王長江，曲光剛,*，武曰星，郭廣君，韓 強，趙中偉，沈志強,*

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原[1]，還可引起感染豬的免疫抑制和豬皮炎與腎病綜合征(PNDS)、母豬繁殖障礙、仔豬先天性震顫等疾病[2]?，F(xiàn)階段豬群感染PCV2后尚無特效治療性藥物，對PCV2相關(guān)疾病的防控主要集中在防止繼發(fā)感染、提高機體抵抗力等方面。納米抗體(nanobody，Nb)[3]具有穩(wěn)定的分子結(jié)構(gòu)以及良好的熱穩(wěn)定性，可溶性極高，不易聚集，能耐強酸、強堿等致變性條件，適于原核表達和各種真核表達系統(tǒng)[4]，并且已被證明具有高效的抗原結(jié)合活性。Nb許多方面均優(yōu)于傳統(tǒng)抗體，在治療性抗體藥物研發(fā)[5]、臨床體外診斷[6]、腫瘤研究和免疫學研究等領(lǐng)域[7]均獲得廣泛應用。但其在臨床應用過程中也存在半衰期短、有效性相對較低等不足。多價抗體是識別同種或不同表位的單價抗體的聚合物，比單價抗體具有更高的抗原親和活力，并且能夠顯著延長在體內(nèi)的半衰期[8]。自雙特異性抗體藥物Blinatumomab進入市場以來，人們對雙價和雙特異性抗體的研究興趣日益增加[9]。雙價雙特異性抗體能夠識別相同抗原或不同抗原上的多種抗原表位[10]，因此具有更廣泛的功能和用途。Nb因其結(jié)構(gòu)簡單、易于進行基因操作和可用原核或真核細胞進行表達的優(yōu)勢使其容易被開發(fā)成雙價或雙特異性納米抗體。研究表明，雙價納米抗體對流感病毒的抑制作用至少是相應單價納米抗體的60倍[11]。

因此，構(gòu)建PCV2雙價納米抗體作為Cap蛋白的頡頏物，相較于單價納米抗體可以有效提高其活性。本研究將篩選到的Cap特異性納米抗體基因序列作為基本單元，通過原核表達系統(tǒng)制備了雙價單特異性納米抗體，以期為PCV2的抗原抗體檢測和PCV2相關(guān)疾病的防控提供新型候選抗體工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及載體E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)菌株購自寶生物工程(大連)有限公司；pCold-SUMO載體和PCV2 Cap蛋白特異性VHH基因由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院預防獸醫(yī)學與動物生物技術(shù)重點開放實驗室提供，其中Cap蛋白特異性VHH基因為本課題組利用噬菌體展示技術(shù)從前期構(gòu)建的納米抗體文庫中淘選獲得。

1.1.2 主要試劑 PCV2 Cap蛋白來自山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院預防獸醫(yī)學與動物生物技術(shù)重點開放實驗室；rTaqDNA聚合酶、DNA Marker DL 2 000、DNA Marker DL 5 000為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；SacⅠ、BamH Ⅰ和Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶為NEB有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖為Biowest公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒為美國OMEGA公司產(chǎn)品；Ni2+-NTA親和層析柱為常州天地人和生物科技有限公司產(chǎn)品；氨芐青霉素(Ampicillin)為SIGMA公司產(chǎn)品；Anti His-tag (HRP)鼠源單抗購自康為世紀生物科技有限公司；其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 DNA Engine Dyad PCR儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；NanoDrop 2 000，酶標儀(multiskan FC型)、冷凍高速離心機(legend micro 17R型)為賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品；小型常規(guī)低壓電泳儀(AE-8135 mypower 300)為日本ATTO公司產(chǎn)品；恒溫金屬浴(CHB-100)為杭州博日科技有限公司產(chǎn)品；全自動凝膠成像系統(tǒng)(610型)為北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計及VHHs片段PCR擴增 根據(jù)篩選的PCV2 Cap特異性VHH測序序列，用分子生物學軟件Primer Premier 5.0設(shè)計兩對特異性引物分別用于擴增上游VHHup片段和下游VHHdown片段；VHHup和VHHdown片段除兩端酶切位點和附加序列不同外，中間為使用同一VHH基因模板擴增出的相同序列。VHHup片段擴增引物VHHup-F和VHHup-R分別含有SacⅠ和BamH Ⅰ限制性內(nèi)切酶酶切位點，其中l(wèi)inker基因作為引物的一部分包含在VHHup-R中；VHHdown片段擴增引物VHHdown-F和VHHdown-R分別含有BamH Ⅰ和Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶酶切位點。重組質(zhì)粒鑒定引物為pCold系列載體上提供的通用測序引物，VHH片段擴增及重組載體鑒定所用引物見表1，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。以篩選獲得的PCV2 Cap特異性VHH基因序列為模板，分別用VHHup-F/VHHup-R和VHHdown-F/VHHdown-R引物進行PCR反應；VHHupPCR產(chǎn)物預期大小約500 bp，VHHdownPCR產(chǎn)物預期大小約400 bp。VHH基因PCR反應程序為：95℃ 5 min；94℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s，30個循環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物通過10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小。

1.2.2 雙價VHH重組表達載體構(gòu)建及鑒定 VHHdown片段與pCold-SUMO載體分別用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，酶切產(chǎn)物分別純化回收后經(jīng)T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞。用PCR方法對重組質(zhì)粒鑒定，并送上海生工生物工程有限公司測序，測序正確的重組質(zhì)粒命名為VHHdown-pCold-SUMO。

VHHup片段與VHHdown-pCold-SUMO重組質(zhì)粒分別用SacⅠ和BamH Ⅰ限制性內(nèi)切酶雙酶切，經(jīng)T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞。通過菌液PCR方法和雙酶切鑒定重組質(zhì)粒；對鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進行測序驗證。測序正確的重組質(zhì)粒命名為biVHHcap-pCold-SUMO。

表1 VHH片段擴增及重組載體鑒定引物

1.2.3 雙價單特異性VHH原核表達與純化 將重組質(zhì)粒biVHHcap-pCold-SUMO轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞，挑取單菌落過夜培養(yǎng)，次日將過夜培養(yǎng)物接種至新鮮LB培養(yǎng)基中，待細菌達到對數(shù)生長期時加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導表達5 h；同時將單價重組質(zhì)粒VHHdown-pCold-SUMO轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，以相同條件進行誘導表達；以未誘導的biVHHcap-pCold-SUMO/BL21和VHHdown-pCold-SUMO/BL21在相同培養(yǎng)條件下的結(jié)果作為陰性對照。誘導表達后菌體細胞經(jīng)超聲波破碎，高速離心分離上清和沉淀，將雙價和單價VHH表達產(chǎn)物分別進行SDS-PAGE分析。

使用Ni2+親和層析柱對原核表達的雙價及單價VHH重組蛋白進行純化，純化后的VHH重組蛋白溶液采用BCA蛋白法含量檢測試劑盒測定濃度。將純化后雙價VHH和單價VHH蛋白溶液稀釋至1 mg/mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 ELISA效價分析 參照文獻[12]方法并做適當修改，使用間接ELISA方法檢測純化后VHH 重組蛋白的效價水平。以PCV2 Cap蛋白作為抗原包被96孔酶標板，以梯度稀釋(1∶100、1∶500、1∶1 000、1∶5 000、1∶10 000、1∶50 000和1∶100 000)的雙價VHH作為一抗與包被抗原進行反應，將單價VHH重組蛋白進行同步操作；以pCold-SUMO/BL21超聲上清100倍稀釋液作為陰性對照，以3% MPBS作為空白對照；以Anti His-tag (HRP)鼠源單抗作為二抗與VHH重組蛋白進行反應，用TMB底物顯色后在OD450nm波長處讀取吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的PCR擴增

以同一株P(guān)CV2 Cap特異性VHH基因為模板，分別用VHHup和VHHdown引物進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果VHHup和VHHdownPCR產(chǎn)物片段分別位于約500 bp和400 bp位置(圖1)，與預期目的片段大小相符。

M.DNA標準DL 2 000；1.VHHup PCR產(chǎn)物；2.VHHdown PCR產(chǎn)物

2.2 重組表達載體構(gòu)建與鑒定

通過兩步雙酶切-連接反應，分別將VHHdown和VHHup目的基因依次克隆至pCold-SUMO載體中，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，通過菌液PCR對雙價重組質(zhì)粒進行鑒定，結(jié)果陽性重組質(zhì)粒擴增出預期大小約900 bp的特異性條帶(圖2)，重組質(zhì)粒VHHup-VHHdown-pCold-SUMO經(jīng)SacⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后得到約5 000 bp和900 bp兩條帶(圖3)，與預期片段大小相符,表明雙價重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

2.3 雙價單特異性VHH原核表達與純化

使用E.coliBL21(DE3)分別對PCV2 Cap雙價單特異性和單價VHH同時誘導表達，對誘導表達后的產(chǎn)物和純化后的重組蛋白進行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，雙價與單價VHH重組蛋白主要以可溶表達形式存在于細胞破碎上清中，biVHHcap-pCold-SUMO/BL21表達產(chǎn)物在約45 ku處出現(xiàn)特異性條帶，VHHdown-pCold-SUMO/BL21表達產(chǎn)物在約30 ku處出現(xiàn)特異性條帶，而對應的未誘導菌無此條帶(圖4)，雙價與單價VHH重組蛋白條帶位置與預期目的蛋白大小相符。用Ni2+親和層析柱對biVHHcap表達產(chǎn)物進行純化，純化后的蛋白進行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示biVHHcap重組蛋白能夠通過親和層析柱進行富集純化(圖5)，灰度分析顯示純化后目的蛋白條帶含量在80%以上。

M.DNA標準DL 2 000；ctrl.PCR 陰性對照；1～6.雙價重組菌菌液PCR結(jié)果

M.DNA標準DL 5 000；M1.DNA標準DL 2 000；1～2.雙價重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

2.4 ELISA效價分析

Cap蛋白特異性雙價VHH和單價VHH重組蛋白純化后分別以1 mg/mL為起始濃度進行梯度稀釋，在1∶100～1∶50 000稀釋度范圍內(nèi)，雙價VHH重組蛋白的ELISA反應吸光值均高于相同濃度的單價VHH重組蛋白，表明雙價VHH重組蛋白與抗原的結(jié)合活性較單價VHH更強；以樣本OD450/陰性O(shè)D450 ≥3作為陽性判定標準，Cap特異性單價VHH ELISA效價約為1∶500，而雙價VHH ELISA效價為1∶10 000以上，雙價VHH的ELISA效價比單價VHH增加了20倍。

M.蛋白分子質(zhì)量標準；1.未誘導VHHdown-pCold-SUMO/BL21超聲后上清；2.未誘導VHHdown-pCold-SUMO/BL21超聲后沉淀；3.誘導VHHdown-pCold-SUMO/BL21超聲后上清；4.誘導VHHdown-pCold-SUMO/BL21超聲后沉淀；5.未誘導biVHHcap-pCold-SUMO/BL21超聲后上清；6.未誘導biVHHcap-pCold-SUMO/BL21超聲后沉淀；7.誘導biVHHcap-pCold-SUMO/BL21超聲后上清；8.誘導biVHHcap-pCold-SUMO/BL21超聲后沉淀

M.蛋白分子質(zhì)量標準；1.biVHHcap-pCold-SUMO/BL21誘導表達超聲上清；2.過柱流穿液；3～6.biVHHcap-pCold-SUMO重組蛋白純化結(jié)果

3 討論

PCV2 ORF2編碼的Cap蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白和抗原決定簇，因此常被作為PCV2檢測和疫苗研究的靶蛋白。為了解決PCV2檢測和防控中存在的難題，本研究用原核表達系統(tǒng)制備了抗PCV2 Cap蛋白的雙價單特異性納米抗體，并對其活性進行了分析。雙價或雙特異性抗體由于其相對親和力高、能夠識別不同抗原表位，羊駝來源的VHH具有相對分子質(zhì)量小、免疫原性低、可溶性高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等優(yōu)勢，是雙價或雙特異性納米抗體構(gòu)成單元的理想選擇[10]。本研究在兩個相同納米抗體片段之間引入(G4S)3-linker序列，以柔性連接的方式將Cap單價納米抗體串聯(lián)成雙價單特異性納米抗體。用羊駝免疫球蛋白IgG2a上鉸鏈作為連接兩個納米抗體單元的橋梁，免疫球蛋白鉸鏈的天然柔韌性保證了雙價納米抗體結(jié)構(gòu)中每個結(jié)構(gòu)單元活動的獨立性。本研究構(gòu)建的Cap雙價單特異性納米抗體使用了15個氨基酸序列長度的GS-linker，能夠保證雙價VHH重組蛋白中每個組分具有相對獨立的結(jié)構(gòu)和功能。

制備多價納米抗體另一種相對便捷的方法是將小分子多聚結(jié)構(gòu)與納米抗體單分子進行融合表達，然后使其自發(fā)聚合形成多價納米抗體。這種方法中小分子多聚結(jié)構(gòu)的選擇是多價納米抗體是否制備成功的關(guān)鍵因素。有研究用谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GSTs)和霍亂毒素B亞基(CTB)作為聚合載體分別制備抗赭曲霉毒素的納米抗體[13]，發(fā)現(xiàn)GST-VHH主要以單體形式存在，CTB-VHH主要以五聚體形式存在。本研究通過基因工程方法直接構(gòu)建了雙價納米抗體的串聯(lián)序列，保證了目的納米抗體原核表達產(chǎn)物全部為雙價，表達水平與單價納米抗體原核表達水平相當，且容易通過載體上的標簽進行純化，降低了雙價抗體的制備難度和成本。

圖6 雙價單特異性VHH與單價VHH ELISA效價水平

本文將Cap蛋白VHH制備成雙價后有效提高了其親和活性，雙價VHH重組蛋白比其單價重組蛋白的ELISA效價提高了20倍。雙價抗體中兩個組成單元之間的連接方式也會對雙價抗體重組蛋白的活性產(chǎn)生影響，傳統(tǒng)的C端-N端連接方式可能會抑制雙價抗體的抗原結(jié)合活性[14]。本文構(gòu)建的Cap蛋白雙價單特異性VHH中兩個組成單元之間以(C-N)方式進行串聯(lián)，后續(xù)研究可以嘗試以(C-C)連接方式制備Cap蛋白雙價VHH，并對其ELISA效價水平進行驗證，為PCV2高親和力多價納米抗體的研制、檢測及疫病防控提供新型抗體工具。