吳志勇，范倩倩，包佳鑫，李 睿，Muhammad Ishfaq，李繼昌,2*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.中國疾病預(yù)防控制和藥物開發(fā)黑龍江省重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030)

呼吸系統(tǒng)疾病嚴(yán)重影響世界各地的家禽生產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[1]。當(dāng)家禽出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)疾病時，多是發(fā)生混合感染，常見的病原有雞毒支原體(Mycoplasmagallisepticum，MG)、大腸埃希氏菌(E.coli)、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)等。家禽發(fā)生多種病原感染時，病因越復(fù)雜，被感染家禽的死亡率就越高[2-3]。近年來，隨著集約化養(yǎng)殖的擴大，混合感染的威脅越來越大，然而用于混合感染治療的藥物研究的報道卻很少。用前期實驗室篩選的6味中藥模型研究結(jié)果[4]，通過均勻試驗的方法來優(yōu)化這幾味中藥的最佳配比。均勻試驗的步驟包括基于因素和水平的數(shù)量選擇合適的均勻試驗表，選擇恰當(dāng)?shù)脑u分標(biāo)準(zhǔn)，建立回歸分析[5]。用4個被廣泛用于評估感染的指標(biāo)，氣囊和氣管病變評分，MG和E.coli的最小抑菌濃度(MIC)[6-7]，將這4個指標(biāo)經(jīng)過歸一化處理后匯總為總得分，作為中藥復(fù)方有效性的最終指標(biāo)。依據(jù)均勻分散在域上的試驗設(shè)計點，利用DPS數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)進行了多元非線性回歸分析以求得最佳組合配比。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及菌株 1日齡未接種疫苗的商業(yè)來航雞120只，購自哈爾濱光大養(yǎng)雞場。MGR菌株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈，E.coliO78從本實驗室大腸埃希氏菌病雞中分離保存。整個試驗過程嚴(yán)格消毒，確保動物無感染，飼喂的飼料為無抗雛雞飼料。試驗雞適應(yīng)性飼養(yǎng)至7日齡，試驗前剔除過大、過小、體弱的雛雞。

1.1.2 藥品、試劑及耗材 6種中草藥(包括板藍(lán)根、連翹、桑白皮、銀杏葉、甘草和丹參)購自哈爾濱市安國百草藥材行；MH肉湯培養(yǎng)基，北京奧博生物科技有限公司產(chǎn)品；支原體無血清培養(yǎng)基，上海源培生物科技股份有限公司產(chǎn)品；胎牛血清，美國Gibco公司產(chǎn)品；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，瑞士Roche公司產(chǎn)品；青霉素溶液，哈藥集團制藥總廠產(chǎn)品；0.22 μm濾器，德國MilliPore公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備 將MGR株用支原體完全培養(yǎng)基在37℃恒溫培養(yǎng)箱下培養(yǎng)至1×109CCU/mL，將大腸埃希氏菌在MH肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)至109CCU/mL。MG完全培養(yǎng)基：量取支原體無血清培養(yǎng)基40 mL，無菌胎牛血清10 mL，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸50 μL，青霉素溶液50 μL，混合均勻。放4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 藥液制備 將板藍(lán)根、連翹、桑白皮、銀杏葉、甘草和丹參加水煎煮2次，每次加15倍重量水煎煮1 h，合并2次煎煮液后濃縮至終濃度為1 280 mg/mL，高速離心(8 000 r/min，15 min)取上清后，置于 4℃冰箱冷藏備用。進行MIC測定試驗前用0.22 μm濾器對中藥提取物進行過濾除雜。

1.2.3 動物分組及處理 用稀釋好的支原體菌液，以0.2 mL/只的劑量注射7日齡雞左胸腔氣囊中。10日齡時，給雞腹腔注射大腸埃希氏菌液0.1 mL/只。從第13天起，將120只雞隨機分為10組，用不同配比的中藥復(fù)方治療(A～J組)(表1)。通過灌胃給藥的方式連續(xù)1周給予治療組雞450 mg/kg的劑量[8]。

表1 均勻試驗設(shè)計表

1.2.4 MIC測定 MIC使用96孔板稀釋技術(shù)測定，MG滴度為106CCU/mL。將0.1 mL的培養(yǎng)基添加到96孔板中，再將0.1 mL中藥復(fù)方(1 280 μg/mL)添加到第1孔中。通過2倍稀釋中藥復(fù)方濃度(640 μg/mL～1.25 μg/mL)，并丟棄最后的0.1 mL。向每個孔中再補充0.1 mL制備好的MG等分試樣，最終滴度為5×105CCU/mL。以上方法與大腸埃希氏菌的檢測方法相同，每個濃度進行3次平行試驗。

1.2.5.1 評價指標(biāo)歸一化處理與綜合指標(biāo)計算 采用最小-最大歸一化方法來消除不同維度的影響。使用4個指標(biāo)計算總分，包括MG和大腸埃希氏菌的MIC，氣囊和氣管病變得分，并使用公式(1)歸一化處理這4個指標(biāo)。根據(jù)公式(2)計算綜合得分。

(1)

i代表樣品序號；Ri是通過最小-最大歸一化方法轉(zhuǎn)換后的無量綱值；xi是第i個測量值，xmax是所有測量值的最大值，xmin是所有測量值的最小值。

D=∑0.25Ri

(2)

D代表綜合評價指標(biāo)；Ri是通過最小-最大歸一化方法轉(zhuǎn)換后的無量綱值。

1.2.5.2 呼吸系統(tǒng)疾病的評估規(guī)則 剖檢樣本時，為避免左側(cè)氣囊接種帶來的影響，選擇觀察右側(cè)胸部氣囊，根據(jù)氣囊損傷程度以5個等級對其進行評分[9]：0級：氣囊正常，干凈透明且薄，計0分；1級：氣囊些許增厚和輕度渾濁，局部可見少數(shù)灰或黃色滲出物斑點，計1分；2級：部分氣囊區(qū)域有可見的灰色和黃色滲出物，同時伴有中度增厚，計2分；3級：大片氣囊布滿黃色干酪樣滲出物，計3分；4級：整個氣囊布滿黃色干酪樣滲出物，氣囊完全失去彈性，計4分。格羅斯氣囊病變計分=所有雞氣囊損傷度總和/被檢雞數(shù)。氣管病變評分由氣管的相同3個橫截斷點確定。氣管感染評分也是基于0到3評分系統(tǒng)計算[10]。 MG和大腸埃希氏菌的MIC分為10個倍比濃度的稀釋液，范圍從640 μg/mL～1.25 μg/mL。我們根據(jù)檢測MIC的孔數(shù)定義結(jié)果，并根據(jù)公式(1)歸一化處理。

2 結(jié)果

2.1 評估指標(biāo)的實測數(shù)據(jù)

由于4個指標(biāo)的維度不同且各指標(biāo)代表不同意義，在進行多指標(biāo)評估時很難進行全面的分析[12]。因此，每個評估指標(biāo)的數(shù)據(jù)必須經(jīng)過無量綱化處理(表2)。

2.2 均勻試驗回歸分析的最佳組合

用均勻設(shè)計來調(diào)節(jié)中藥配比，進一步將感染雞的治療效果與多指標(biāo)分析相結(jié)合。6因素分別為板藍(lán)根(x1)、連翹(x2)、銀杏葉(x3)、桑白皮(x4)、甘草(x5)和丹參(x6)。綜合評價分?jǐn)?shù)作為因變量，由y表示。多元二次方程由DPS建立：y=-223.2+57.8×x2+0.5×x4+46.4×x5+0.1×x12-2.9×x22-2.0×x52+0.002×x2×x3-4.1×x2×x5，R2=0.999 998，F(xiàn)值=62 499.906 3，回歸顯著性檢驗(P=0.003 1)。結(jié)果表明，該比例為14∶7∶11∶12∶5∶3，具有最佳的治療效果。DPS的所有分析結(jié)果均記錄在補充材料中。

表2 4種評價指標(biāo)結(jié)果及相應(yīng)歸一化處理后分?jǐn)?shù)與總分

3 討論

中藥復(fù)方防治雞毒支原體與大腸埃希氏菌混合感染有潛在的優(yōu)勢。雞毒支原體感染病雞的肺組織的病變、壞死及咳喘等癥狀是邪實的表現(xiàn)，病雞抵抗力降低，導(dǎo)致機體正氣受損，據(jù)此本病應(yīng)屬虛證范疇的正虛邪實證[13]。中藥復(fù)方具有成份復(fù)雜和多靶點的特點，通過扶正祛邪，以增強動物免疫力，當(dāng)免疫細(xì)胞大量吞噬病原體后，使機體恢復(fù)平衡而達(dá)到藥到病除的目的[14]。另外，復(fù)方中藥還對雞大腸埃希氏菌感染時產(chǎn)生的內(nèi)毒素具有直接或者間接殺滅及清除作用，對動物機體整體起多向調(diào)節(jié)作用[15]。不同于抗生素和化學(xué)合成藥物，中藥成分均為生物有機物，其毒副作用小是中藥發(fā)展的優(yōu)勢，并且還具有低殘留的特點[16]。本研究所用6味中藥為本實驗室根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法反向篩選出來的新中藥組合物，包括6味中藥，分別是板藍(lán)根、連翹、桑白皮、銀杏葉、甘草和丹參。

通過回歸分析得到了多元二次方程。該方程可以很好地擬合每味中藥對總分的影響，表明板藍(lán)根、桑白皮和甘草與混合感染雞的綜合指標(biāo)總分具有正相關(guān)的關(guān)系，其中板藍(lán)根對總分的影響最大。本中藥組合物一方面能抑制雞毒支原體和雞致病性大腸埃希氏菌生長，另一方面配伍具有潤肺止咳、清熱解毒、鎮(zhèn)痛抗炎等功效。諸藥配合，發(fā)揮清熱解毒、潤肺止咳之功效，標(biāo)本兼治，達(dá)到防治效果。

本研究采用均勻試驗設(shè)計對中藥的不同組合進行優(yōu)化，并根據(jù)綜合指標(biāo)進行了多元二次回歸，新中藥復(fù)方中板藍(lán)根、連翹、銀杏葉、桑白皮、甘草和丹參的比例為14∶7∶11∶12∶5∶3，具有最佳的治療效果。該方法為進一步開發(fā)現(xiàn)代中藥和對禽類呼吸系統(tǒng)疾病進行綜合評價提供了依據(jù)。