楊洪早,李錦宇,王東升*,張世棟,董書偉,閆寶琪,那立冬,吳春麗,鄧 俊,吳冠連,陳新麗,趙留濤,朱 凱, 梁永喜,嚴(yán)作廷,2*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州 730050; 2.農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730050;3.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南鄭州 450001; 4.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

馬香苓口服液是由廣藿香、白術(shù)、馬齒莧等制成的純中藥口服液，臨床主要用于治療病毒引起的仔豬腹瀉。研究表明，該制劑工藝穩(wěn)定可行，無刺激性，治療仔豬腹瀉總有效率達(dá)96%，治愈率達(dá)90%。為進(jìn)一步控制該制劑的質(zhì)量，便于臨床藥效學(xué)研究，故對該方劑做其定量的方法研究[1-2]。白術(shù)具有健脾益氣，燥濕利水，止汗，安胎之功效；用于脾虛食少，腹脹泄瀉，痰飲眩悸，水腫，自汗，胎動(dòng)不安[3]。在馬香苓口服液中作為臣藥，它的主要成分作用為白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和蒼術(shù)酮等，該類成分具有調(diào)節(jié)胃腸道功能和促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收的作用，也是控制白術(shù)藥材質(zhì)量的主要指標(biāo)之一[4]。據(jù)報(bào)道[5]，其白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量可以作為評定中藥散劑、口服液水提工藝等指標(biāo)。因此，采用高效液相色譜法(HPLC)測定本制劑中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量并做方法學(xué)研究，可以為該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ(含量99.9%，20 mg，批號：11978-201501),中國食品藥品檢定研究院產(chǎn)品;馬香苓口服液，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所研制(批號20160324、20160616、20160623、20160625、20160704、20160705、20160712、20160714、20160717、20160721);甲醇(色譜純，規(guī)格1 L，批號20161006)，天津川普偉業(yè)科技有限公司產(chǎn)品;水為超純水，石油醚(60℃～90℃，批號20160901)煙臺市雙雙化工有限公司產(chǎn)品;其余有機(jī)試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備 DIONEX UItiMate 3000高效液相色譜儀，美國賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；NewClassic MS 電子天平，梅特勒-托利多上海有限公司產(chǎn)品；Milli-Q型超純水機(jī)，美國Millipore公司產(chǎn)品；KQ 3200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18(5 μm×4.6 mm×250 mm，美國Agilent Technologies)，以水和甲醇為流動(dòng)相梯度洗脫(表1)，流速0.8 mL/min，柱溫25℃，檢測波長223 nm，進(jìn)樣量30 μL。

1.2 方法

溶液制備：以甲醇和500 mL/L甲醇水溶液為空白溶液。精密稱取白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ1.46 mg，置2 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，密封，搖勻，即得濃度為0.73 mg/mL的對照品儲(chǔ)備液。精密移取白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL，置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成濃度為0.073 mg/mL，作為白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照溶液。量取中藥口服液25 mL于125 mL分液漏斗，加石油醚(60℃～90℃)振搖提取4次，每次40 mL，收集上層石油醚有機(jī)溶液，水浴揮干(水浴鍋溫度90℃)，殘?jiān)?00 mL/L甲醇水溶液使其溶解，并定容至10 mL容量瓶，即得供試品溶液。取按處方比例并以同樣制備工藝的缺白術(shù)的陰性對照口服液，按供試品溶液制備法制得陰性對照溶液。

表1 流動(dòng)相梯度

2 結(jié)果

2.1 專屬性試驗(yàn)

取空白、對照品、供試品和陰性對照溶液，過0.22 μm有機(jī)微孔濾頭于1 mL進(jìn)樣瓶中，密封，參照文獻(xiàn)[2]并按色譜條件自動(dòng)進(jìn)樣測定，每個(gè)樣品進(jìn)樣2次，記錄色譜圖(圖1)，結(jié)果白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品溶液理論板數(shù)為13327；在與白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品溶液色譜峰對應(yīng)的位置上，供試品(26.063 min)與其對照品(26.419 min)保留時(shí)間一致，其理論塔板數(shù)為21420，且與其他組分分離度大于1.5；陰性對照溶液在對照品與供試液相應(yīng)的保留時(shí)間內(nèi)未檢出色譜峰，表明樣品中其他成分不干擾白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的測定。

2.2 線性關(guān)系考察

精密量取白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照液1 mL于2 mL容量瓶，加色譜甲醇定容至刻度，依次進(jìn)行倍比稀釋得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，其濃度分別為73.00、36.50、18.25、9.13、4.56、2.28μg/mL，按色譜條件自動(dòng)進(jìn)樣上述系列溶液各30 μL，每個(gè)濃度進(jìn)樣2次，記錄色譜圖并測定峰面積。以白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ峰面積(y)縱坐標(biāo)，檢測質(zhì)量濃度(x，μg/mL)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸(圖2)，得回歸方程y=1.356 7x+0.857 6，R2=0.992，結(jié)果表明，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ檢測質(zhì)量濃度在0.57 μg/mL～73.00 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗(yàn)

精密量取對照品溶液，按色譜條件自動(dòng)進(jìn)樣30 μL，連續(xù)進(jìn)針6次，記錄色譜圖，測定峰面積。計(jì)算結(jié)果保留時(shí)間RSD=3.04%，相對峰面積RSD=2.00%，表明儀器精密度良好。

圖1 專屬性試驗(yàn)(高效液相色譜圖)

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批中藥口服液，按供試品溶液制備法平行制備6份。按色譜條件進(jìn)樣30 μL，每個(gè)樣品連續(xù)進(jìn)樣2次，記錄色譜圖，測定峰面積。計(jì)算結(jié)果得相對峰面積RSD=6.00%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批中藥口服液(批號：20160721)，按供試品溶液制備法制備，考察其日內(nèi)精密度與日間精密度。分別于0、2、4、8、12、16、24 h內(nèi)及在0、12、24、36、48、60、72 h之內(nèi)分別精密量取供試液，按照色譜條件進(jìn)樣30 μL，每個(gè)樣品進(jìn)樣2次，記錄色譜圖，測定峰面積。計(jì)算結(jié)果得24 h內(nèi)平均含量2.27 μg/mL，相對平均含量RSD=8.14%，相對峰面積RSD=6.00%；72 h內(nèi)平均含量2.20 μg/mL，相對平均含量RSD=9.54%，相對峰面積RSD=8.58%，表明本方法在72 h內(nèi)重復(fù)性、穩(wěn)定性良好。

圖2 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ 5.98 mg于5 mL容量瓶，加甲醇溶解并定容至刻度，得其濃度為1.196 mg/mL白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照液，根據(jù)前期研究算出供試液含量，特此進(jìn)行配制高、中、低3個(gè)不同標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為加樣標(biāo)液，分別取0.6、0.5、0.4 mL于10 mL容量瓶，加甲醇稀釋并定容至刻度，得其加樣標(biāo)液濃度分別為71.76、59.8、47.84 μg/mL。

精密量取同批次(批號：20160721)中藥口服液置于分液漏斗中，分為9份，每份樣品液為25 mL，分為高中低3組，每3份口服液為1組，各分別精密加入1 mL白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照液于分液漏斗中，混勻，按供試品溶液制備法制備，即得加樣回收供試液。按色譜條件進(jìn)樣，每個(gè)樣品進(jìn)樣2次，記錄色譜圖，測定峰面積，并計(jì)算含量與回收率。其平均回收率為98.04%，RSD=11.89%，表明回收相對較好(表2、表3)。計(jì)算公式為：測得加入量=測得總量-中藥口服液本身含有量，回收率=測得加入量/實(shí)際加入量×100%

表2 加樣標(biāo)液高、中、低濃度與未加標(biāo)樣馬香苓口服液20160721批供試液結(jié)果

2.7 耐用性試驗(yàn)

研究的變動(dòng)因素主要有：柱溫分別為20℃、25℃、30℃，流速0.8 mL/min，色譜柱為ZORBAX SB-C18(5 μm×4.6×250 mm,Agilent Technologies)；流速分別為0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min，柱溫25℃，色譜柱為ZORBAX SB-C18(5 μm×4.6×250 mm,Agilent Technologies)；色譜柱分別為ZORBAX SB-C18(5 μm×4.6×250 mm,Agilent Technologies)、PhenomenexGemini C18 110A(5 μm×250 mm×4.60 mm)、Vydac 218 TP C18(5 μm×250 mm×4.60 mm， Grace)，柱溫25℃，流速0.8 mL/min。

按以上變量色譜條件進(jìn)樣，其中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照液(73μg/mL)進(jìn)樣10 μL，20160721批供試液進(jìn)樣30 μL，每個(gè)樣品進(jìn)樣2次，記錄色譜圖，測定峰面積。當(dāng)柱溫改變，其他條件不變時(shí)，相對保留時(shí)間RSD=0.44%，相對含量RSD=4.15%；當(dāng)流速改變，其他條件不變時(shí)，相對保留時(shí)間RSD=1.25%，相對含量RSD=3.49%；當(dāng)換用不同型號色譜柱，其他條件不變時(shí)，相對保留時(shí)間RSD=0.64%，相對含量RSD=8.20%。從相對RSD值來看，不同型號色譜柱對保留時(shí)間差異最小，對其含量變化值相對較大；柱溫和流速的改變對其保留時(shí)間和含量變化差異均較小(表4～表6)。

因此，在測定白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量時(shí)柱溫應(yīng)保持在25℃，流速保持在0.8 mL/min，選用Phenomenex Gemini C18 110A(5 μm×250 mm×4.60 mm)柱子進(jìn)行測定，其所得含量相對較高、穩(wěn)定且峰形較好，進(jìn)樣重復(fù)性好。

2.8 10批樣品含量測定

分別取10批樣品(批號：20160324、20160616、20160623、20160625、20160704、20160705、20160712、20160714、20160717、20160721、20160724)按供試液法每批次各平行制備2份供試液，按色譜條件自動(dòng)進(jìn)樣測定，其對照液白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ(濃度71.76 μg/mL)分別進(jìn)樣30、20、10 μL，且每個(gè)進(jìn)樣量分別進(jìn)樣2次；每份供試液各進(jìn)樣2針，記錄色譜圖和峰面積，并計(jì)算含量以及RSD值(表7)，計(jì)算得馬香苓口服液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ不同進(jìn)樣量含量分別為2.15、2.58、2.54，平均含量為2.43 μg/mL，相對含量RSD=9.82%?？紤]到大規(guī)模生產(chǎn)中的各種損失和測量誤差，取其平均值的80%作為其含量限度，即2.43×0.80=1.94，故暫定馬香苓口服液中白術(shù)藥材按白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ計(jì)不少于1.94 μg/mL。

表3 馬香苓口服液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表4 柱溫耐用性考察

3 討論

3.1 待測組分選擇

白術(shù)的內(nèi)酯類成分具有抗炎、增強(qiáng)免疫、利尿等作用，而且還可以調(diào)理胃腸道和促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，其中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅲ的藥理作用較為明顯，也是發(fā)揮白術(shù)健脾益氣、燥濕利水的功效之一[6]。在炮制過程中蒼術(shù)酮被氧化，其產(chǎn)物是雙白術(shù)內(nèi)酯、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ，同時(shí)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ在經(jīng)高溫加熱過程中會(huì)生成白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ[7-8]；從氧化反應(yīng)機(jī)制來看，蒼術(shù)酮易與水發(fā)生加成反應(yīng)，生成半縮醛羥基，而水又導(dǎo)致半縮醛羥基開環(huán)生成羰基，羰基進(jìn)一步被氧化生成羧基，雜化軌道平面兩側(cè)容易被羥基進(jìn)攻羧基，羥基并與羧基進(jìn)行分子內(nèi)脫水反應(yīng)，可生成白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和表白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，而白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ在7位上與碳相連的氫相比較為活躍，易被羥基取代而生成白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ[9]。白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的結(jié)構(gòu)較其穩(wěn)定，更有利于含量測定。

表5 流速耐用性考察(0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min)

表6 不同色譜柱耐用性考察

表7 馬香苓口服液10批樣品含量測定結(jié)果(n=2)

3.2 供試液前處理

按照萃取溶劑的方法，考察了正丁醇、石油醚(30℃～60℃)、石油醚(60℃～90℃)、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，經(jīng)過與標(biāo)準(zhǔn)品色譜法相比較，石油醚(60℃～90℃)所萃取得到的供試液峰形較好，分離度高，但其前面有一小雜峰，后改用甲醇、500 mL/L甲醇水溶液、乙醇、750 mL/L乙醇等作為復(fù)級溶液，考慮到白術(shù)內(nèi)酯類成分的穩(wěn)定性，并同時(shí)選擇了考察柱溫的最佳條件(20℃、30℃、35℃)，結(jié)果表明，在柱溫為25℃、選用500 mL/L甲醇水溶液作為復(fù)級溶液，所出的峰形分離度高，峰形對稱且含量較高。有關(guān)提取次數(shù)優(yōu)選，在其他相同條件下，用石油醚(60℃～90℃)振搖提取3～5次，結(jié)果表明，用供試品提取3次與4、5次有較大差異，而4、5次時(shí)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量無明顯差異，故選擇用石油醚(60℃～90℃)振搖提取4次[10-11]。

3.3 色譜條件選擇

本制劑通過單因素試驗(yàn)，對其柱子型號、柱溫、流速、流動(dòng)相比例進(jìn)行優(yōu)化和系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以及波長的選擇，用紫外分光光度計(jì)測量白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的最大吸收波長，結(jié)果在223 nm處吸收峰最強(qiáng)[12-13]；在流動(dòng)相選擇上參考其他學(xué)者研究，用標(biāo)準(zhǔn)品白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ進(jìn)行判定等度條件下使用甲醇-水(60∶40)、乙腈-水(60∶40)的出峰情況，試驗(yàn)表明用甲醇-水(60∶40)對其標(biāo)準(zhǔn)品的峰更好，含量更高，同樣條件下進(jìn)樣測定供試液，發(fā)現(xiàn)其分離度達(dá)不到《中國獸藥典》的要求，雜峰較多，故進(jìn)行了梯度洗脫，考慮中藥成分復(fù)雜多樣，會(huì)影響色譜柱的質(zhì)量以及下一針進(jìn)樣的出峰情況，故在樣品目標(biāo)峰等完全出完過后使用了純甲醇進(jìn)行沖洗色譜柱10 min，然后用15 min再平衡到流動(dòng)相的初始比例以方便下一針進(jìn)樣分析，最終確定了流動(dòng)相條件[14-15]。在其他條件不變情況下，柱溫的改變對其供試品溶液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.15%，且柱溫過高，易導(dǎo)致峰形不對稱，有拖尾現(xiàn)象，綜合考慮，最終選用柱溫為25℃；在柱溫25℃等其他條件不變情況下，改變流速0.8 mL/min±0.2 mL/min，發(fā)現(xiàn)供試品溶液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.49%，說明改變流速對樣品中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的測定無影響，對其樣品出峰時(shí)間早晚有一定影響，但對峰的對稱性、分離度無影響[16]，故最終確定流速為0.8 mL/min。

試驗(yàn)證明以流動(dòng)相甲醇-水(體積比)進(jìn)行梯度洗脫(甲醇60→65、水40→35運(yùn)行30 min，甲醇65→100、水35→0運(yùn)行2 min，甲醇100、水0運(yùn)行10 min，甲醇100→60、水0→4運(yùn)行3 min，甲醇60、水40運(yùn)行15 min)、檢測波長223 nm、柱溫25℃、流速0.8 mL/min的色譜條件對白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的測定具有較強(qiáng)的專屬性，能達(dá)到基線平衡、與其他組分離度較高、峰形對稱、陰性對照無干擾、大大縮短分析時(shí)間，便于作為含量測定和方法學(xué)研究。

建立的HPLC方法測定白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量的線性關(guān)系良好，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)的平均峰面積RSD分別為2.00%、6.00%和8.58%；平均加樣回收率為98.04%，RSD=11.89%，其回收率相對良好，進(jìn)行10批樣品的含量測定，暫定馬香苓口服液中白術(shù)藥材按白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ計(jì)不少于1.94 μg/mL。表明所建立的HPLC特征圖譜專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確可行、簡便，可快速用于鑒別馬香苓口服液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ以及其含量，可有效地用于該制劑的質(zhì)量控制，同時(shí)該方法還可以為進(jìn)一步加強(qiáng)含白術(shù)類化合物的制劑質(zhì)量控制提供參考，為申報(bào)新獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供一定的數(shù)據(jù)支撐。