李海江，王 琪，李宗帥，董偉韜，張 勇，趙興緒

(甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅蘭州 730070)

雙峰駝(Bactrian camel)屬于駱駝科駱駝屬，既是季節(jié)性發(fā)情又是誘導排卵型動物，本研究用蛋白組學技術(shù)對繁殖季節(jié)和非繁殖季節(jié)雙峰駝血清進行分析，發(fā)現(xiàn)TPM2和TPM3與雙峰駝肌肉生長發(fā)育有關(guān)。原肌球蛋白家族共有4個基因，分別為TPM1(α基因)、TPM2(β基因)、TPM3(γ基因)和TPM4(δ基因)[5]。在肌肉細胞中，TPM主要參與調(diào)節(jié)肌肉收縮過程，通過調(diào)節(jié)ATP酶活性，達到穩(wěn)定肌細胞骨架結(jié)構(gòu)作用。TPM2和TPM3與體內(nèi)許多生命活動直接相關(guān)，如胞質(zhì)分裂、胞膜物質(zhì)轉(zhuǎn)運、細胞運動、誘導細胞凋亡及信號轉(zhuǎn)導等[1]。TPM2與TPM3在動物繁殖育種方面，近年來分別用表達芯片技術(shù)、抑制消減雜交技術(shù)、ITRAQ、RT-qPCR，TPM2是并行存在細肌絲與肌動蛋白之中，TPM3是介導肌球蛋白-肌動蛋白對Ca2+離子的反應(yīng)蛋白，二者共同穩(wěn)定肌細胞骨架微絲，參與骨骼肌、平滑肌、心肌收縮系統(tǒng)的組成[2]。細胞凋亡是哺乳動物細胞生命活動中的關(guān)鍵事件，在機體細胞中，Bax和Bcl-2因子參與細胞的正向和負向調(diào)控，且在凋亡信號轉(zhuǎn)導途徑中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，共同參與細胞凋亡的調(diào)控，故而它們用作檢測細胞凋亡的主要指標[3]。

近年TPM2和TPM3的研究僅在人類疾病及其他物種的研究，在雙峰駝方面的研究甚少?；贕enBank中收錄的雙峰駝TPM2和TPM3基因全序列，本研究用RT-qPCR、Western blot和免疫組織化學技術(shù)檢測TPM2和TPM3在不同肌肉組織中的表達譜，用免疫熒光和siRNA技術(shù)分別檢測TPM2在細胞中的定位以及對雙峰駝肌肉肌纖維細胞凋亡的影響，為進一步揭示其功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及樣品采集 肌肉組織(平滑肌、骨骼肌和心肌)來自雙峰母駝(4歲～6歲)分別于2019年1月(繁殖季節(jié))和2018年6月(非繁殖季節(jié))采集，其中平滑肌取自輸左卵管中部，骨骼肌取自股骨外側(cè)，心肌取自心肌組織。一部分迅速放置液氮中冷凍，然后-80℃保存，另一部分固定于100 mL/L福爾馬林溶液中備用。

1.1.2 主要試劑與儀器 焦碳酸二乙脂(DEPC)、Trans Zol up RNA提取試劑、SYB Premix ExTaqTMⅡ試劑盒、 底物化學發(fā)光液(ECL),均為北京全式金生物公司產(chǎn)品；蛋白裂解液(RIPA)，索萊寶生物公司產(chǎn)品；基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Opti-MEM)、脂質(zhì)體(Lipo-fecmine 2000)、聚偏二氟乙烯膜(PVDF)、十二烷基硫酸鈉、聚丙烯酰胺cDNA synthesis kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Thermo公司產(chǎn)品；GAPDH兔多克隆抗體(10494-1-AP)，TPM2兔多克隆抗體(11038-1-AP)；TPM3兔多克隆抗體(10737-1-AP),武漢三鷹生物公司產(chǎn)品；羊抗兔(Goat Anti-Rabbit IgG/HRP)，羊抗鼠(Goat Anti-Mouse IgG/HRP),北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。 分光光度計，PCR儀，凝膠成像儀，微型離心機，實時熒光定量PCR儀，三氣培養(yǎng)箱，LSM 700型激光共聚焦顯微鏡，HS-100B恒溫搖床等。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成 肌肉組織經(jīng)液氮研磨后，根據(jù)TransZol UP RNA試劑盒操作說明提取雙峰駝各組織總 RNA。每個樣品取5 μL總RNA，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性后，用超微量分光光度計測定濃度。定量之后按cDNA synthesis kit操作說明中的兩步法進行第一鏈cDNA合成，產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR，RT-qPCR) 根據(jù)NCBI公布的雙峰駝原肌球蛋白TPM2(XM-010952840)和原肌球蛋白TPM3(XM-010954014)、Bcl-2(XM-010979993)、Bax(XM-010946937)和內(nèi)參β-actin(XM-010965866.1)基因序列，應(yīng)用Primer premier 5.0在線軟件設(shè)計引物(表1)，通過NCBI的Blast檢測引物特異性，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參基因，通過實時熒光定量PCR檢測各基因的mRNA表達水平。其反應(yīng)體系為20 μL：2×Tran start tip green qPCR superMix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，dd H2O 8μL。擴增程序采用3步法：94℃ 30 s；94℃ 5 s，56℃ 15 s，72℃ 10 s；共45個循環(huán)，每個樣品重復3次，反應(yīng)結(jié)束后觀察擴增曲線和溶解曲線，采集Ct值。采用2-△△ct方法進行數(shù)據(jù)處理。

1.2.3 免疫印跡 用研缽將肌肉組織樣品1.5 g加液氮充分研磨，加入RIPA(1∶300)裂解液和PMSF，置于冰盒裂解30 min，4℃、10 000 r/min離心30 min，提取出的上清液含有組織中的總蛋白，用分光光度儀測定蛋白的濃度，按照標準曲線進行定量。用5×SDS上液緩沖液100℃水浴變性10 min，存于-20℃。應(yīng)用120 g/L SDS-PAGE將蛋白分離，轉(zhuǎn)至PDVF上，50 g/L的脫脂奶粉室溫封閉2 h，以GAPDH為內(nèi)參(1∶5 000)，一抗4℃過夜孵育，PBST洗膜，二抗37℃孵育2 h。PBST洗膜，ECL顯色曝光，記錄結(jié)果，試驗重復3次。

表1 引物序列及參數(shù)

1.2.4 肌肉組織免疫組織化學 石蠟切片，60℃烤片，常規(guī)方法脫蠟，按照免疫組化試劑盒的使用說明書進行處理。滴加DAB顯色劑觀察切片顯色反應(yīng)，入水終止顯色反應(yīng)。按照蘇木精再次染色、分化、脫水、透明、封片的順序進行處理，最后鏡檢照相。

1.2.5 肌纖維細胞免疫熒光染色 將轉(zhuǎn)染24 h細胞接種于玻璃培養(yǎng)皿，40 mL/L多聚甲醛室溫固定30 min，用5 ml/L Triton×-100室溫孵育10 min，30 mL/L H2O2孵育10 min，山羊血清4封閉15 min，加一抗，4℃過夜。PBS洗3次，避光滴加熒光標記的二抗，孵育60 min，PBS 洗3次。避光加(DAPI)染核，室溫靜置3 min～5 min，PBS洗3次，用抗熒光淬滅封片。

1.2.6 細胞轉(zhuǎn)染 根據(jù)TPM2的基因序列，由廣州銳博生物公司合成雙鏈小分子siRNA(表2),(陰性對照siRNA-序列不公開，廣東銳博公司擁有知識產(chǎn)權(quán))。按照siRNA和Lipofectamine2000說明書進行轉(zhuǎn)染。將選擇純化后的F2代細胞傳代培養(yǎng)，待細胞匯合度達到30%～40%時加入2 mL完全培養(yǎng)基，之后，將3 μL siRNA溶與120 μL Opti-MEM中靜置3 min～5 min后加入9 μL Lipofectamine 2 000混勻，室溫靜置30 min后，將混合液加入培養(yǎng)皿，37℃、體積分數(shù)為5%的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.7 圖像采集及數(shù)據(jù)分析 用SPSS 17.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行獨立樣本t檢驗分析對不同肌肉組織的基因表達進行顯著性檢驗，用BON法進行多重比較，熒光定量分析采用 2-ΔΔCt法測定目的基因 mRNA的相對表達水平；以GAPDH基因為內(nèi)參進行標準化，Western blot結(jié)果用Image J軟件進行圖像分析，將掃描出來的目的蛋白TPM2與TPM3分別將內(nèi)參蛋白GAPDH的灰度值作比值；用OlympusDPx71顯微鏡觀免疫組織化學染色結(jié)果，用激光共聚焦系統(tǒng)采集細胞免疫熒光照片。

表2 siRNA序列信息

2 結(jié)果

2.1 TPM2在繁殖季節(jié)雙峰母駝肌肉組織中的表達

RT-qPCR檢測不同組織中TPM2 mRNA表達水平，結(jié)果顯示TPM2 mRNA基因在繁殖季節(jié)雙峰母駝肌肉肌肉組織中的相對表達量均極顯著高于非繁殖季節(jié)的肌肉組織(P<0.01)(圖1A)；不同組織樣品中TPM2和GAPDH蛋白的Western blot分析(圖 1B)和不同組織中檢測到的TPM2蛋白光密度值(圖1C),TPM2蛋白在繁殖季節(jié)雙峰母駝肌肉組織中的相對表達量均極顯著高于非繁殖季節(jié)的肌肉組織(P<0.01)。

2.2 TPM3在繁殖季節(jié)雙峰母駝肌肉組織中的表達

RT-qPCR檢測不同組織中TPM3 mRNA表達水平(圖2A)，TPM3基因在繁殖季節(jié)骨骼肌和心肌組織中的相對表達量極顯著高于非繁殖季節(jié)肌肉組織(P<0.01)，在平滑肌肌肉組織中表達差異不顯著；不同組織樣品中TPM3和GAPDH蛋白的Western blot分析(圖2B)和不同組織中檢測到的TPM3蛋白光密度值(圖2C)，TPM3蛋白在繁殖季節(jié)骨骼肌和心肌組織中的相對表達量均極顯著高于非繁殖季節(jié)的肌肉組織(P<0.01)。

**P<0.01，*P<0.05)

**P<0.01，*P<0.05)

2.3 非繁殖季節(jié)肌肉組織中TPM2與TPM3的表達模式

RT-qPCR檢測非繁殖季節(jié)肌肉組織中TPM2 mRNA表達水平，非繁殖季節(jié)骨骼肌組織中TPM2 mRNA的相對表達量極顯著高于平滑肌和心肌的表達(P<0.01)(圖3A、圖3B)。不同組織中TPM2、TPM3和GAPDH蛋白的Western blot分析(圖3C)和不同組織中檢測到的TPM2蛋白光密度值(圖3D和圖3E),TPM2蛋白在心肌肌肉組織中表達量高于其他組織；骨骼肌組織中TPM3 mRNA的相對表達量極顯著高于平滑肌和心肌的表達(P<0.01)，TPM3蛋白在骨骼肌肌肉組織中表達量高于其他組織。

圖3 非繁殖季節(jié)不同肌肉TPM2/TPM3 mRNA 和蛋白的相對表達(n=3)

2.4 繁殖季節(jié)雙峰母駝肌肉組織中TPM2與TPM3的表達模式

RT-qPCR檢測繁殖季節(jié)肌肉組織中TPM2 mRNA表達水平(圖4A、圖4B)，在繁殖季節(jié)雙峰駝肌肉組織中，骨骼肌組織中TPM2 mRNA 與蛋白相對表達量極顯著高于其他組織(P<0.01)。不同組織中TPM2、TPM3和GAPDH蛋白的Western blot分析(圖4C)，不同組織中檢測到的TPM2和TPM3蛋白光密度值(圖4D和圖4E)，骨骼肌組織中中TPM3 mRNA與蛋白的相對表達量均極顯著高于其他肌肉組織(P<0.01)。

圖4 繁殖季節(jié)不同肌肉TPM2/TPM3 mRNA 和蛋白的相對表達(n=3)

2.5 基因TPM2細胞免疫熒光

通過細胞免疫熒光技術(shù)對TPM2在肌纖維細胞內(nèi)進行定位分析，結(jié)果顯示，TPM2蛋白在肌纖維細胞的細胞核和細胞漿均有表達，但根據(jù)熒光強度判斷，其主要在細胞核內(nèi)表達(圖5)。

圖5 免疫熒光檢測TPM2在細胞分布

2.6 siRNA-TPM2敲低效率的檢測

熒光定量檢測敲低效率，siTPM2-1對駱駝肌纖維細胞的敲低效率最佳，沉默效果為40%(圖6A)。轉(zhuǎn)染siTPM2-1后，24 h、48 h和 72 h均勻不同程度的沉默效果，但24 h 和48 hTPM2的mRNA表達水平極顯著低于對照組(P<0.01)，而72 hTPM2的mRNA表達水平與對照相比差異不顯著(圖6B)。

圖6 siRNA-TPM2敲低效率的檢測

2.7 敲低TPM2對細胞凋亡的影響

為了解沉默TPM2對肌纖維細胞凋亡的影響，通過RT-qPCR檢測促凋亡和抗凋亡因子的mRNA水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染24 h后，沉默組Bax的mRNA相對表達水平顯著上調(diào)(P<0.05)，48 hBax的mRNA表達水平極顯著上調(diào)(P<0.01)與對照組相比轉(zhuǎn)染24 h，沉默組Bcl-2的mRNA表達水平極顯著低顯著下調(diào)，而48 h與對照組無明顯差異(P<0.01)。

3 討論

哺乳動物中原肌球蛋白的20多種異構(gòu)體被確認[4]，其中TPM2和TPM3也成為人類診斷各種癌癥新候選標志物[5]。在家畜遺傳育種研究中發(fā)現(xiàn)豬、兔肌肉生長和肌肉纖維差異組受TPM2和TPM3調(diào)節(jié)[6]。本試驗結(jié)果表明，繁殖季節(jié)雙峰母駝肌肉組織中TPM2與TPM3對應(yīng)的 mRNA和蛋白的表達量顯著高于非繁殖季節(jié)，均屬于上調(diào)蛋白。在繁殖季節(jié)雙峰母駝雌激素分泌增多，參與生理調(diào)控過程，研究發(fā)現(xiàn)，家畜的子宮、輸卵管、陰道、垂體等組織均為雌激素的靶組織，在雌激素影響下，輸卵管、子宮的活動增加，其腺體、基質(zhì)及肌肉部分都增生[7]。而分泌的17β-雌二醇(E2)能與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子雌激素核受體ERα和ERβ通過基因組效應(yīng)結(jié)合雌激素，作用于具體的靶組織[8]，這也解釋本試驗中特定基因TPM2與TPM3在雙峰母駝繁殖季節(jié)通過雌激素調(diào)控靶肌肉組織，使其蛋白表達上調(diào)。至此可知，繁殖季節(jié)母駝分泌的雌激素促進有絲分裂，通過刺激孕激素受體、表皮生長因子及胰島素樣生長因子等促進肌肉生長。

圖7 RT-qPCR檢測凋亡因子的mRNA水平

骨骼肌占是最豐富的組織，在動物整個生長發(fā)育過程中調(diào)控各種蛋白表達積累[9]。本研究發(fā)現(xiàn)無論是繁殖季節(jié)還是非繁殖季節(jié)，骨骼肌組織中TPM2與TPM3的基因和蛋白都明顯高于其他肌肉組織。這與此二者蛋白在鴨子胸肌，黑山羊骨骼肌以及雞胚胎骨骼肌中研究結(jié)果一致[10]；表明TPM2與TPM3共同參與肌肉蛋白質(zhì)的合成和骨質(zhì)生長，在骨骼肌組織中特異性表達，在試驗過程中TPM2在骨骼肌中mRNA表達水平與蛋白表達水平略為不一致的情況,可能是實驗方法的敏感性不同,也可能是TPM2蛋白不穩(wěn)定所致；由此可見，此二者蛋白在骨骼肌的生長發(fā)育調(diào)控過程起重要作用，但具體機理尚不明確，還需進一步研究。

肌纖維即肌細胞，免疫熒光結(jié)果表明TPM2基因在肌纖維細胞中均有表達，說明此蛋白參與橫紋肌、平滑肌、心肌收縮系統(tǒng)的組成。Bcl-2通常發(fā)揮抵抗細胞凋亡的作用，與凋亡Bax蛋白相互作用破壞線粒體膜的完整性，最終導致細胞凋亡[11-12]。在肌纖維細胞的轉(zhuǎn)染敲低序列試驗中發(fā)現(xiàn)TPM2在轉(zhuǎn)染后的各時間點都有沉默效應(yīng)，轉(zhuǎn)染24 h、48 h后Bax mRNA表達顯著上調(diào)，Bcl-2 mRNA表達明顯下調(diào)。在此過程中，轉(zhuǎn)染敲低的原肌球蛋白基因序列，使正常的翻譯和轉(zhuǎn)錄受到影響，蛋白失去了穩(wěn)定肌細胞骨架微絲作用，影響細胞的正常有絲分裂和跨膜等活動；在大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，雌激素可抑制雌性大鼠成纖維細胞的增殖和Ⅰ型Ⅱ型膠原蛋白的基因表達[13]，而雙峰駝同樣可能通過雌激素抑制原肌球蛋白2的基因表達的同時促進了雙峰駝肌纖維細胞的凋亡。