田路路，李會(huì)玲，支飛杰，王小雨，翟云逸，靳亞平，王愛(ài)華*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100；2.陜西省畜牧技術(shù)推廣總站，陜西西安 710016)

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的人畜共患病，導(dǎo)致家畜流產(chǎn)和不孕。布魯氏菌可在脾臟、肝臟、淋巴結(jié)等網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中持續(xù)存在。其宿主多以牛、羊、豬等家畜為主，也可感染海豚等海洋動(dòng)物及野生動(dòng)物[1]。人感染后主要表現(xiàn)反復(fù)發(fā)熱、關(guān)節(jié)疼痛、骨骼肌肉衰弱[2]。為促進(jìn)畜牧業(yè)健康發(fā)展，布魯氏菌病的防控凈化已成為形勢(shì)所需。對(duì)布魯氏菌病的早期準(zhǔn)確診斷在控制和根除布魯氏菌病以改善公共衛(wèi)生方面起著重要作用[3]?；⒓t平板凝集試驗(yàn)是最常見(jiàn)的布魯氏菌病檢測(cè)方法，但該方法靈敏度低、假陽(yáng)性率高。ELISA是一種用于檢測(cè)特異性抗體和可溶性抗原的免疫測(cè)定技術(shù)，該方法敏感度高、操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、適用范圍比較廣泛。該方法對(duì)布魯氏菌病的診斷和血清流行病學(xué)調(diào)查具有重要的作用[4]。布魯氏菌外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)16是一種與肽聚糖相關(guān)的保守性脂蛋白，廣泛存在于布魯氏菌的6個(gè)種屬[5]。本試驗(yàn)表達(dá)、純化出布魯氏菌OMP16，并以純化的布魯氏菌OMP16作為包被抗原，建立檢測(cè)布魯氏菌抗體的間接ELISA法，為布魯氏菌病檢測(cè)及疫苗評(píng)價(jià)等提供一種靈敏度高的技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和血清樣本 豬布魯氏菌S2疫苗株，由陜西省動(dòng)物衛(wèi)生與屠宰站惠贈(zèng)；大腸埃希氏菌DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞由天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)；質(zhì)粒pET-32a由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)室保存；40份布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)的陰性血清，100份血清樣本采自陜西省某未免疫布魯氏菌病疫苗的奶山羊場(chǎng)。

1.1.2 主要試劑 過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG，西安晶彩生物科技有限公司； His-Tag抗體(小鼠單抗)，碧云天生物科技有限公司；ClonExpress?Ⅱ One Step Cloning Kit，南京維諾贊生物科技有限公司；大豆胰蛋白胨瓊脂粉(TSB)，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；質(zhì)粒小提中量試劑盒、DNA純化回收試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；脫脂奶粉，TMB顯色液和NTA樹(shù)脂層析柱，碧云天生物科技有限公司；布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原及其相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性和陰性血清，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.3 主要儀器 移液器，德國(guó)Eppendorf公司；電子天平，美國(guó)D-I-C公司；臺(tái)式高速低溫離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；PCR儀，北京賽百奧科技有限公司；核酸電泳儀，美國(guó)Millipore公司；凝膠成像儀，上海天能科技有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；超聲波細(xì)胞粉碎儀，寧波新藝超聲設(shè)備有限公司；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，北京Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 布魯氏菌S2菌株基因組的提取 用無(wú)菌生理鹽水溶解B.suisS2活疫苗株，采用平板畫線法接種到大豆胰蛋白胨瓊脂(TSA)平板上，倒置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，挑取生長(zhǎng)良好的菌落接種到胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)液體培養(yǎng)基，在37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)48 h，按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說(shuō)明提取布魯氏菌基因組。

1.2.2 PCR擴(kuò)增布魯氏菌Omp16基因片段 根據(jù)GenBank上公布的布魯氏菌Omp16基因序列，應(yīng)用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)上、下游引物，引物的上、下游引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，用 Prime-Blast 檢測(cè)所設(shè)計(jì)引物的特異性。引物由西安擎科澤西生物科技有限公司合成。以B.suisS2菌株基因組為模板，進(jìn)行Omp16基因擴(kuò)增，反應(yīng)體系：0.5 μL Prime Star DNA polymerase，4 μL 5×PS buffer， 2.5 μL dNTP mixture，1 μL模板，上、下游引物各0.5 μL，雙蒸水11 μL。反應(yīng)程序：98℃ 2 min；98℃ 20 s，53℃ 15 s，72℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3 重組原核表達(dá)載體pET32a-Omp16的構(gòu)建 用EcoRⅠ對(duì)原核表達(dá)載體pET-32a進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳。使用DNA純化回收試劑盒進(jìn)行目的片段膠回收。

將膠回收的目的片段與經(jīng)酶切后的質(zhì)粒pET-32a以1∶1的摩爾比在37℃水浴連接30 min，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌DH5α，涂布含有氨芐的LA平板，倒置在37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，挑取生長(zhǎng)良好的單個(gè)菌落接種到含有氨芐的LB培養(yǎng)液，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)12 h，使用質(zhì)粒小提中量試劑盒提取重組載體。將PCR鑒定正確的質(zhì)粒送西安擎科澤西生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.4 重組蛋白OMP16的誘導(dǎo)表達(dá) 取構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET32a-Omp16轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌感受態(tài)BL21(DE3)，在搖床復(fù)蘇1 h后，涂布到含有氨芐的LA平板上，倒置在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，挑取單個(gè)菌落，接種到含有氨芐的LB培養(yǎng)液，在37℃搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(OD600nm≈0.6)時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG(終濃度為1.0 mmol/L)，22℃條件下誘導(dǎo)8 h，5 000 r/min離心收集菌體，冰上超聲裂解，12% SDS-PAGE電泳檢測(cè)重組蛋白OMP16的表達(dá)。

1.2.5 重組蛋白Omp16的純化及鑒定 經(jīng)大量誘導(dǎo)表達(dá)的OMP16分泌表達(dá)菌[大腸埃希氏菌BL21(DE3)]在超聲裂解后離心取上清，按照His蛋白純化試劑盒說(shuō)明書純化重組蛋白OMP16，將純化的OMP16于PBS中透析過(guò)夜，用PEG8000濃縮，120 g/L SDS-PAGE電泳鑒定，并用His-tag單抗作為一抗進(jìn)行Western blot鑒定,同時(shí)使用羊布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清作為一抗，HRP標(biāo)兔抗羊IgG作為二抗進(jìn)行Western blot，鑒定分析重組蛋白OMP16和羊布魯氏菌血清的免疫反應(yīng)性。

1.2.6 iELISA方法建立 采用方陣滴定法篩選OMP16包被濃度和陽(yáng)性血清最佳稀釋倍數(shù)。將重組蛋白OMP16用包被液(pH9.6的碳酸鹽緩沖液)分別稀釋成2、1.5、1、0.5 μg/mL包被ELISA板，每孔加樣100 μL，4℃包被過(guò)夜，PBS′T洗滌5次，每次30 s。每孔加入200 μL 50 g/L的脫脂奶粉，37℃封閉1 h, PBS′T洗滌5次后，陰性血清，陽(yáng)性血清用50 g/L的脫脂奶粉按1∶10、1∶100、1∶200倍比稀釋，分別每孔加100 μL，37℃孵育1 h，PBS′T洗滌5次后，每孔加入100 μL兔抗羊酶標(biāo)二抗，37℃避光孵育1 h，PBS′T洗滌5次，每孔加100 μL TMB顯色液，37℃避光顯色30 min，加入50 μL終止液(2 mol/L濃硫酸)終止反應(yīng)，10 min內(nèi)在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD450 nm值。以陽(yáng)性血清OD450 nm值在1.0左右，且P/N值(P為陽(yáng)性血清孔平均值，N為陰性血清孔平均值)最大時(shí)為最佳的抗原包被濃度和血清稀釋倍數(shù)。

利用相同方法對(duì)封閉時(shí)間(30、60、120 min)，血清與抗原反應(yīng)時(shí)間(30、60、120 min)，酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)(1∶1 000、1∶5 000、1∶100 000、1∶20 000)，血清與酶標(biāo)二抗反應(yīng)時(shí)間(30、60、120 min)，酶標(biāo)二抗與底物TMB反應(yīng)時(shí)間(15、30、45 min)等反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè)優(yōu)化，根據(jù)陽(yáng)性血清OD450nm值在1.0左右，P/N值最大確定最佳反應(yīng)條件。

1.2.8 敏感性試驗(yàn) 將羊布魯氏菌陽(yáng)性血清分別做5、10、20、40、80、160、320、640倍稀釋，依照上述建立的iELISA檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估建立的iELISA檢測(cè)方法的靈敏度。

1.2.9 符合率試驗(yàn) 取從養(yǎng)殖場(chǎng)采集的100份血清樣本，分別使用虎紅平板凝集試驗(yàn)和所建立的iELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)兩種檢測(cè)方法的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果

2.1 布魯氏菌Omp16基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以B.suisS2菌株基因組為模板，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，在507 bp處出現(xiàn)了一條與預(yù)期大小相符的特異性條帶(圖1)。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示得到了一條與預(yù)期大小相符的507 bp的目的片段(圖2)。陽(yáng)性克隆質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與GenBank上已公布的布魯氏菌Omp16基因序列一致，且開(kāi)放閱讀框連接正確，表明重組原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000; 1.Omp16基因PCR產(chǎn)物M.DNA Maker DL 1 000; 1.PCR products of Omp16 gene

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000; 1.pET32a-Omp16質(zhì)粒PCR產(chǎn)物

2.2 重組蛋白OMP16的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及反應(yīng)原性測(cè)定

將OMP16表達(dá)菌[大腸埃希氏菌BL21(DE3)]誘導(dǎo)后的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)120 g/L的SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3，顯示在約34 ku處出現(xiàn)了一條與預(yù)期大小相符的蛋白條帶，表明重組蛋白OMP16成功表達(dá)。

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的菌液經(jīng)超聲裂解后，離心收集上清和沉淀，為保持重組蛋白的免疫活性，對(duì)上清中的可溶性蛋白進(jìn)行純化，12%的SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示獲得了純度較高的重組蛋白(圖4)。Western blot鑒定分析純化后的重組蛋白，分別用鼠抗6×His-tag(1∶3000)(圖5)和羊布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清(1∶100)(圖6)為一抗的結(jié)果顯示，大約在34 ku處出現(xiàn)了一條特異性的免疫印跡條帶，與預(yù)測(cè)的重組蛋白大小相符，而陰性對(duì)照沒(méi)有出現(xiàn)特異性的免疫印跡條帶，說(shuō)明純化后的蛋白即為帶有6×His的Omp16融合蛋白，且純化的融合蛋白能與羊布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)，可用作ELISA的包被抗原。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET-32a未誘導(dǎo)；2.pET-32a誘導(dǎo)產(chǎn)物；3.pET32a-Omp16 未誘導(dǎo)；4.pET32a-Omp16 誘導(dǎo)產(chǎn)物

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET32a-Omp16純化產(chǎn)物

2.3 iELISA反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)方陣滴定法篩選iELISA最佳反應(yīng)條件試驗(yàn)結(jié)果顯示(表1)，當(dāng)重組蛋白包被濃度為1 μg/mL，血清稀釋10倍時(shí)，檢測(cè)陽(yáng)性血清的OD450nm值接近1.0，且此時(shí)P/N值最大。因此確定OMP16的最佳包被濃度為1 μg/mL，血清稀釋10倍為最佳的血清稀釋倍數(shù)。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，確定最終的iELISA反應(yīng)條件，即1 μg/mL的重組蛋白OMP16用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液在4℃溫度條件下包被過(guò)夜，用50 g/L的脫脂奶粉37℃封閉1 h，加入10倍稀釋的血清樣本，在37℃條件下孵育1 h；酶標(biāo)二抗做1 000倍稀釋，在37℃條件下孵育1 h，TMB顯示液避光顯色30 min，最后用2 mol/L濃硫酸終止顯色反應(yīng)。

a.pET32a-Omp16未誘導(dǎo)；b.純化的Omp16蛋白a.Not induced pET32a-Omp16；b.Purified protein of Omp16

a.pET32a-Omp16未誘導(dǎo)；b.純化的Omp16蛋白a.Not induced pET32a-Omp16；b.Purified protein of Omp16

表1 最佳抗原包被濃度和血清最佳稀釋倍數(shù)確定

2.4 臨界值的確定

圖7 陰性樣品檢測(cè)結(jié)果正態(tài)分布圖

表2 iELISA敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

用上述優(yōu)化的iELISA方法檢測(cè)不同倍比稀釋的羊布魯氏菌陽(yáng)性血清(表2)，當(dāng)羊布魯氏菌陽(yáng)性血清稀釋80倍時(shí)，陽(yáng)性血清的OD450nm低于臨界值，說(shuō)明其敏感性較好。

2.6 臨床應(yīng)用與符合率試驗(yàn)結(jié)果

分別使用虎紅平板凝集試驗(yàn)和建立的iELISA方法對(duì)100份羊血清樣本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，虎紅平板凝集試驗(yàn)檢出8份陽(yáng)性和92份陰性，建立的iELISA方法檢出11份陽(yáng)性和89份陰性,顯示建立的iELISA敏感性高于虎紅平板凝集試驗(yàn)。iELISA與虎紅平板凝集試驗(yàn)的陽(yáng)性符合率為75.0%(6/8)，陰性符合率為94.6%(87/92)，總體符合率達(dá)到93%(93/100)，說(shuō)明建立的iELISA方法與虎紅平板凝集試驗(yàn)具有良好的一致性。

3 討論

目前最常用的異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)是原核表達(dá)系統(tǒng)，因其原核表達(dá)載體帶有篩選和純化標(biāo)簽，方便了蛋白的純化。但原核表達(dá)載體系統(tǒng)也存在不足之處，會(huì)出現(xiàn)異源表達(dá)的蛋白與大腸埃希氏菌系統(tǒng)不相容，蛋白無(wú)法表達(dá)，以及表達(dá)的重組蛋白不可溶的現(xiàn)象[7]。本研究先后嘗試了多種不同的載體，如pGEX-4T-1載體，pET-28a(+)載體，但均出現(xiàn)了重組蛋白未表達(dá)的現(xiàn)象。最終選用pET-32a載體，pET系統(tǒng)是目前E.coli表達(dá)重組蛋白最強(qiáng)大的系統(tǒng)。同時(shí)選用E.coliBL21(DE3)表達(dá)系統(tǒng)，因其遺傳背景清楚，能高效表達(dá)具有生物學(xué)活性的蛋白分子[8]。同時(shí)，外源基因的高效表達(dá)也會(huì)受到誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度等多方面因素的影響。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在37℃誘導(dǎo)條件下，重組蛋白OMP16可溶性表達(dá)量較低，主要以包涵體的形式存在。經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)驗(yàn)證，將誘導(dǎo)溫度降低到22℃，誘導(dǎo)時(shí)間設(shè)定為8 h，重組蛋白可溶性的表達(dá)量顯著增加。最終得到了大量純度較高的可溶性重組蛋白OMP16, 經(jīng)SDS-PAGE和 Western blot鑒定分析，該重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性，可用作iELISA的標(biāo)記抗原。

布魯氏菌病檢測(cè)與診斷技術(shù)的研究和開(kāi)發(fā)對(duì)于控制布魯氏菌病的感染至關(guān)重要[9]。傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)技術(shù)是診斷布魯氏菌病的金標(biāo)準(zhǔn)，但細(xì)菌培養(yǎng)具有技術(shù)挑戰(zhàn)性和危險(xiǎn)性，需要熟練的技術(shù)人員來(lái)操作。因此在臨床和獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室中，需要使用靈敏、可靠和快速的診斷技術(shù)。目前國(guó)內(nèi)普遍使用虎紅平板凝集試驗(yàn)結(jié)合試管凝集試驗(yàn)進(jìn)行布魯氏菌病的檢測(cè)和診斷，由于耶爾森氏菌等的抗原與布魯氏菌存在交叉性，因此會(huì)造成假陽(yáng)性結(jié)果。ELISA檢測(cè)方法因結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確率高、可批量檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)在生產(chǎn)實(shí)踐中被廣泛使用[10]。目前診斷布魯氏菌病的ELISA技術(shù)主要以滅活菌體的LPS作為包被抗原，但革蘭陰性菌的LPS具有較為明顯的交叉反應(yīng)，在臨床應(yīng)用中極易出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性的現(xiàn)象[11]。外膜蛋白是大部分革蘭氏陰性菌重要的免疫原[12]。布魯氏菌OMP16是布魯氏菌第1組外膜蛋白，是布魯氏菌外膜結(jié)構(gòu)中必不可少的成分[13]。有研究表明，在敲除布魯氏菌Omp16后，影響了外膜肽聚糖的連接，從而導(dǎo)致布魯氏菌外膜結(jié)構(gòu)受到破環(huán)，最終使得細(xì)胞因外膜通透性增加而溶解死亡[14]。同時(shí)，布魯氏菌OMP16具有良好的免疫原性和保護(hù)性，它是一個(gè)不需要添加佐劑就能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生與活疫苗S19相似保護(hù)水平的布魯氏菌蛋白，能引起機(jī)體Th1特異性的免疫應(yīng)答，同時(shí)還能夠激活單核細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子[15-16]。布魯氏菌OMP16是一種免疫原性蛋白，可刺激機(jī)體產(chǎn)出相應(yīng)的抗體，因此，可以將該蛋白作為布魯氏菌血清學(xué)檢查的標(biāo)記抗原。由于OMP16在免疫方面的顯著優(yōu)勢(shì)，缺失Omp16基因的突變株作為一種疫苗成為了研究熱點(diǎn)，建立基于布魯氏菌OMP16的iELISA方法即可區(qū)分免疫和野毒株感染，從而可準(zhǔn)確的淘汰野毒感染的家畜[17]。因此，布魯氏菌OMP16作為抗原在臨床診斷上具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

ELISA方法受多種因素的影響，首先是抗原抗體的反應(yīng)條件。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)具有特異性、比例性、可逆性、階段性等特點(diǎn)，采用方陣滴定法篩選抗原抗體最佳的反應(yīng)條件。在驗(yàn)證本試驗(yàn)建立的iELISA檢測(cè)方法與虎紅平板凝集試驗(yàn)的符合率時(shí)，采集了100份未免疫羊場(chǎng)的羊血清，分別用建立的iELISA和虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，iELISA的陽(yáng)性檢出率略高于虎紅平板凝集試驗(yàn)(11 vs. 8)，同時(shí)，血清稀釋40倍仍能檢出，提示iELISA具有較高的敏感性。進(jìn)一步比較兩者的符合率，顯示兩種檢測(cè)方法的總體符合率達(dá)到93%，陽(yáng)性符合率75.0%，陰性符合率為94.6%。出現(xiàn)陰性符合率高而陽(yáng)性符合率低，可能是由于iELISA針對(duì)的是OMP16，特異性高，而虎紅平板凝集試驗(yàn)特異性相對(duì)較低，同時(shí)，兩者的敏感性也有差異所造成。另外，本試驗(yàn)所檢測(cè)的樣本數(shù)量較少，也是造成陽(yáng)性符合率低的因素，需要進(jìn)一步進(jìn)行大量臨床樣本檢測(cè)數(shù)據(jù)的比對(duì)和驗(yàn)證?？傊?，本試驗(yàn)建立的iELISA檢測(cè)方法具有良好的靈敏度和符合度，具有應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中布魯氏菌病的檢測(cè)的潛力，可為Omp16敲除疫苗的應(yīng)用提供鑒別診斷方法。