朱 鑫，冉丹丹*，湯 承，岳 華

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041)

冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白(cold-inducible RNA binding protein，CIRP)又稱為A18 hnRNP，屬于RNA結(jié)合蛋白中的核內(nèi)異質(zhì)核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP)家族，是一種在脊柱動物的組織器官內(nèi)廣泛存在且表達(dá)高度保守的蛋白。近年來，CIRP作為研究重點(diǎn)，其許多功能被相繼證實(shí)，如人們發(fā)現(xiàn)CIRP除了在低溫(29℃)刺激下表達(dá)明顯增高外，還能被其他應(yīng)激條件如缺氧、紫外線等誘導(dǎo)而過量表達(dá)，并對細(xì)胞在上述應(yīng)激條件下起到保護(hù)作用[1-3]。在絲裂原活化蛋白激酶信號通路 (MAPK/ERK)和核因子κB信號通路(NF-κB)的調(diào)控中均有CIRP的參與，其中MAPK信號通路中的ERK1/2途徑在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖過程當(dāng)中起關(guān)鍵性作用[4-5]，CIRP還能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的基本功能，包含細(xì)胞增殖和凋亡、細(xì)胞周期以及細(xì)胞骨架等過程[6-8]。

CIRP作為一個多功能蛋白，對作為生命最基本單位的細(xì)胞發(fā)育過程有重要的作用。在試驗(yàn)細(xì)胞進(jìn)行H2O2處理過程中，CIRP表達(dá)下調(diào)加重細(xì)胞凋亡，CIRP對心臟氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用[9],CIRP可能參與SISAP引起的早期肝損傷的病理進(jìn)程[10]。在雄性小鼠未成熟的精細(xì)胞中，CIRP通過與雙重特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶1B(Dyrk1b)相互作用來調(diào)節(jié)一些蛋白的磷酸化水平，從而促進(jìn)未分化精原細(xì)胞的增殖。本試驗(yàn)通過對CIRP過表達(dá)的乳倉鼠腎細(xì)胞(BHK-21)進(jìn)行研究，探索CIRP對BHK-21細(xì)胞增殖情況的影響，為研究CIRP的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 CIRP穩(wěn)定過表達(dá)及敲低CIRP的BHK-21細(xì)胞系由西南民族大學(xué)動物醫(yī)學(xué)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[11]及保存；CIRP過表達(dá)的BHK-21標(biāo)記為BHK-21-Cirp，CIRP敲低的標(biāo)記為BHK-21-ShCirp，只含有綠熒光報(bào)告載體的標(biāo)記為BHK-21-GFP。

1.1.2 主要試劑和儀器 DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰蛋白酶，美國Hyclone公司產(chǎn)品；碘化丙啶，美國Sigma公司產(chǎn)品；伊紅染液、蘇木素染液，常德比克曼生物科技有限公司產(chǎn)品。高速冷凍離心機(jī)(centrifuge 5804)，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；Casy TT細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，瑞士Roche公司產(chǎn)品；冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡S-4800，日本Hitachi公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 BHK-21細(xì)胞系 由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建Cirp過表達(dá)BHK-21細(xì)胞系后，經(jīng)過8次左右的傳代培養(yǎng)，BHK-21細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生變化，將其標(biāo)記為BHK-21-Cirp△。HE染色法觀察BHK-21細(xì)胞的形態(tài)，掃描電鏡觀察比較BHK-21的形態(tài)，細(xì)胞樣品經(jīng)過清洗、固定、梯度脫水、干燥和鍍金后置于掃描電鏡下觀察，用數(shù)碼成像系統(tǒng)采集適當(dāng)?shù)臉悠穲D像。

1.2.2 BHK-21細(xì)胞生長曲線的繪制及比生長速率的計(jì)算 用BHK-21-Cirp△和BHK-21-ShCirp分別與BHK-21-GFP進(jìn)行比較。第1組為BHK-21-Cirp△和BHK-21-GFP，第2組為BHK-21-ShCirp和BHK-21-GFP。將在25 cm2培養(yǎng)瓶中生長良好的BHK-21細(xì)胞消化制成懸液，按照Casy TT細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的使用方法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。 第1組的細(xì)胞起始濃度為3.2×105個/mL，第2組的細(xì)胞起始濃度為5.2×105個/mL，將其接種到六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入完全培養(yǎng)基，每孔終體積為2.5 mL。將細(xì)胞置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并觀察細(xì)胞生長情況。以24 h為一個時(shí)間間隔，每次取3個孔的細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及記錄數(shù)據(jù)。

(1)

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測比較BHK-21的細(xì)胞周期 將生長狀態(tài)良好的BHK-21-Cirp△、BHK-21-GFP、BHK-21-ShCirp用胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸液，收集后經(jīng)過清洗、固定，用含2.5 ml/L Triton X-100的PBS處理細(xì)胞5 min，用PBS清洗后加入1mL濃度為50 μg/mL 的碘化丙啶(PI)重懸細(xì)胞，室溫染色30 min。上機(jī)檢測前用300目濾網(wǎng)將樣品過濾。

2 結(jié)果

2.1 BHK-21細(xì)胞形態(tài)的變化

經(jīng)過反復(fù)凍存和復(fù)蘇，按照上述培養(yǎng)細(xì)胞的方法傳代培養(yǎng)至第8代左右時(shí)，BHK-21的細(xì)胞形態(tài)由原本的梭形逐漸變?yōu)榱藞A形，將其標(biāo)記為BHK-21-Cirp△(圖1),圖1中A、B、C為相鄰3代BHK-21細(xì)胞8 h的生長情況，可見每傳1代，形態(tài)變圓的細(xì)胞數(shù)量就越多；D、E、F為A、B、C對應(yīng)代次細(xì)胞24 h后的生長情況，也可清晰觀察到細(xì)胞變圓的過程。

圖1 BHK-21細(xì)胞形態(tài)的變化過程(100×)

HE染色結(jié)果見圖2。由于漂洗原因，細(xì)胞核被蘇木精染成了明顯的藍(lán)色或淺藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)被伊紅染成了粉紅色，部分接近紫色。染色結(jié)果可見BHK-21變形細(xì)胞的細(xì)胞核明顯增大，且大小不一，整個細(xì)胞呈飽滿狀，核質(zhì)比顯著高于正常形態(tài)的細(xì)胞。BHK-21正常細(xì)胞的細(xì)胞核較小，且大小均一，細(xì)胞呈細(xì)長狀。

圖2 BHK-21細(xì)胞HE染色結(jié)果(200×)

圖3中D、E、F分別為BHK-21正常形態(tài)在1 000×、2 000×、3 000×的形貌，細(xì)胞呈梭形，扁平狀，表面較為光滑，細(xì)胞表面只具有較少的微絨毛，無泡狀物；圖3A、B、C分別為BHK-21異常形態(tài)在1 000×、2 000×、3 000×的形貌，細(xì)胞呈圓形，且飽滿，表面不光滑，其中B和C可見細(xì)胞周圍具有大量的偽足和泡狀物，細(xì)胞由梭形變?yōu)榱瞬灰?guī)則的圓形，細(xì)胞表面極不光滑，周圍具有較多泡狀物，每個細(xì)胞幾乎都有許多長且發(fā)達(dá)的偽足，這些偽足從細(xì)胞膜邊緣伸出到無細(xì)胞區(qū)域，有的與鄰近細(xì)胞的偽足相互緊密連接或嵌合。

圖3 掃描電鏡觀察結(jié)果

2.2 CIRP促進(jìn)了BHK-21細(xì)胞的增殖

圖4 BHK-21-CIRP和BHK-21-GFP的細(xì)胞形態(tài)(100×)

圖5 BHK-21細(xì)胞的增殖曲線

2.3 CIRP對BHK-21細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞周期共包含靜止期/DNA合成前期(G0-1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)和有絲分裂期(M期)。經(jīng)過乙醇固定，Triton X-100處理，PI對DNA進(jìn)行染色后，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，結(jié)果顯示，BHK-21-Cirp△(A)、BHK-21-GFP(B)、BHK-21-ShCirp(C)處于G0-1期的DNA含量比例(即細(xì)胞數(shù)量比)依次為52.4%、55.3%和66.7%，處于S期的DNA含量比例依次為26.1%、24.7%和19.7%(圖6)，說明在其他條件相同的情況下，CIRP能夠促進(jìn)BHK-21細(xì)胞提前進(jìn)入S期，加快了細(xì)胞周期的進(jìn)程，從而促進(jìn)BHK-21細(xì)胞的增殖。

3 討論

本試驗(yàn)經(jīng)過連續(xù)傳代培養(yǎng)CIRP過表達(dá)的BHK-21細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)BHK-21細(xì)胞的形態(tài)變?yōu)閳A形。隨后采用HE染色法觀察了其細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的變化，并用掃描電鏡觀察對比了BHK-21的細(xì)胞形態(tài)。根據(jù)HE染色結(jié)果顯示，變圓的BHK-21細(xì)胞的細(xì)胞核明顯增大，且大小不一，核質(zhì)比顯著高于正常形態(tài)的細(xì)胞，生長速度明顯加快。用掃描電鏡觀察BHK-21的細(xì)胞形態(tài)能夠更加清晰且直觀的看到變圓的BHK-21細(xì)胞具有大量發(fā)達(dá)的偽足。偽足結(jié)構(gòu)是區(qū)別于正常細(xì)胞的明顯特征，并且在腫瘤細(xì)胞中，偽足也是其活躍的運(yùn)動力和侵襲力的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，偽足對腫瘤細(xì)胞黏附、侵襲、運(yùn)動、支撐、營養(yǎng)攝取等過程有關(guān)鍵性的作用[12-14]。因此，推測CIRP過表達(dá)使BHK-21細(xì)胞突變?yōu)槟[瘤細(xì)胞。

圖6 BHK-21細(xì)胞周期的檢測結(jié)果

細(xì)胞周期是指從一次細(xì)胞分裂形成子細(xì)胞開始到下一次細(xì)胞分裂形成子細(xì)胞為止所經(jīng)歷的全部過程。作為細(xì)胞活動最基本的過程，對細(xì)胞增殖的影響至關(guān)重要。在細(xì)胞周期的4個階段都有相應(yīng)的細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞周期依賴激酶(CDK)和細(xì)胞周期依賴激酶抑制劑進(jìn)行協(xié)作控制。研究發(fā)現(xiàn)，CIRP的過表達(dá)可以調(diào)控小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中ERK信號通路，激活細(xì)胞周期蛋白cyclin D1、S4等蛋白的合成，加快細(xì)胞周期的前進(jìn)，最終達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。過表達(dá)的CIRP通過與雙重特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶1B(Dyrk1b)互作，調(diào)節(jié)cyclin D1蛋白和p27蛋白的磷酸化水平以及Dyrk1b與p27的結(jié)合來促進(jìn)未分化的精原細(xì)胞的增殖作用[15]。CIRP能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白來加快細(xì)胞周期的進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖。本試驗(yàn)用BHK-21-Cirp△和BHK-21-ShCirp分別與BHK-21-GFP進(jìn)行比較，通過繪制其增殖曲線，計(jì)算比生長速率，以及采用流式細(xì)胞儀檢測其細(xì)胞周期，證實(shí)了CIRP過表達(dá)能夠促進(jìn)BHK-21細(xì)胞從G0-G1期進(jìn)入S期，加快細(xì)胞周期的進(jìn)程，最終達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。因此，推測CIRP能夠通過與細(xì)胞周期蛋白相互作用或者調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白活性，從而調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程，最后促進(jìn)細(xì)胞增殖。

本試驗(yàn)經(jīng)過連續(xù)傳代發(fā)現(xiàn)BHK-21細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了變化，并對其細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行了觀察和比較，推測CIRP過表達(dá)使其突變?yōu)槟[瘤細(xì)胞。證實(shí)了CIRP過表達(dá)能夠通過加快BHK-21的細(xì)胞周期，從而促進(jìn)BHK-21細(xì)胞的增殖，為深入研究CIRP對細(xì)胞生長發(fā)育的作用提供參考。