李 笨，嚴(yán)蘇杭，孫文超，肖朋朋，李 楠，李 昌，魯會(huì)軍，金寧一，王茂鵬*

(1.溫州大學(xué)病毒學(xué)研究所，浙江溫州 325035；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所，吉林長春 130122)

近年來，腦卒中在我國的發(fā)病率越來越多[1]。情緒障礙是卒中患者常見的并發(fā)癥，其中卒中后抑郁發(fā)病率較高，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后治療,降低患者的生活質(zhì)量[2-3]。卒中后抑郁發(fā)病的機(jī)制尚不完全明確，臨床治療效果欠佳，因此，良好模擬臨床上卒中后抑郁患者的動(dòng)物模型開發(fā)與應(yīng)用工作迫在眉睫。

研究發(fā)現(xiàn)，大腦前額葉皮層、基底核、中縫核等組織結(jié)構(gòu)的病變可使卒中后抑郁的幾率更高[4-5]。近年來有研究者嘗試用不同方法對(duì)核團(tuán)進(jìn)行定點(diǎn)卒中造模，以獲得高質(zhì)量的卒中后抑郁動(dòng)物模型。內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)是由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的活性肽，具有強(qiáng)效的血管收縮功能，最早被廣泛用于腦內(nèi)核團(tuán)卒中造模研究[6-7]，由21個(gè)氨基酸組成，7個(gè)疏水性氨基酸分布在表面，在-20℃下，經(jīng)無菌水溶解的ET-1保存時(shí)間較短且易降低生物活性[8-9]。在C57/BL6小鼠的左內(nèi)側(cè)前額葉皮層多點(diǎn)注射ET-1，于術(shù)后第6周發(fā)現(xiàn)小鼠產(chǎn)生抑郁樣行為，建立了一種全新的卒中后抑郁模型，但該方法多點(diǎn)注射易造成機(jī)械性損傷，基于磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)方法的檢測成本和人工成本高。為了解決上述問題，本研究通過改良左內(nèi)側(cè)前額葉皮層卒中后抑郁造模試驗(yàn)方法，并在術(shù)中使用無輻射的激光散斑血流成像系統(tǒng)對(duì)卒中造模結(jié)果輔助性判斷，降低手術(shù)誤差，提高成功率，為更好的建立卒中后抑郁Balb/c小鼠模型、探究卒中后抑郁的發(fā)病機(jī)制、評(píng)估治療性藥物等研究儲(chǔ)備關(guān)鍵技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Balb/c小鼠，雄性，8周齡～10周齡，平均體重25 g，SPF飼養(yǎng)條件下，光照與黑暗交替12 h。除行為學(xué)試驗(yàn)期間外，其他時(shí)間均給予小鼠充足的飲水和飼料。將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組。

1.1.2 試劑和儀器 ET-1、蔗糖為Sigma公司產(chǎn)品；水合氯醛為國藥試劑產(chǎn)品；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)、磷酸緩沖鹽溶液為索萊寶公司產(chǎn)品；激光散斑血流成像系統(tǒng)為Moor公司產(chǎn)品；小鼠立體定位儀，瑞沃德公司產(chǎn)品；微量注射器，Hamilton公司產(chǎn)品；動(dòng)物行為學(xué)儀器及分析軟件，吉量公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 左內(nèi)側(cè)前額葉皮層卒中造模及激光散斑血流成像系統(tǒng)輔助造模 根據(jù)文獻(xiàn)[6]，將ET-1用滅菌水完全溶解(800 pmol/μL)，為測試ET-1對(duì)小鼠左內(nèi)側(cè)前額葉皮層卒中的有效劑量，分別以400 pmol、1 200 pmol的注射劑量對(duì)小鼠進(jìn)行試驗(yàn)。小鼠術(shù)前稱重，并使用30 mL/L水合氯醛腹腔注射麻醉(0.25 mL/20 g)，待小鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)后，固定至立體定位儀并切開頭部皮膚，然后將調(diào)整好聚焦的激光散斑血流成像系統(tǒng)移至小鼠頭部上方，記錄手術(shù)前血流情況。

手術(shù)期間，小鼠體溫保持在37℃±1℃，用微量注射器將ET-1以0.20 μL/min速度注射至左內(nèi)側(cè)前額葉皮層(AP：+2.0 mm；ML：+0.5 mm；DV：-2.4 mm)，在右內(nèi)側(cè)前額葉皮層(AP：+2.0 mm；ML：-0.5 mm；DV：-2.4 mm)也進(jìn)行同樣的手術(shù)，ET-1換成同體積無菌水，作為假刺激對(duì)照，注射完畢后，針管留置10 min。取出針管后，立即將激光散斑血流成像系統(tǒng)移至小鼠頭部上方，通過手術(shù)前后注射位點(diǎn)的血流變化幅度，判斷ET-1對(duì)左內(nèi)側(cè)前額葉皮層是否發(fā)生了明顯阻斷作用，再進(jìn)行外科縫合閉合切口。手術(shù)之后小鼠放置在37℃恒溫箱中保持體溫直至活動(dòng)正常，放回原飼養(yǎng)環(huán)境。對(duì)照組進(jìn)行同樣的手術(shù)，ET-1換成同體積滅菌水。

1.2.2 TTC染色 在文獻(xiàn)[10]基礎(chǔ)上略加修改，ET-1注射后48 h，對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉、處死并取出腦組織置于-20℃冷凍10 min。將腦組織，從前往后作冠狀位連續(xù)切片并浸泡于20 g/L TTC溶液中孵育，待切片變紅后，取出切片、拍照，判斷卒中區(qū)域。

1.2.3 動(dòng)物行為學(xué)測試 行為學(xué)測試開始前，將小鼠從動(dòng)物房移至行為學(xué)測試房間2 h以適應(yīng)環(huán)境，其中除懸尾試驗(yàn)需在較強(qiáng)光下進(jìn)行外，其余試驗(yàn)均在正常光照下進(jìn)行。

1.2.3.1 蔗糖偏好試驗(yàn) 在文獻(xiàn)[11]基礎(chǔ)上略加修改，將小鼠單籠飼養(yǎng)，試驗(yàn)前剝奪小鼠飲水24 h，正常采食，每個(gè)籠子上裝有兩個(gè)相同規(guī)格、瓶塞帶有滾珠的水壺。一個(gè)壺中裝飲用水，另一個(gè)壺中裝蔗糖溶液。試驗(yàn)從暗周期開始，下一個(gè)暗周期前結(jié)束。

1.2.3.2 懸尾試驗(yàn) 在文獻(xiàn)[12]基礎(chǔ)上略加修改，單獨(dú)將小鼠尾端固定，懸掛于30 cm×30 cm×30 cm敞箱中，距地面15 cm。每只小鼠在測試前務(wù)必清除敞箱中糞便及尿液，以免殘留氣味造成影響。試驗(yàn)全程5 min，用視頻記錄儀拍攝并儲(chǔ)存，用動(dòng)物行為學(xué)視頻分析軟件截取并分析試驗(yàn)最后4 min內(nèi)小鼠掙扎時(shí)間和不動(dòng)時(shí)間。

1.2.3.3 開場試驗(yàn) 在文獻(xiàn)[13]開場試驗(yàn)基礎(chǔ)上略加修改，將小鼠單獨(dú)放置在高50 cm，底部40 cm×40 cm的正方開場中。每只小鼠在測試前務(wù)必清除開場中的糞便及尿液，以免殘留氣味造成影響。將小鼠輕輕地從邊緣區(qū)域放入開場，試驗(yàn)全程6 min，用視頻記錄儀拍攝并儲(chǔ)存，用動(dòng)物行為學(xué)視頻分析軟件截取并分析試驗(yàn)最后5 min內(nèi)小鼠活動(dòng)軌跡、在中心區(qū)域內(nèi)活動(dòng)時(shí)間和活動(dòng)總路程。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 各組數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism軟件分析，兩組間均數(shù)用t檢驗(yàn)。nsP>0.05即兩組無顯著差異，*P<0.05即兩組差異顯著，**P<0.01即兩組差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 左內(nèi)側(cè)前額葉皮層卒中造模術(shù)式

手術(shù)時(shí)，適當(dāng)?shù)渭恿姿峋彌_鹽溶液至顱骨，保持其表面濕潤，更利于激光散斑血流成像系統(tǒng)記錄血流狀態(tài)，其手術(shù)過程及激光散斑血流成像系統(tǒng)輔助造模見圖1A，由左至右分別是小鼠頭部固定、立體定位注射、激光散斑血流成像系統(tǒng)記錄不同時(shí)刻的血流狀態(tài)。對(duì)注射劑量為1 200 pmol的小鼠術(shù)后48 h進(jìn)行TTC染色(圖1B)，左側(cè)ET-1注射可導(dǎo)致左內(nèi)側(cè)前額葉皮層注射位置附近肉眼可見的白色的卒中梗死灶，與右側(cè)無菌水注射點(diǎn)形成鮮明對(duì)比。與中央前回TTC染色結(jié)果比較，證明其未擴(kuò)散至其他未注射核團(tuán)。

A.顱內(nèi)立體定向微量注射手術(shù)及激光散斑血流成像系統(tǒng)血流監(jiān)測；B.ET-1注射48h后TTC染色圖

2.2 激光散斑血流成像系統(tǒng)輔助造模

通過激光散斑血流成像系統(tǒng)，可利用血流散斑流速指數(shù)(speckle flow index,SFI)進(jìn)行非侵入性監(jiān)測實(shí)現(xiàn)對(duì)同一小鼠的左右腦手術(shù)前后血流變化的觀察。左側(cè)為ET-1注射位點(diǎn)，右側(cè)為無菌水注射位點(diǎn)(圖2B和圖2D)，結(jié)合圖2A和圖2C可發(fā)現(xiàn)，在400 pmol注射劑量下，其左側(cè)注射ET-1前后的SFI差值(120)與右側(cè)注射無菌水前后的SFI差值(115)無明顯差異，而在1200 pmol注射劑量下，其左側(cè)注射ET-1前后的SFI差值(85)遠(yuǎn)高于右側(cè)注射無菌水前后的SFI差值(40)。證明當(dāng)ET-1的注射劑量為1 200 pmol時(shí)，可快速、有效地造成左內(nèi)側(cè)前額葉皮層卒中。在隨后試驗(yàn)中，使用該劑量對(duì)小鼠進(jìn)行手術(shù)，且每只小鼠注射前后，同樣使用激光散斑血流成像系統(tǒng)初步判斷卒中過程。

2.3 小鼠行為學(xué)變化

為了判斷該劑量是否足以引起抑郁樣行為，在術(shù)后第4周用多種方法來比較對(duì)照組和模型組小鼠的行為學(xué)差異(圖3)。

2.3.1 蔗糖偏好試驗(yàn)結(jié)果 通過小鼠對(duì)蔗糖溶液和純凈水?dāng)z入的比例來衡量小鼠的行為，如果模型小鼠對(duì)蔗糖溶液攝入比例小于對(duì)照組，則證明模型組小鼠發(fā)生了抑郁樣行為。本次研究中，模型組小鼠對(duì)蔗糖的偏好百分比略低于對(duì)照組小鼠，證明模型組小鼠對(duì)蔗糖刺激的快感正在慢慢消失(圖3A)，具有抑郁樣行為傾向。

2.3.2 懸尾試驗(yàn)結(jié)果 由于環(huán)境壓力突發(fā)巨變，小鼠往往表現(xiàn)出拼命掙扎試圖逃跑的行為以及因無法逃脫而陷入絕望不動(dòng)的行為，更快放棄掙扎和更早進(jìn)入絕望不動(dòng)，則視為小鼠發(fā)生了抑郁樣行為。本次試驗(yàn)中，模型組小鼠無論在代表試圖逃跑的掙扎時(shí)間，還是代表絕望無助的不動(dòng)時(shí)間這兩個(gè)水平上，與對(duì)照組小鼠之間均形成了顯著差異，證明模型組小鼠比對(duì)照組小鼠更易出現(xiàn)絕望狀態(tài)的抑郁樣行為(圖3B、3C)。

2.3.3 開場試驗(yàn)結(jié)果 因小鼠進(jìn)入陌生環(huán)境有趨利避害的天性，而有抑郁樣行為的小鼠在進(jìn)入陌生的開場環(huán)境可表現(xiàn)為對(duì)較明亮的中央?yún)^(qū)域探索能力下降，以及更喜歡在較陰暗的四周活動(dòng)。結(jié)合本次開場試驗(yàn)的小鼠在中心區(qū)域內(nèi)活動(dòng)時(shí)間的統(tǒng)計(jì)結(jié)果、小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡圖(圖3D、3F)可知，模型組小鼠在中央?yún)^(qū)域的活動(dòng)時(shí)間略有下降，并且偏好在四周及角落活動(dòng)，證明模型組小鼠具有抑郁樣行為的傾向。通過對(duì)兩組小鼠活動(dòng)總路程進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組小鼠在開場環(huán)境中的總路程顯著高于對(duì)照組(圖3E)，證明模型組小鼠在陌生環(huán)境中有焦慮、恐懼的行為是小鼠抑郁樣行為的表現(xiàn)之一。

A.400 pmol ET-1注射前后血流變化曲線；B.血流圖像；C.1200 pmol ET-1注射前后血流變化曲線；D.血流圖像

3 討論

大腦中動(dòng)脈缺血再灌注、雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久閉塞法等現(xiàn)有動(dòng)物模型，由于試驗(yàn)操作復(fù)雜、卒中面積大、致殘/致死率高等不利因素的存在，無法建立穩(wěn)定的卒中后抑郁模型[14]。通過定點(diǎn)人工誘導(dǎo)腦部功能核團(tuán)的卒中，可引起抑郁表型，其分子機(jī)制可成為發(fā)現(xiàn)潛在藥物類型及作用靶點(diǎn)的新通路。人工誘導(dǎo)腦部功能核團(tuán)的卒中造模方法主要有自體血栓卒中法，局部皮質(zhì)光卒中法和ET-1定點(diǎn)注射卒中法，自體血栓卒中法的卒中部位隨機(jī)，局部皮質(zhì)光卒中法的作用部位具有局限性[15]，因此ET-1定點(diǎn)注射卒中法以其強(qiáng)大的ET-1血管收縮能力和準(zhǔn)確定點(diǎn)卒中等特點(diǎn)，被更多的研究者用來模擬腦部功能核團(tuán)的卒中，將ET-1經(jīng)多點(diǎn)注射至左內(nèi)側(cè)前額葉皮層建立新的卒中后抑郁動(dòng)物模型，表明該方法用于卒中后抑郁造模的可行性[16-18]，但在實(shí)際操作過程中其重復(fù)性、穩(wěn)定性無法滿足當(dāng)前研究的要求。

A.模型組小鼠的蔗糖消耗百分比略低于對(duì)照組(P>0.05)；B～C.模型組掙扎時(shí)間非常顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，且不動(dòng)時(shí)間非常顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；D～F.模型組在中央?yún)^(qū)域的時(shí)間略低于對(duì)照組(P>0.05)，模型組總路程非常顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，模型組比較對(duì)照組更偏好在角落活動(dòng)

MRI配合TTC染色可對(duì)卒中造模結(jié)果進(jìn)行判斷[19-20]，但MRI儀器設(shè)備昂貴，而且儀器輻射易增加試驗(yàn)者的暴露風(fēng)險(xiǎn)，并不適合在一般實(shí)驗(yàn)室開展相關(guān)工作。TTC染色只能將小鼠處死后進(jìn)行染色，無法確定測試小鼠是否確實(shí)發(fā)生卒中，影響了該模型的廣泛應(yīng)用。

激光散斑血流成像系統(tǒng)通過高分辨率的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)血流監(jiān)測，直觀得出所檢測區(qū)域的微血管血流分布狀態(tài)和血流變化情況，其優(yōu)勢在于試驗(yàn)動(dòng)物無需額外服用造影劑、檢測速度較快、對(duì)試驗(yàn)人員無輻射暴露風(fēng)險(xiǎn)、減少試驗(yàn)成本且符合動(dòng)物倫理等，逐漸受到國內(nèi)外比較多實(shí)驗(yàn)室的青睞[21-23]。而且作為一種非侵入性血流檢測方法，能夠有效檢測小鼠腦部卒中，適合用于腦卒中模型評(píng)估。因此，本研究改良前人的手術(shù)方案，通過減少注射位點(diǎn)，增大單一注射位點(diǎn)ET-1注射劑量就可完成左內(nèi)側(cè)前額葉皮層卒中后抑郁造模。使用激光散斑血流成像系統(tǒng)輔助左內(nèi)側(cè)前額葉皮層顱內(nèi)立體定向微量注射手術(shù)，觀察卒中過程中血流情況變化，成功地造出一批低死亡率、高成功率的卒中后抑郁Balb/c小鼠模型，大大提高了該模型的穩(wěn)定性，為基于腦部功能核團(tuán)卒中導(dǎo)致抑郁的發(fā)病及神經(jīng)病理機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。