遲 恒，黃金海

(天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300072)

科學(xué)技術(shù)的發(fā)展大大推進了公共衛(wèi)生及其服務(wù)的改善，但傳染性疾病依然對人類和動物健康造成極大威脅與挑戰(zhàn)，而疫苗則是預(yù)防和控制傳染性疾病最有效的手段之一[1]，疫苗接種是預(yù)防和控制傳染性疾病最為可行，最具經(jīng)濟效益的策略。疫苗不僅在人類傳染性疾病防控中發(fā)揮著重要的作用，也可以有效保護動物免于病毒的侵害，為畜牧業(yè)安全生產(chǎn)提供了有效保障[2]。

傳統(tǒng)常規(guī)疫苗主要包括滅活疫苗和減毒活疫苗，但這些疫苗有可能導(dǎo)致接種者產(chǎn)生過敏反應(yīng)，特別是減毒活疫苗有毒力殘留，存在毒力返強、體內(nèi)重組的風險。隨著科技的發(fā)展，病毒活載體疫苗、DNA疫苗、mRNA疫苗、酵母疫苗等新型生物技術(shù)疫苗的理論及實踐應(yīng)用得以拓展。其中酵母疫苗具有免疫途徑簡單，安全性高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)勢，在水產(chǎn)、獸用領(lǐng)域?qū)湍副磉_系統(tǒng)在疫苗領(lǐng)域的開發(fā)及應(yīng)用展現(xiàn)出廣闊前景[3]。本文就全重組酵母(whole recombinant yeast,WRY)疫苗以及酵母表面展示(yeast surface display,YSD)系統(tǒng)等新型酵母疫苗模型及其口服疫苗的應(yīng)用做一綜述。

1 口服酵母載體疫苗

酵母表達系統(tǒng)是表達具有疫苗學(xué)意義蛋白質(zhì)的重要模型，雖然目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)700多種酵母，但考慮到安全性與穩(wěn)定性，僅有釀酒酵母、畢赤酵母、多形漢遜酵母以及解脂耶氏酵母等少數(shù)幾種酵母可作為生產(chǎn)疫苗的工程菌株，其中釀酒酵母和畢赤酵母是使用最為廣泛的疫苗菌株。釀酒酵母在人類釀酒業(yè)已經(jīng)使用了上千年，不僅易于培養(yǎng)，工藝簡單，具有較高的安全性。真核生物酵母表達的外源基因可以進行翻譯后修飾(如蛋白質(zhì)糖基化修飾等)，具有良好的生物學(xué)活性與較高的穩(wěn)定性。酵母表達系統(tǒng)可以安全、快速、經(jīng)濟的表達病毒蛋白、細菌蛋白、真菌蛋白等，且不影響蛋白質(zhì)的免疫原性，是較為理想的疫苗表達系統(tǒng)。

口服酵母載體疫苗主要包括全重組酵母疫苗以及酵母表面展示疫苗兩種。釀酒酵母具有食品級的安全性保障，酵母細胞壁含有的β-葡聚糖是機體免疫應(yīng)答過程重要刺激劑和調(diào)節(jié)劑[4]，可作為天然佐劑使用。表達在酵母胞漿內(nèi)，或通過不同細胞壁錨定序列融合外源病毒蛋白并展示表達與酵母細胞外獲得的完整酵母可作為全重組酵母疫苗使用[5]。酵母細胞可以作為一種生產(chǎn)系統(tǒng)或分泌遞送系統(tǒng)，提供簡單、分泌表達的亞單位疫苗生產(chǎn)平臺，簡化昂貴的下游蛋白質(zhì)純化步驟。

酵母表面展示技術(shù)最開始應(yīng)用于食品的加工過程，后來被廣泛應(yīng)用于展示病原體特異性抗原從而制備相應(yīng)疫苗的研發(fā)。酵母表面展示疫苗的原理是將目的抗原與酵母中的細胞壁蛋白(Cwp1p、Cwp2p、Gas1p、Aga1p、Aga2p、Flo1p、Tip1p)融合表達，并在細胞壁蛋白的協(xié)助下將目的抗原錨定在細胞表面[6]。其中，最常見的酵母展示系統(tǒng)采用目標蛋白與具有錨定作用的Aga1p亞基與黏附作用的Aga2p亞基融合，錨定在酵母細胞表面的Aga1p亞基通過Cys7和Cys50殘基與Aga2p亞基形成兩個穩(wěn)定的二硫鍵，實現(xiàn)融合蛋白在細胞表面的錨定。與全重組酵母疫苗類似，酵母表面展示疫苗也可以作為口服疫苗，促進機體的黏膜和體液免疫反應(yīng)。

2 口服酵母載體疫苗的免疫機理

2.1 酵母細胞壁葡聚糖是天然的免疫佐劑

酵母細胞壁中含有β-1,3-葡聚糖以及β-1,6-葡聚糖，二者均是免疫應(yīng)答的重要刺激劑和調(diào)節(jié)劑。β-葡聚糖顆粒偶聯(lián)蛋白可被樹突狀細胞加工成短肽，并通過MHC分子呈遞給T細胞，進而導(dǎo)致抗原特異性Th1和Th17細胞被活化。此外，β-葡聚糖還可以激活細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，增加細胞內(nèi)水解和代謝酶的含量和活性，導(dǎo)致吞噬細胞活化，促進白介素IL-1、IL-9和TNF-α等炎癥因子的產(chǎn)生[7]。研究表明，酵母細胞壁中的葡聚糖可誘導(dǎo)原代巨噬細胞中細胞因子以及核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)的產(chǎn)生，可通過PI3K途徑激活并增強T淋巴細胞反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)機體的免疫反應(yīng)。釀酒酵母細胞壁被證明可有效激發(fā)綿羊腸道上皮細胞TLR2-MyD88-NFB通路，并誘導(dǎo)-防御素的產(chǎn)生，提高綿羊先天性免疫能力[8]。大量體內(nèi)試驗表明，在動物日糧中添加酵母細胞壁可以促進動物生長，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)節(jié)細菌平衡和營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運，抑制炎癥反應(yīng)，并促進免疫球蛋白的產(chǎn)生[9-11]，臨床試驗已證明口服酵母β-葡聚糖對免疫系統(tǒng)具有積極作用。

2.2 口服酵母載體疫苗可有效激發(fā)機體黏膜免疫

傳統(tǒng)疫苗主要通過激發(fā)機體的體液免疫系統(tǒng)發(fā)揮功效，而口服酵母載體疫苗則主要通過激發(fā)機體黏膜免疫來發(fā)揮功效。口服酵母載體疫苗可通過腸道黏膜上皮上的微皺褶細胞(microfold cell，M細胞)的吞噬轉(zhuǎn)運效應(yīng)攝入顆粒性抗原，進入腸道黏膜組織中的重組酵母細胞可經(jīng)DC細胞吞噬，完成抗原的加工、遞呈，進一步激活淋巴組織的特異性T、B細胞活化，促進IgA類抗體的分泌，促進宿主黏膜屏障功能；攝入的酵母細胞可通過刺激黏膜下peyer's結(jié)中NKT、參與先天性免疫應(yīng)答的ILCs等淋巴細胞亞群來調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答；還可以增強主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)分子的表達，與樹突狀細胞和抗原提呈細胞表面分子產(chǎn)生共刺激作用，進而有效激活T淋巴細胞所介導(dǎo)的細胞免疫[12]。

2.3 調(diào)整腸道微生物菌群及生境，影響腸道黏膜下組織免疫細胞亞群

腸道微生物不僅具有協(xié)助宿主膳食纖維、制造維生素等生物學(xué)功能，還可以刺激黏膜免疫系統(tǒng)，增強宿主的免疫應(yīng)答，腸道微生態(tài)菌群的平衡與穩(wěn)態(tài)對宿主腸道免疫功能有著重要的影響[13]。腸道益生菌不僅可以誘導(dǎo)腸上皮細胞分泌蛋白，可以協(xié)助組織修復(fù)，還可以誘導(dǎo)Toll樣受體(TLR)蛋白過表達，增強機體的免疫應(yīng)答。腸道益生菌可以誘導(dǎo)IL-10細胞因子家族的表達，其中包括由樹突狀細胞產(chǎn)生具有抑制促炎反應(yīng)的IL-10，以及由第3組固有淋巴細胞產(chǎn)生的具有增強細菌定植作用的IL-22，進而激發(fā)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，提高宿主的抗病毒感染能力[14]。

口服酵母疫苗對腸道微生態(tài)菌群、黏膜組織內(nèi)免疫微環(huán)境、Th17/Treg細胞亞群細胞的平衡、細胞因子譜等的調(diào)節(jié)作用也影響著機體的免疫力及抗病狀態(tài)。酵母可以調(diào)節(jié)腸道內(nèi)微生物菌群的平衡，進而影響機體的腸道免疫功能。通過小鼠結(jié)腸炎的葡聚糖硫酸鈉(DSS)模型，證明益生菌釀酒酵母不僅可以有效改善DSS引起的結(jié)腸損傷，而且增加了腸道細菌的多樣性，進而改善了DSS結(jié)腸炎引起的營養(yǎng)不良狀況[15]。釀酒酵母還可改變組織細胞中miRNA表達來調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，發(fā)揮抗小鼠結(jié)腸炎的作用。益生菌酵母還可以對腸道感染有關(guān)的疾病起良好的調(diào)節(jié)作用[16]，頡頏腸道致病微生物的作用毒力因子，如毒素，脂多糖等，發(fā)揮抗炎癥反應(yīng)。口服酵母還可以有益地調(diào)節(jié)動物的腸道中谷胱甘肽代謝途徑以及蛋白水解酶活性，促進動物生長，提升宿主的免疫力。熱滅活酵母和活酵母均可以有效激活特異性免疫反應(yīng)，并引起同等的保護性免疫，從而避免了活疫苗致病性的風險?？诜湍篙d體疫苗已經(jīng)證明可以激發(fā)豬、禽類、小鼠、兔、人等多宿主的特異性抗體反應(yīng)及細胞、黏膜免疫反應(yīng)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

3 口服酵母載體疫苗的應(yīng)用

相較于傳統(tǒng)疫苗，口服酵母載體疫苗具有以下顯著優(yōu)勢：①釀酒酵母遺傳背景清晰，遺傳改造操作方便，生產(chǎn)工藝簡便，生產(chǎn)成本較低，不產(chǎn)生毒素，具有較高的安全性。②與原核表達系統(tǒng)相比，酵母表達系統(tǒng)可以對抗原蛋白進行糖基化等翻譯后修飾，有利于保持生物產(chǎn)品的活性和穩(wěn)定性，通過分子生物學(xué)技術(shù)進一步改變酵母糖基化途徑，構(gòu)建哺乳動物源化的酵母底盤細胞，使其更接近于人以及其他動物宿主細胞的糖基化模式，使得外源病毒蛋白的表達更接近于天然病毒蛋白更有效的激發(fā)機體免疫[19]。③口服疫苗使用方便，避免傳統(tǒng)疫苗繁瑣的純化過程以及過高注射成本、傳播血源性病原體的風險的問題。傳統(tǒng)多肽疫苗穩(wěn)定性較差，對儲存，運輸有特殊要求：從生產(chǎn)到接種前都要保存在2℃～8℃條件下，在一些資源匱乏的發(fā)展中國家難以實現(xiàn)這樣的運輸與保存條件。生化試驗結(jié)果表明，在2℃～8℃和23℃～25℃下儲存時，酵母細胞能夠在1年內(nèi)保持抗原穩(wěn)定，可以解決蛋白質(zhì)抗原穩(wěn)定性的難題。

口服酵母載體疫苗越來越被科研人員所重視，在畜牧水產(chǎn)業(yè)中的優(yōu)勢突顯。研究人員以釀酒酵母作為宿主，紅點石斑魚壞死病毒(RGNNV)的重組衣殼蛋白當作模型抗原，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)與免疫純化重組衣殼蛋白的小鼠相比，免疫全重組酵母疫苗的小鼠產(chǎn)生的IgG抗體滴度提高了9倍～27倍[20]，證明全重組酵母可作為口服疫苗使用且有良好的免疫原性。還可利用酵母系統(tǒng)表達對蝦白斑綜合癥病毒 (WSSV)的VP19和VP28蛋白，將全重組酵母疫苗與食物混合喂養(yǎng)小龍蝦25 d。喂養(yǎng)全重組酵母疫苗的小龍蝦存活率顯著高于對照組[21]，證明了該疫苗的有效性。

通過酵母表面展示系統(tǒng)表達高致病性禽流感H5N1的血凝素蛋白(HA)，可以激發(fā)接種疫苗小鼠的體液免疫與細胞免疫，對小鼠無明顯副作用，提供了一種制備流感疫苗的備選方法。酵母表面展示系統(tǒng)的登革病毒(DENV)口服酵母疫苗，在釀酒酵母表面表達登革病毒包膜域Ⅲ蛋白(scEDⅢ)，小鼠口服該疫苗后其體液免疫反應(yīng)以及黏膜免疫反應(yīng)顯著上調(diào)，可激發(fā)小鼠IgG及IgA抗體產(chǎn)生并有效的中和抗體，表現(xiàn)出該疫苗作為針對登革病毒感染的有效口服疫苗的良好前景[22]。將人腸道病毒71(EV-A71)的衣殼蛋白展示在釀酒酵母的表面上，可以有效誘導(dǎo)免疫后小鼠發(fā)生體液和黏膜免疫反應(yīng)及脾臟Th1免疫反應(yīng)，并且在母鼠進行口服免疫后可以有效保護致死性EV-A71引起的新生鼠感染，提供了一種抗人腸道病毒71感染的潛在的口服疫苗[23]。表1是近幾年研發(fā)的酵母表達系統(tǒng)制備的病毒疫苗，雖然各疫苗所處階段不同，有的尚在實驗室階段，有的已經(jīng)被批準進入臨床試驗階段，但隨著對酵母系統(tǒng)研究的不斷深入，一定會有越來越多的酵母疫苗投入使用。

表1 酵母表達系統(tǒng)制備的疫苗

4 展望

口服酵母疫苗在理論基礎(chǔ)及技術(shù)應(yīng)用上尚有許多問題需要進一步明確：①對酵母載體疫苗激發(fā)免疫調(diào)節(jié)的機制的理論研究還在初級階段，對其激活先天性免疫細胞的亞群、調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境的分子細節(jié)等研究仍不充分；②工程化的酵母在高密度發(fā)酵過程中的生物量、外源蛋白表達動力學(xué)及穩(wěn)定性問題；③口服酵母疫苗在不同動物物種、疫苗類型效果的差異性研究；④酵母口服疫苗和傳統(tǒng)疫苗的協(xié)同效應(yīng)；⑤腸胃環(huán)境會對抗原產(chǎn)生部分口服酵母產(chǎn)生降解破壞，酵母口服耐受性等問題，都需要進一步的加強研究。酵母疫苗在安全性、免疫方式、生產(chǎn)及人工成本等方面有顯著優(yōu)勢，酵母細胞獨特的的腸道菌群擾動效應(yīng)、細胞壁β-葡聚糖的免疫佐劑效應(yīng)，預(yù)示著全重組酵母疫苗以及酵母表面展示疫苗直接口服免疫會逐漸被接受。口服酵母載體疫苗在動物疫病防控中會展現(xiàn)出更為廣闊的應(yīng)用前景。