果，以溫度為固定因子，采用SPSS22.0進(jìn)行單因素ANOVA分析，然后采用鄧肯法進(jìn)行處理間顯著性差異檢驗(yàn)(P<0.01)；采用Origin2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 海拔對(duì)烏紅雜交天麻生長(zhǎng)及藥用品質(zhì)的影響

實(shí)際栽培結(jié)果表明，海拔烏紅雜交天麻的增長(zhǎng)率、天麻素含量及總對(duì)羥基苯甲醇含量存在顯著影響，而對(duì)折干率無(wú)顯著影響(表4)。其中，烏紅雜交天麻增長(zhǎng)率在海拔1 600 m最高，并顯著高于其他海拔，分別比海拔850 m 和 1 900 m顯著提高64.06%和98.93%；天麻素含量卻在1 900 m海拔處最高，并顯著高于其他海拔，分別比海拔850 m 和 1 600 m顯著提高20.1%和25.13%； 總對(duì)羥基苯甲醇含量在1 600 m處最高，分別比海拔850 m 和 1 900 m顯著提高46.15%和40.74%。綜合而言，烏紅雜交天麻有效成分總量在海拔1 600 m處最高，分別比海拔850 m和1 900 m提高31.10%和8.39%，但差異均未達(dá)到顯著水平?？梢?jiàn)，海拔1 600 m環(huán)境最有利于烏紅雜交天麻的生長(zhǎng)和藥用有效成分的積累。

表4 不同海拔下雜交天麻生長(zhǎng)與藥用品質(zhì)的變化

2.2 培養(yǎng)溫度對(duì)烏紅雜交天麻體內(nèi)消化酶與防御酶活性的影響

圖1顯示，烏紅雜交天麻體內(nèi)消化酶(幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶)活性隨溫度而降低，表現(xiàn)為15 ℃處理顯著高于25 ℃和30 ℃處理，這表明高溫顯著破壞了雜交天麻的消化酶活性。同時(shí)，β-1,3-葡聚糖酶活性對(duì)溫度的反應(yīng)更敏感，受溫度的影響更大，且在各溫度處理間具有顯著性差異(圖1)。雜交天麻體內(nèi)多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性在不同溫度下也差異顯著。PPO活性隨著溫度的上升而逐漸增強(qiáng)，且各溫度處理間均存在顯著性差異；PAL活性隨著溫度的升高先下降然后上升，且25 ℃處理顯著低于15 ℃和30 ℃處理(圖1)。以上結(jié)果表明烏紅雜交天麻各防御酶活性在溫度升高時(shí)變化趨勢(shì)不盡相同，PPO活性具有增強(qiáng)趨勢(shì)，而PAL活性卻有降低趨勢(shì)。

每種酶內(nèi)不同小寫字母表明溫度處理間在0.05水平上存在顯著性差異(Duncan，P<0.05)

2.3 培養(yǎng)溫度對(duì)天麻組織粗提液抑制蜜環(huán)菌生長(zhǎng)的影響

圖2,A顯示，在不同培養(yǎng)溫度天麻提取物(抗真菌蛋白，GAFP)處理下，各蜜環(huán)菌菌種單倍體菌絲菌落面積變化率表現(xiàn)復(fù)雜多樣，且溫度處理間均存在顯著性差異；菌落面積變化率不僅有上升和下降差異，更有正值和負(fù)值之別。其中，在各溫度提取液處理下，菌種CBSA菌落面積變化率均為正值，菌落生長(zhǎng)得到促進(jìn)；而菌種CBSF和CBSG菌落面積變化率均為負(fù)值，菌落生長(zhǎng)均受到抑制；其余菌種的菌落面積變化率既有正值，也有負(fù)值，說(shuō)明菌落生長(zhǎng)有些情況下得到促進(jìn)，有些情況受到抑制。在15 ℃培養(yǎng)天麻提取物處理下，菌落面積變化率僅菌種CBSA和CBSN為正值，其余菌種菌落面積變化率為負(fù)值，即多為抑制作用且大多較大；在25 ℃培養(yǎng)天麻提取物處理下，菌落面積變化率除菌種CBSF和CBSJ外均為正值，即多為促進(jìn)作用；30 ℃培養(yǎng)天麻提取物處理下，菌落面積變化率僅菌種CBSA、CBSH和CBSM為正值但促進(jìn)作用很明顯，其余菌種均為負(fù)值但抑制作用相對(duì)較小?？梢?jiàn)，大多數(shù)蜜環(huán)菌菌種菌落生長(zhǎng)的抑制效果均以15 ℃培養(yǎng)天麻提取物處理最顯著，隨著培養(yǎng)天麻溫度的上升，抑菌效果有顯著降低的趨勢(shì)，但其抑制效應(yīng)在8個(gè)生物種間存在顯著差異。

正值代表促進(jìn)生長(zhǎng)，負(fù)值代表抑制生長(zhǎng)；同一菌種內(nèi)不同小寫字母代表溫度處理間在0.05水平存在顯著性差異(Duncan，P<0.05)

同時(shí)，與試驗(yàn)預(yù)期相反，菌落生物量的變化率除CBSJ外均為正值，即未滅活天麻組織液(天麻抗真菌蛋白)均明顯促進(jìn)各蜜環(huán)菌菌種的生長(zhǎng)，但不同培養(yǎng)溫度組織液的促進(jìn)效應(yīng)有顯著差異，在低溫時(shí)促進(jìn)效應(yīng)較弱，而在中溫時(shí)促進(jìn)效應(yīng)相對(duì)較強(qiáng)(圖2，B)。其中，除菌種CBSJ以外，隨著培養(yǎng)溫度的升高，大部分蜜環(huán)菌生物量先增加后降低，也就是天麻提取物對(duì)生物量增加的相對(duì)抑制能力先降低后升高，在25 ℃達(dá)到最低值，大多數(shù)在15 ℃達(dá)到最高值。上述結(jié)果表明，盡管天麻組織液中存在具有抑菌活性的抗真菌蛋白(GAFP)，但天麻組織粗提液中可能同時(shí)存在對(duì)高溫敏感的未知活性物質(zhì)，二者綜合作用呈現(xiàn)出對(duì)蜜環(huán)菌生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。

3 討 論

經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)地栽培研究，發(fā)現(xiàn)在海拔1 900 m處由CBS F伴栽的紅天麻有效成分含量最高，雜交天麻適合種植在1 600 m海拔范圍。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，無(wú)論在原位還是模擬條件下，植物與真菌共生體雙方的海拔來(lái)源及海拔梯度上的環(huán)境(或溫度)變化均顯著影響其生長(zhǎng)[41]。結(jié)合彭華勝的研究結(jié)果[11]，天麻的分布有一定海拔要求，其中西南地區(qū)以1 200～1 800 m較多，東北地區(qū)多分布在海拔300～1 000 m。而在鄰近緯度，低海拔地區(qū)溫度較高，高溫抑制了天麻中消化酶的活性，但是蜜環(huán)菌胞外酶活性隨溫度的升高先增加后降低，這就可能使天麻-蜜環(huán)菌的共生關(guān)系遭到破壞。

本研究的結(jié)果表明，天麻體內(nèi)消化酶和防御酶系統(tǒng)對(duì)于溫度升高的響應(yīng)具有差異。低溫下天麻消化酶活性升高，而高溫下天麻的保護(hù)酶活性則增加。早在20世紀(jì)80年代研究發(fā)現(xiàn)，天麻皮層細(xì)胞具有消化功能，菌絲的細(xì)胞壁就是在其中被消化的，發(fā)揮作用的主要是天麻皮層分泌的幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶[42-43]。因此，這些消化酶活性的變化直接影響天麻的營(yíng)養(yǎng)供給，也與天麻免受蜜環(huán)菌侵染密切相關(guān)。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，高溫下天麻體內(nèi)防御酶活性增強(qiáng)，這與戴明凱等以馬鈴薯為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)高溫脅迫下馬鈴薯體內(nèi)保護(hù)酶活性隨時(shí)間推移增加的結(jié)果相似[44]。因此，天麻響應(yīng)蜜環(huán)菌侵染的策略隨著溫度的升高發(fā)生變化，由低溫的消化蜜環(huán)菌菌絲體供自生需要，轉(zhuǎn)向高溫下保護(hù)自身免受侵害為主。

與此同時(shí)，我們還研究了溫度變化對(duì)天麻體內(nèi)組織粗提液抑制蜜環(huán)菌單倍體菌絲生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)溫度升高削弱了天麻對(duì)蜜環(huán)菌菌絲體的抑制能力。本研究中采用的是天麻組織的粗提液，包含各種酶類和抗真菌蛋白以及其他成分不明的物質(zhì)[45-47]?？拐婢鞍?GAFP)是一類對(duì)真菌具有抑制作用的蛋白質(zhì)，在芝麻菜種子和天麻的塊莖中均有發(fā)現(xiàn)[48-49]曾從新生麻塊莖中檢測(cè)并純化出一種抗真菌蛋白，并對(duì)其進(jìn)行了免疫熒光定位，發(fā)現(xiàn)抗真菌蛋白定位于新生麻表皮及皮層細(xì)胞的外緣，是新生麻避免被蜜環(huán)菌侵入的物質(zhì)基礎(chǔ)。而且GAFP是越冬前新生麻阻止蜜環(huán)菌侵入的化學(xué)防御物質(zhì)[50]，說(shuō)明低溫對(duì)于GAFP的抑菌效果顯著，可能是高溫抑制GAFP的表達(dá)，或者活性。這與本試驗(yàn)所發(fā)現(xiàn)的天麻組織粗提液在低溫下抑菌效果明顯較為一致。由于幾丁質(zhì)酶和葡聚糖本身不具有抑菌活性[48]，我們推斷本研究中發(fā)揮抑菌作用的主要物質(zhì)是GAFP。本研究還發(fā)現(xiàn)，天麻組織粗提液中存在促進(jìn)蜜環(huán)菌生長(zhǎng)的活性物質(zhì)，這種活性物質(zhì)可能存在于天麻皮層中GAFP的外側(cè)，以誘導(dǎo)和促進(jìn)蜜環(huán)菌趨向天麻組織的生長(zhǎng)。這也說(shuō)明天麻與蜜環(huán)菌在長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中具有十分復(fù)雜的關(guān)系。

溫度還可能對(duì)天麻伴生蜜環(huán)菌的侵染特性產(chǎn)生影響。蜜環(huán)菌菌絲體最適宜的生長(zhǎng)溫度為20～25 ℃，超過(guò)30 ℃停止生長(zhǎng)[51]，施漢鈺等也認(rèn)為最佳的蜜環(huán)菌培養(yǎng)溫度為恒溫25 ℃[37]。也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，蜜環(huán)菌的生長(zhǎng)量在高溫條件下顯著高于低溫條件下，其差異主要是菌絲生長(zhǎng)，而菌索生長(zhǎng)的差異并不大[52]。另外，溫度還影響蜜環(huán)菌胞外酶的分泌。如曾春函等在研究中發(fā)現(xiàn)，溫度對(duì)蜜環(huán)菌胞外漆酶和果膠酶活性大小有影響，對(duì)產(chǎn)酶時(shí)間沒(méi)有影響；對(duì)纖維素酶活性達(dá)到峰值的時(shí)間和活性大小都有影響[53]。

4 結(jié) 論

溫度是影響蜜環(huán)菌-天麻共生關(guān)系的重要環(huán)境因子。隨著溫度升高，天麻抵御蜜環(huán)菌入侵的策略發(fā)生變化，天麻的消化酶活性和粗提液的抑菌活性下降，但是保護(hù)酶活性上升。而且不同海拔下栽培的天麻產(chǎn)量及有效成分也有明顯差異，這種適應(yīng)策略的轉(zhuǎn)變，可能是溫度升高導(dǎo)致蜜環(huán)菌病理性侵染天麻的重要機(jī)制。同時(shí)，天麻體內(nèi)含有某種促進(jìn)蜜環(huán)菌生長(zhǎng)的活性物質(zhì)，說(shuō)明天麻體內(nèi)同時(shí)存在促進(jìn)蜜環(huán)菌生長(zhǎng)和抑制蜜環(huán)菌侵染的復(fù)雜系統(tǒng)。而且經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，在海拔1 900 m處，由CBS F伴栽的紅天麻產(chǎn)量及有效成分含量均最高。