方 茜，梁錦寧，溫 莎，郭曉萍

(廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，廣西南寧 530021)

樹鼩是生活在熱帶和亞熱帶地區(qū)的哺乳綱攀鼩類的小型動物，在我國云南、貴州、廣西、廣東等地廣泛分布。由于其與人類在細胞與分子層面的相似性，鼩已在腫瘤學、內(nèi)分泌學、神經(jīng)生物學、生殖生物學、免疫學及感染性疾病等方面有廣泛和深入的應(yīng)用[1]。樹鼩作為新型的實驗動物，來源于自然環(huán)境，其實驗動物化首先要排除人獸共患病，如空腸彎菌、沙門氏菌和大腸埃希氏菌等腸道病原菌[2]。普通級樹鼩在人工繁育過程中，曾有病原微生物所致樹鼩暴發(fā)腹瀉少數(shù)致死的情況，而大腸埃希氏菌是引起腹瀉的常見病原微生物[3]。目前樹鼩源大腸埃希氏菌所攜帶的毒力基因檢測和耐藥性的研究報道很少，因此本研究對廣西南寧某大學人工馴化養(yǎng)殖實驗室中的10份樹鼩腸道內(nèi)容物進行了大腸埃希氏菌的分離鑒定、同源性分析，常規(guī)毒力基因檢測及耐藥性分析，以期為樹鼩的正常飼養(yǎng)繁殖和樹鼩大腸桿菌病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 廣西南寧某大學人工馴化養(yǎng)殖實驗室中的10只樹鼩腸道內(nèi)容物。

1.1.2 試劑、培養(yǎng)基和藥敏紙片 DNA標準DL 5 000，生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品； DNA mix，TaKaRa公司產(chǎn)品； 血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品；細菌微量生化反應(yīng)管及臨床常用14種藥敏紙片，南寧市生化藥品儀器有限公司產(chǎn)品；細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)、膠回收試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 PCR 儀、Gel Doc TM EZ imager凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司產(chǎn)品；XSP-8CA生物顯微鏡，上海光學儀器一廠產(chǎn)品；SW-CJ-2F雙人雙面凈化工作臺,蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；150A/250B數(shù)顯生化培養(yǎng)箱,江蘇省金壇市江南儀器廠產(chǎn)品；TGL-16K臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離與純化 無菌操作取樹鼩腸道內(nèi)容物，分別接種于血瓊脂平板上，置于37℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取大小一致、色澤鮮明的單個大腸埃希氏菌可疑菌落，用麥康凱選擇性培養(yǎng)基進行純化分離。觀察菌落并挑取形態(tài)特征一致的菌落進行革蘭氏染色鏡檢。

1.2.2 生化反應(yīng) 將分離純化的菌株按說明書進行操作，接種于葡萄糖、木糖、乳糖、麥芽糖、鳥氨酸、賴氨酸、尿素酶，于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察分離菌的生化特性并參照文獻進行鑒定[7]。

1.2.3 細菌16S rRNA的PCR檢測 參照細菌DNA提取試劑盒說明書提取分離菌株基因組DNA。設(shè)計16S rRNA通用引物，引物序列為：27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTGTTACGACTT-3′)，預(yù)期擴增長度1 465 bp。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，細菌基因組2 μL，2×TaqPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 7.2 μL。PCR 反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，共30個循環(huán)；72℃ 10min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后膠回收送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，將測序結(jié)果與GenBank中參考株的基因序列進行比對，采用MEGA6.0軟件中的Neighbor-Joining法建立其系統(tǒng)發(fā)育樹并采用DNA Star 7.1進行同源性分析。

1.2.4 藥物敏感性試驗 通過WTO推薦的Kirby-Bauer(K-B)紙片瓊脂擴散法測定14種抗菌藥物的耐藥性，參照美國臨床與實驗室標準化協(xié)會(CLSI)文件(M100-S21)進行結(jié)果判定。

1.2.5 毒力因子基因擴增 參考相關(guān)文獻[8-9]對9種毒力基因進行PCR擴增，擴增引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，細菌基因組2 μL，2×TaqPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 7.2 μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，退火30 s(表1)，72℃ 35 s，共35個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.6 耐藥基因PCR檢測 參考相關(guān)文獻[10-14]擴增β-內(nèi)酰胺類blaSHV、blaTEM、CTM-X、OXA-48基因，四環(huán)素類tetA、tetB基因 ，喹諾酮類qnrA、qnrB、qnrS、qepA基因，氨基糖苷類aac(3)-Ⅱ基因，引物信息詳見表2。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以合成的引物進行耐藥基因PCR擴增，PCR反應(yīng)體系(20 μL)上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，細菌基因組2 μL，2×TaqPCR Master Mix 10μL，ddH2O 7.2 μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，退火30 s(表2)，72℃ 35 s，共35個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

表1 大腸埃希氏菌毒力因子PCR信息

2 結(jié)果

2.1 菌株分離鑒定

初步分離的疑似菌在綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上長出較均一的圓形、邊緣整齊、表面有光澤的灰色菌落，在麥康凱培養(yǎng)基上長出邊緣光滑整齊、粉紅色扁圓形小菌落(圖1)。經(jīng)革蘭氏染色后，在顯微鏡下觀察為革蘭氏陰性菌，單個或成對存在，無芽孢，有菌毛，兩端鈍圓的粗短桿菌(圖2)，10份腸道內(nèi)容物共分離出9株疑似菌株，分別命名為TB1、TB2、TB3、TB4、TB5、TB6、TB7、TB8、TB9。

2.2 生化反應(yīng)結(jié)果

9株分離株均可利用葡萄糖、木糖、乳糖，且靛基質(zhì)試驗為陽性，尿素、枸櫞酸鹽試驗為陰性，9株分離菌與《伯杰氏細菌鑒定手冊》中的大腸埃希氏菌生化特性相符(表3)。

2.3 分離株16S rRNA基因擴增結(jié)果及遺傳進化分析

將16S rRNA基因擴增產(chǎn)物經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶與預(yù)期相符(1 465 bp)(圖3)。序列對比結(jié)果表明，分離株16S rRNA基因序列與GenBank中大腸埃希氏菌參考株16S rRNA基因序列的相似性達99%。用MEGA 6.0軟件和MegAlign軟件對分離株的16S rRNA基因序列與參考菌株(表4)構(gòu)建遺傳進化樹,并進行相似性分析，結(jié)果表明，TB1、TB3、TB4、TB5、TB7、TB8與MG602206雞源性大腸埃希氏菌和MH671425豬源性大腸埃希氏菌處于較近一支；TB6與JF513979豬源性大腸埃希氏菌處于較近一支；TB2與KU156692人源性大腸埃希氏菌處于較近一支(圖4)，TB1～TB9的相似性在98.9%以上，其余分離株與參考株相似性均在97.5%以上(圖5)。

表2 耐藥基因引物序列及擴增條件

圖1 菌落形態(tài)觀察

圖2 革蘭氏染色鏡檢圖(100×)

表3 分離菌株生化鑒定結(jié)果

2.4 細菌藥敏試驗結(jié)果

9株分離菌株中，僅TB2、TB3對氨芐西林高度敏高(抑菌圈直徑≥15 mm)，其他菌株對氨芐西林均耐藥(抑菌圈=0 mm)。TB8對頭孢噻肟耐藥，其他菌株對頭孢噻肟高度敏感。TB4、TB5對頭孢拉定耐藥，其他菌株對頭孢拉定中度和高度敏感(10 mm≤抑菌直徑<15 mm)。TB8對苯唑西林高敏，其他菌株均對苯唑西林耐藥。TB1、TB3、TB4、TB9對四環(huán)素耐藥，其他菌株對四環(huán)素中度敏感。TB1、TB2、TB7、TB8對多西環(huán)素耐藥，其他菌株對多西環(huán)素中度或高度敏感(表5)。TB8、TB9對氧氟沙星耐藥，其他菌株對氧氟沙星中度或高度敏感。分離菌株對其余7種藥呈現(xiàn)中度或高度敏感。

M.DNA 標準DL 5 000;1～9.分離株TB1～TB9；N.陰性對照

表4 大腸埃希氏菌遺傳進化分析參考菌株

圖4 分離菌株16S rRNA基因基序列進化樹

圖5 分離菌株與部分大腸埃希氏菌16S rRNA基因核酸序列同源性對比

2.5 毒力基因檢測結(jié)果

對分離鑒定的菌株進行9種毒力基因PCR擴增(圖6)，只有eaeA基因擴增出來，9株分離株均攜帶eaeA毒力基因，未檢測到LT、STa、STb、escV、ST×1、ST×2、pic、aggR毒力基因。

M.DNA 標準DL 1 200;1～9.分離株TB1～TB9；N.陰性對照

2.6 耐藥基因檢測結(jié)果

9株分離株均檢測到tetA、tetB、TEM耐藥基因，檢出率為100%，TB4、TB5、TB8、TB9分離菌株檢測出CTX-M耐藥基因，檢出率為44.4%，其他耐藥基因均未檢測出(圖7～圖10)。

M.DNA 標準DL 600;1～9.分離株TB1～TB9；N.陰性對照

M.DNA 標準DL 600;1～9.分離株TB1～TB9；N.陰性對照

M.DNA 標準DL 600;1～9.分離株TB1～TB9；N.陰性對照

M.DNA 標準DL 1 200;4、5、8、9.分離株TB4、TB5、TB8、TB9；N.陰性對照

3 討論

大腸埃希氏菌作為腸道中重要的正常菌群，屬于條件致病菌，當宿主免疫力下降或者細菌侵入腸道外組織或器官時，就會引起疾病。本文對10份普通級樹鼩的腸道內(nèi)容物進行大腸埃希氏菌的分離培養(yǎng)，共分離出9株大腸埃希氏菌。對分離菌進行藥敏試驗和耐藥基因的檢測，發(fā)現(xiàn)9株大腸埃希氏菌對頭孢哌酮最為敏感， 對頭孢他啶、慶大霉素、米諾環(huán)素高度敏感，對苯唑西林耐藥率為88.8%，對氨芐西林耐藥率77.8%，對四環(huán)素耐藥率為44.4%，可能在日常飼養(yǎng)時存在氨芐西林、四環(huán)素等藥物的濫用現(xiàn)象。擴增耐藥基因，共檢測出β-內(nèi)酰胺類耐藥基因TEM、CTX-M，四環(huán)素類耐藥基因tetA、tetB等4種基因。細菌的耐藥性與相關(guān)的耐藥基因的檢出率基本呈正相關(guān)。通過對所分離出的大腸埃希氏菌進行16S rRNA 測序，并與其他動物源大腸埃希氏菌序列構(gòu)建進化樹分析，發(fā)現(xiàn)分離株與豬源大腸埃希氏菌、雞源大腸埃希氏菌、人源大腸埃希氏菌親緣關(guān)系較近，提示分離株可能成為樹鼩與其他動物交叉感染的潛在病原。對9株分離菌株進行9種毒力基因的檢測，發(fā)現(xiàn)eaeA毒力基因的攜帶率為100%，其余毒力基因均未檢出，說明這9株分離株腹瀉大腸埃希氏菌病原主要以腸致病性大腸埃希氏菌(EPEC)為主。

表5 分離菌株藥敏試驗結(jié)果

樹鼩作為一種特殊的實驗動物已被應(yīng)用于多種疾病的研究，雖然已有一些樹鼩微生物檢測的相關(guān)報道，但對樹鼩身上所攜帶的病原微生物的詳細研究還不夠深入，本文通過對從樹鼩腸道內(nèi)容物分離出的9株大腸埃希氏菌進行分型鑒定、分析其與其他動物源大腸埃希氏菌的親緣關(guān)系，并進行耐藥性分析和毒力因子鑒定，為進一步了解樹鼩源大腸埃希氏菌提供參考依據(jù)。