周慶安，黃勝斌，莫勝蘭，胡麗萍，韓銀華，何奇松，馬 琳，鐘華訓(xùn)，李劍靜，李 軍，郭建剛*

(1.廣西壯族自治區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，廣西南寧 530001；2.岑溪動物疫病預(yù)防控制中心，廣西梧州 543200)

梨形蟲(Piroplasma)屬原生動物界(Protozoan)、頂復(fù)門(Apicomplexa)、孢子蟲綱(Sporozoea)、梨形蟲亞綱(Piroplasmia)、梨形蟲目(Piroplasmida)。梨形蟲病為牛、羊等動物循環(huán)系統(tǒng)的寄生蟲病，也是一種動物源性人獸共患病，包括巴貝斯蟲病和泰勒蟲病。巴貝斯蟲病由巴貝斯蟲科(Babesiidae)巴貝斯蟲屬(Babesia)的種類寄生于牛、羊的血液而發(fā)生原蟲病，常見的種類有雙芽巴貝蟲(B.bigemina)、牛巴貝斯蟲(B.bovis)、卵形巴貝斯蟲(B.ovata)、莫氏巴貝斯蟲(B.motais)[1]。而泰勒焦蟲病由泰勒科(Theileriidae)泰勒蟲屬(Theileria)的種類寄生于牛、羊的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞而發(fā)生原蟲病，牛、羊等家畜常見的泰勒蟲種類有[1-3]環(huán)形泰勒蟲(T.annulata)、中華泰勒蟲(T.sinensis)、東方泰勒蟲(T.orientalis)、小泰勒蟲(T.parva)、綿羊泰勒蟲(T.ovis)、羊泰勒焦蟲(T.hirci)呂氏泰勒蟲(T.lunwenshuni)和尤氏泰勒蟲(T.uilenbergi)。在一些養(yǎng)殖地區(qū)，牛、羊群體發(fā)生梨形蟲病[4-7]，臨床癥狀主要以高熱、貧血和消瘦為主，發(fā)展為慢性病后，嚴(yán)重影響牛、羊生產(chǎn)，阻礙牛、羊產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，造成經(jīng)濟(jì)損失。

傳統(tǒng)的檢測方法為血液涂片染色鏡檢，耗時、費力，受主觀因素影響較大。本次運用套式PCR方法，根據(jù)巴貝斯蟲和泰勒蟲18S rRNA 基因序列設(shè)計的通用引物。18S rRNA基因是編碼真核生物核糖體小亞基的DNA序列，其中有保守序列區(qū)域，也有可變序列區(qū)域。保守區(qū)體現(xiàn)了種之間的親緣關(guān)系，而可變區(qū)能區(qū)分種間的差異，可用于種屬以上的分類分子標(biāo)志。近年來，牛、羊產(chǎn)業(yè)是廣西重點扶貧產(chǎn)業(yè)，也是部分地區(qū)重要畜牧產(chǎn)業(yè)中支柱產(chǎn)業(yè)，是農(nóng)民增加收入重要來源之一。梨形蟲病是影響牛、羊產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要因素，同時廣西對牛、羊的梨形蟲病調(diào)查較少，因此，本次運用套式PCR方法對牛、羊全血梨形蟲開展分子流行病學(xué)調(diào)查，為廣西梨形蟲病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 2019年1月至2019年12月根據(jù)各市養(yǎng)殖情況在廣西南寧市、柳州市、河池市、賀州市、百色市5個地區(qū)的牛、羊養(yǎng)殖場進(jìn)行頸靜脈采集全血，置于EDTA真空抗凝管，混均勻后，冷藏保存，帶回實驗室檢測(表1)。

表1 牛、羊全血采集信息表

1.1.2 主要試劑及儀器 TGuide S32磁珠法血液基因組DNA提取試劑盒、2×Taqplus PCR Master mix、大量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒小提試劑盒購于北京天根生化科技有限公司；PMDTM18-T克隆載體、DL 2000 DNA Marker購于Takara公司；TGuide S32核酸抽提儀、Bionetra TONE PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀購于北京六一生物科技有限公司。

1.1.3 引物合成 參照文獻(xiàn)根據(jù)巴貝斯蟲和泰勒蟲18S rRNA 基因序列信息設(shè)計的通用引物[8]，用套式PCR檢測牛羊血液攜梨形蟲原蟲情況。引物序列由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 全血核酸抽提及序列擴(kuò)增 取200 μL牛、羊全血用于核酸抽提，采用天根TGuide S32磁珠法血液基因組DNA提取試劑盒抽提。

用套式PCR方法擴(kuò)增目的基因：第1～2輪擴(kuò)增反應(yīng)均25 μL體系，包括2×TaqMasterMix 12 μL，ddH2O 9 μL，上、下游特異性引物各0.5μL，DNA模板3 μL，第2輪PCR反應(yīng)體系模板為第1輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增程序：95℃ 5 min；94℃ 1 min,55℃ 1 min,72℃ 1 min，34個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用15 g/L的瓊脂糖凝膠在100 V、66 mA條件下電泳，經(jīng)30 min后，在凝膠成像系統(tǒng)觀察是否有特異性亮帶。

1.2.2 梨形蟲序列測序 應(yīng)用大量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收梨形蟲目的基因，并在16℃條件下連接至PMDTM18-T載體后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑選可疑陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，再回收重組質(zhì)粒，經(jīng)鑒定是陽性后，送至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的建立 將本次成功測序的梨形蟲序列在NCBI中注冊的序列進(jìn)行同源性對比，分析所得的序列是否為目的基因以及梨形蟲病原體種類，并和GenBank上登錄的泰勒蟲和巴貝斯蟲18S rRNA基因序列相似度比較，選東方泰勒蟲(KT124538、MH208642)、環(huán)形泰勒蟲(MF287948、MG599091)、中華泰勒蟲(MT271905)、尤氏泰勒蟲(JF719835) 、鹿泰勒蟲(KT959227)、綿羊泰勒蟲(MN493111)、呂氏泰勒蟲(LC326007)、牛巴貝斯蟲(KY805833)、莫氏巴貝斯蟲(AY260179)、卵形巴貝斯蟲(MN900525)、雙芽巴貝斯蟲(MH050358)作為參照序列，選同為梨形蟲目的Anthemosomagarnhami(MH093637)、貓胞簇蟲(Cytauxzoonfelis，L19080)作為外類群，用MEGA5.2軟件中的Neighbor-Joining Tree，經(jīng)過 1000 次的 Bootstrap計算，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 梨形蟲18S rRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)特異性引物擴(kuò)增后，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳后，在凝膠成像系統(tǒng)可觀察到約438 bp片段亮帶，與預(yù)期片段大小相符(圖1)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；“-”陰性對照；“+”陽性對照；1～7.PCR 產(chǎn)物

2.2 各地區(qū)牛、羊規(guī)模場梨形蟲感染情況

本次檢測在南寧、柳州、河池、百色、賀州5個地區(qū)均檢測到梨形蟲病原體，其中7個牛養(yǎng)殖場和10個羊養(yǎng)殖場檢測到梨形蟲病原體。共檢測638份全血，梨形蟲平均感染為24.76%，其中牛全血平均感染率為20.19%，羊全血平均感染率為24.19%(表2、表3)。

表2 廣西部分地區(qū)養(yǎng)殖場攜帶梨形蟲情況

表3 廣西部分地區(qū)牛、羊感染梨形蟲情況

2.3 序列分析結(jié)果

檢出牛、羊全血梨形蟲病原體中，隨機(jī)抽取部分陽性樣品進(jìn)行序列測序，在NCBI 中Blast相似性達(dá)97%以上，雙芽巴貝斯蟲3株、牛巴貝斯蟲1株、環(huán)形泰勒蟲4株、東方泰勒蟲23株、呂氏泰勒蟲21株?；?8S rRNA 基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹中得出泰勒蟲屬和巴貝斯蟲屬的種類分布在兩個大分支，相應(yīng)的種類分別與該病原相似度較高的參考序列在同一小分支(圖2)。

圖2 基于18S rRNA基因梨形蟲不同種類的進(jìn)化樹

3 討論

本次檢測的638份全血覆蓋南寧、柳州、河池、百色、賀州等地區(qū)32個養(yǎng)殖場，在5個地區(qū)中均檢測出梨形蟲，在20個養(yǎng)殖場中檢測出梨形蟲，平均感染率達(dá)到24.76%，涉及雙芽巴貝斯蟲、牛巴貝斯蟲、環(huán)形泰勒蟲、東方泰勒蟲、呂氏泰勒蟲5個種類，與云南省騰沖市牛羊梨形蟲平均感染率為27.31%，涉及雙芽巴貝斯蟲、牛巴貝斯蟲、呂氏泰勒蟲、環(huán)形泰勒蟲、東方泰勒蟲等13個種類略相似[9]；與四川省阿壩州牦牛和藏綿羊梨形蟲平均感染率為49%，種類為呂氏泰勒蟲和中華泰勒蟲，策勒縣和田羊和策勒黑羊梨形蟲平均感染率為69.2% ，均為綿羊泰勒蟲略有不同[10-11]。廣西牛、羊梨形蟲感染率較一些地區(qū)較低，感染種類也略有不同，但是以上調(diào)查結(jié)果表明廣西仍然部分地區(qū)是梨形蟲感染風(fēng)險較高地區(qū)。梨形蟲是動物源性人獸共患病，動物宿主包括家畜和野生動物，可以通過蜱蟲傳播媒介傳播[12-13]，如硬蜱既是梨形蟲的傳播媒介又是貯藏宿主，可在在動物宿主和硬蜱完成其生活史[14]。近年有巴貝斯蟲感染人的事件，巴貝斯蟲病又引起人們的重視和關(guān)注，蜱與巴貝斯蟲關(guān)系密切，因此，蜱蟲傳播媒介也是以后要監(jiān)測的對象。

牛主要以感染東方泰勒蟲為主，在采樣過程未發(fā)現(xiàn)攜帶有東方泰勒蟲的牛表現(xiàn)臨床癥狀。感染牛的泰勒蟲分為良性和惡性泰勒蟲2種，東方泰勒焦蟲屬于良性泰勒蟲，致病性較低，不表現(xiàn)臨床癥狀，感染的家畜處于帶蟲免疫狀態(tài)[15]。有研究分析編碼梨形表面蛋白(MPSP)的P32基因，可鑒定出11種基因型[16-18]，其中感染2型(Ikeda)和少數(shù)1型(Chitose)可表現(xiàn)臨床癥狀[19-23]。而羊以呂氏泰勒蟲為主，與我國部分地區(qū)羊泰勒蟲病中某些地區(qū)樣品的結(jié)果相似[15]，該種與原有種類的傳播媒介、培養(yǎng)特性及分子對比后命名為呂氏泰勒蟲(T.lunwenshuni)，是羊泰勒蟲致病力較強(qiáng)之一[2,3,24]。東方泰勒蟲、呂氏泰勒蟲分別是廣西5個地區(qū)感染牛、羊的優(yōu)勢種，也具有致病力，因此，在日常監(jiān)測和防治牛、羊寄生蟲病中應(yīng)重點關(guān)注。

系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，檢測到的3種不同泰勒蟲，它們的18S rRNA基因序列分別分布在不同分支上，南寧、百色的環(huán)形泰勒蟲、東方泰勒蟲和河池的東方泰勒蟲在泰勒蟲屬的大分支中形成獨立大分支，而柳州和賀州的呂氏泰勒蟲也在泰勒蟲屬的大分支中形成一個獨立分支，分支里又有3個小分支，說明不同呂氏泰勒蟲之間有差異，與文獻(xiàn)[25]調(diào)查結(jié)果相似。