肖 琦，賈妮娜，謝小東，施 君，陳曉霞，于美玲，韋英益，胡庭俊

(廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005)

柴胡和桂枝相關(guān)方劑具有抗炎、抗氧化、增強(qiáng)免疫力和改善代謝等作用[1]，以柴胡桂枝干姜湯為母本延伸出的藥劑在臨床中可用于治療胃腸型感冒、潰瘍性結(jié)腸炎、慢性膽囊炎和病毒性肝炎等疾病[2]，具有很好的抗炎效果。

本試驗(yàn)采用的柴桂口服液經(jīng)由《傷寒論》中柴胡桂枝干姜湯設(shè)計(jì)而來(lái)，通過(guò)小柴胡湯和桂枝湯加減而成[3]。本試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[4-5]小鼠體內(nèi)炎癥模型構(gòu)建方法，以脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)為致炎劑，建立小鼠體內(nèi)炎癥模型，研究柴桂口服液對(duì)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、白介素-8(interleukin-8,IL-8)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和一氧化氮(nitric oxide,NO)表達(dá)和分泌水平的調(diào)節(jié)作用，以期在臨床用藥時(shí)為該方劑的使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 柴桂口服液(批號(hào):20190901)，河南牧翔動(dòng)物藥業(yè)有限公司中試生產(chǎn)，規(guī)格：1.44 g/mL ；地塞米松注射液(批號(hào):180602)，上海同仁藥業(yè)股份有限公司上海獸藥廠產(chǎn)品，規(guī)格5 mg/5 mL；脂多糖(批號(hào)：320v0320)，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；小鼠TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β試劑盒(批號(hào)分別為M191008-102a、M190919-004a、M191008-104a、M91008-001a)，欣博盛生物有限公司產(chǎn)品；一氧化氮(NO)、總蛋白(Total protein，TP)試劑盒(批號(hào)分別為20191007、20190930)，南京建成生物試劑有限公司產(chǎn)品；Cham QTM Universal SYBR Qpcr master Mix(批號(hào)20210124)、StarScript Ⅱ First strand cDNA synthesis Mix(批號(hào)9AHO1)；RNA isolater R401-01(批號(hào)2021.05.17)，南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品；氯仿、無(wú)水乙醇等為分析純。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡昆明種小鼠70只，SPF級(jí)，臨床健康，體重18 g～22 g，雌雄各半，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(湘)2016-0002。動(dòng)物購(gòu)買(mǎi)后適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫25℃±2℃，相對(duì)濕度40%～75%，室內(nèi)無(wú)對(duì)流風(fēng)。

1.1.3 主要儀器 TECAN多功能酶標(biāo)定量?jī)x(Infinite M200 PRO)，帝肯(上海)貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；Servicebio高速組織勻漿儀(kz-Ⅱ)，武漢賽維爾生物科技有限公司產(chǎn)品；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche LightCycler?96，瑞士羅氏(Roche)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 藥物劑量使用換算 據(jù)文獻(xiàn)[6]，在傳統(tǒng)中藥方劑中，牛平均體重約300 kg，單味藥用量約15 g/頭～35 g/頭，一般藥物用藥劑量在25 g/頭，雞體重約1.5 kg，用藥劑量為牛劑量的1/40～1/20，即單味中藥用量約為0.625 g/只～1.25 g/只，柴桂口服液組方按照牛劑量約為144 g，換算后成年雞用量約為3.6 g～7.2 g。采用體表面積法換算小鼠用量，由于沒(méi)有雞準(zhǔn)確的體表面積，且雞與兔體重相近，均計(jì)為1.5 kg，即采用家兔作為雞的換算方法：常見(jiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物兔(雞)標(biāo)準(zhǔn)體重為1.5 kg，按照文獻(xiàn)[7]中常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及人的體表面積比例(劑量換算用)所提及1.5 kg家兔與20 g小鼠換算系數(shù)為0.040，即小鼠的用藥量應(yīng)低于7.2×0.040/0.020=14.4 g/kg，所以灌胃小鼠時(shí)用藥劑量應(yīng)在14.4 g/kg以內(nèi)，故本試驗(yàn)給藥劑量設(shè)計(jì)為2.5、5、10、15 g/kg。

1.2.2 動(dòng)物分組與處理方法 動(dòng)物分組方法參照文獻(xiàn)[8]分組方法，將70只SPF級(jí)雌雄各半的昆明小鼠采用分層隨機(jī)分組法分為7組，分別為空白對(duì)照組、LPS對(duì)照組、地塞米松組(5 mg/kg體重)、柴桂口服液Ⅰ～Ⅳ組(2.5、5、10、15 g/kg體重)。其中，地塞米松組灌胃純化水(0.4 mL)，同時(shí)腹腔注射5 mg/kg體重(0.2 mL)地塞米松溶液；柴桂口服液Ⅰ～Ⅳ組分別按各組劑量灌胃柴桂口服液(0.4 mL)，腹腔注射生理鹽水(0.2 mL)；空白對(duì)照組與LPS對(duì)照組灌胃純化水(0.4 mL)，同時(shí)腹腔注射生理鹽水(0.2 mL)；各組每日給藥1次，連續(xù)5 d，于最后一次給藥1 h后，除空白對(duì)照組腹腔注射生理鹽水，其余各組參照文獻(xiàn)[9]LPS小鼠體內(nèi)炎癥模型構(gòu)建方法，腹腔注射10 mg/kg體重的LPS溶液建立小鼠體內(nèi)炎癥模型。LPS處理后6 h，CO2窒息處死小鼠并進(jìn)行解剖，觀察解剖后的臟器變化情況，采集脾臟，稱重，放入滅菌的EP管中，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 脾臟組織中炎癥因子分泌水平的測(cè)定 LPS處理后6 h，處死小鼠并進(jìn)行剖檢，觀察臟器變化情況，采集脾臟，稱重，放入滅菌的EP管中，置-80℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?/2脾臟組織，按照質(zhì)量體積比1∶9加入生理鹽水，使用高速勻漿儀在60 Hz頻率下，勻漿2 min，1 500 r/min離心10 min，取脾臟勻漿上清液，依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)脾臟組織中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、NO和TP含量。

1.2.4 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中相關(guān)基因序列設(shè)計(jì)TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β等引物，引物由廣西南寧市擎科生物技術(shù)有限公司合成(表1)。

表1 引物序列

1.2.5 RT-qPCR檢測(cè)脾臟組織中炎癥因子表達(dá)量 取小鼠脾臟組織，按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA和反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄前檢測(cè)RNA完整性；用實(shí)時(shí)定量PCR方法對(duì)目的基因和內(nèi)參基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 10 s，60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，檢測(cè)各基因表達(dá)量?；虮磉_(dá)采用2-△△CT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn)

除空白對(duì)照組外，其余各組在腹腔注射LPS溶液建模6 h后，各組小鼠出現(xiàn)扎堆、眼睛分泌物增多、精神沉郁等現(xiàn)象，造模期間無(wú)死亡。

2.2 柴桂口服液對(duì)小鼠脾臟中炎性因子含量的影響

在連續(xù)5 d灌胃不同劑量柴桂口服液后，對(duì)小鼠腹腔注射LPS建立體內(nèi)炎癥模型，LPS對(duì)照組脾臟勻漿中IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β和NO含量顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)；地塞米松組各炎性因子含量均顯著低于LPS組(P<0.05)；柴桂口服液Ⅰ組脾臟勻漿液中IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β含量與LPS組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)，NO含量顯著低于LPS組(P<0.05)但與空白對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，柴桂口服液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組脾臟勻漿液中IL-6、IL-1β和TNF-α含量顯著低于LPS對(duì)照組(P<0.05)，柴桂口服液Ⅲ、Ⅳ組脾臟勻漿液中IL-8含量顯著低于LPS對(duì)照組(P<0.05)，柴桂口服液Ⅰ至Ⅳ組NO含量均顯著低于LPS模型組(P<0.05)(表2)。

表2 柴桂口服液對(duì)小鼠脾臟中炎性因子分泌的影響

2.3 柴桂口服液對(duì)小鼠脾臟中炎性因子表達(dá)的影響

各組在腹腔注射LPS后，脾臟組織中TNF-α、IL-1β表達(dá)均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)；柴桂口服液Ⅰ、Ⅳ組與地塞米松組脾臟中TNF-α表達(dá)顯著低于LPS對(duì)照組(P<0.05)；柴桂口服液各劑量組及地塞米松組的IL-6、IL-1β、IL-8表達(dá)顯著低于LPS對(duì)照組(P<0.05)，其中，柴桂口服液Ⅰ、Ⅳ組IL-6的表達(dá)與地塞米松組無(wú)顯著差異(P>0.05)，柴桂口服液Ⅰ組IL-1β表達(dá)與地塞米松組無(wú)顯著差異(P>0.05)，柴桂口服液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組IL-1β的表達(dá)顯著低于地塞米松組(P<0.05)(表3)。

表3 柴桂口服液對(duì)小鼠脾臟中炎性因子基因表達(dá)水平的影響

3 討論

脂多糖是一種重要的炎癥誘導(dǎo)因子，廣泛用于體內(nèi)外炎癥模型的構(gòu)建，在體內(nèi)注射以后可導(dǎo)致血液和組織中炎性因子分泌水平上升，有良好的致炎效果，它可以通過(guò)激活TLR4/NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性因子的過(guò)量表達(dá)，介導(dǎo)免疫應(yīng)激引起的炎癥反應(yīng)[10]。但在體內(nèi)炎癥模型中，根據(jù)不同的試驗(yàn)需求使用的劑量和作用時(shí)間不同[11]，本次試驗(yàn)選用10 mg/kg體重腹腔注射LPS溶液成功建立小鼠體內(nèi)炎癥模型，臨床可見(jiàn)各LPS腹腔注射組小鼠出現(xiàn)扎堆，眼睛分泌物增多，LPS組脾臟勻漿液中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8和NO含量顯著高于空白對(duì)照(P<0.05)，IL-1β、IL-6、TNF-α與IL-8的表達(dá)量顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)，與文獻(xiàn)[4-5]模型建立結(jié)果相似。

許多中藥及其提取物可以調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥因子分泌，具有保護(hù)神經(jīng)、抗病毒、抗炎等作用，如柴胡的主要活性成分柴胡皂苷具有較強(qiáng)抗炎活性，它能夠抑制促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)從而增強(qiáng)抗炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1 的表達(dá)[12]，NF-κB信號(hào)通路是柴胡皂苷發(fā)揮抗炎作用主要抑制的抗炎信號(hào)通路[13]。許多研究表明含有柴胡、桂枝的組方具有抗炎等作用，與本次試驗(yàn)結(jié)果相似[14]。

本試驗(yàn)連續(xù)5 d灌胃小鼠2.5 g/kg～15 g/kg柴桂口服液后，用LPS建立炎癥模型，并以地塞米松為陽(yáng)性藥物對(duì)照，隨著藥物劑量的增加，脾臟IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β含量呈下降趨勢(shì)，且柴桂口服液Ⅰ組與Ⅳ組的IL-6 、IL-8、TNF-α、IL-1β水平皆有顯著差異，呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系；脾臟NO水平呈下降趨勢(shì)。與之相似，脾臟組織中IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β的表達(dá)量隨著用藥劑量的增大相比于LPS對(duì)照組呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。

本研究證實(shí)10 mg/kg LPS可以作為一種小鼠體內(nèi)炎癥模型的建模劑量，并可以取得較好的建模效果；柴桂口服液在2.5 g/kg體重～15 g/kg體重劑量范圍內(nèi)，可以降低LPS誘導(dǎo)小鼠的體內(nèi)炎癥模型脾臟組織中炎癥因子的基因表達(dá)及分泌，具有較好的抗炎作用，對(duì)機(jī)體有一定的保護(hù)作用，其抗炎機(jī)制的臨床應(yīng)用前景值得進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)。