楊 麗

（遼寧省凌海市農(nóng)業(yè)農(nóng)村發(fā)展中心-動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 凌海 121200）

血凝和血凝抑制試驗(yàn)是目前縣級疫控中心獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行禽流感、新城疫動(dòng)物疫病監(jiān)測最常用的試驗(yàn)方法之一。但血凝和血凝抑制試驗(yàn)在實(shí)際操作中經(jīng)常受到多種因素的影響，增加了試驗(yàn)誤差，甚至改變了試驗(yàn)結(jié)果，本文結(jié)合實(shí)際工作，將影響試驗(yàn)結(jié)果的因素進(jìn)行總結(jié)分析。

1 被檢樣品對試驗(yàn)結(jié)果的影響因素

1.1 樣品處理 采樣后將樣品傾斜放置2～4h（防止暴曬），讓其自然析出血清(夏天放在室內(nèi),冬天可以放置在37℃溫箱內(nèi)析出)。避免搖晃，防止溶血。采血后盡量避免馬上離心，防止分離后的血清形成膠凍狀或不完全膠凍樣。特殊情況需要分離血清時(shí)，需1500～2000轉(zhuǎn)/min，離心5min。

1.2 樣品保存 采樣后要及時(shí)送檢，不能在24h內(nèi)送到的，全血要分離出血清，將血清冷凍后送檢。分離的血清在冷藏溫度下（4℃）存放不能超過5d，冷凍溫度下（-20℃）不能存放時(shí)間過久（6個(gè)月為宜），冷凍后的血清不能反復(fù)凍融（不宜超過3次），會直接導(dǎo)致抗體效價(jià)降低。血清樣品保存不當(dāng)，無論是運(yùn)送中還是檢驗(yàn)中，腐敗變質(zhì)會嚴(yán)重影響試驗(yàn)結(jié)果。

2 雞紅細(xì)胞的制備對試驗(yàn)結(jié)果的影響因素

2.1 雞紅細(xì)胞的采集 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)準(zhǔn)備3只SPF公雞，條件不足的也可選免疫過禽流感和新城疫疫苗的的健康公雞，但應(yīng)比正常洗滌血球次數(shù)增加3～5次，洗去紅細(xì)胞表面的抗體，以減小結(jié)果誤差。

給大公雞采血時(shí)要做到無菌操作，用一次性注射器(10mL、9號針頭)可在一個(gè)大容器內(nèi)先加入抗凝劑，采血后拔下針頭將容器傾斜，沿著容器壁將血緩緩打入，注意速度不要太快，以免擠破紅細(xì)胞?？鼓齽┮m量添加（可以實(shí)際經(jīng)驗(yàn)為準(zhǔn)），加入的過多會影響紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，抑制凝集現(xiàn)象產(chǎn)生，加入過少則血液出現(xiàn)凝集塊，影響試驗(yàn)觀察，引起誤判使得凝集價(jià)偏低，凝集抑制價(jià)偏高。同樣抗凝劑加入的時(shí)間、方法不當(dāng)同樣會產(chǎn)生血凝塊，影響檢測結(jié)果。采血后將采出的3只公雞血混合再離心，這樣配出的紅細(xì)胞均勻一致。

2.2 1%雞紅細(xì)胞的離心配制

紅細(xì)胞的濃度對血凝及血凝抑制試驗(yàn)的結(jié)果有很大影響,采用國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定1%的雞紅細(xì)胞。洗滌血球時(shí)離心的轉(zhuǎn)速為新城疫2000轉(zhuǎn)/min，禽流感1000轉(zhuǎn)/min，時(shí)間為10min，洗滌次數(shù)3～5次，不應(yīng)少于3次，直至上清液與PBS顏色接近為止。如果離心的轉(zhuǎn)速偏高，等體積紅細(xì)胞數(shù)量增大，血凝價(jià)測定偏低，血凝抑制價(jià)相應(yīng)偏低；相反離心的轉(zhuǎn)速偏低，等體積紅細(xì)胞數(shù)量減少，結(jié)果造成血凝價(jià)測定偏高，血凝抑制價(jià)相應(yīng)偏高。離心結(jié)束后用吸管將上清液移去（必須除去上層的白膜），切勿倒出去，直接倒出去達(dá)不到離心的目的，會使紅細(xì)胞混入洗液。移完后再用吸管加入等量的洗液，保持離心機(jī)的平衡。離心好的紅細(xì)胞用吸管（最好剪成斜型）小心吸取，不能反復(fù)吹吸，以免造成紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，發(fā)生溶血，使用溶血后的血球相當(dāng)于紅細(xì)胞的有效濃度降低，會出現(xiàn)上段所述結(jié)果，同時(shí)影響觀察效果。洗滌次數(shù)不能減少，以確保得到純凈的雞紅細(xì)胞。洗滌次數(shù)減少后，血清中的雜質(zhì)不能洗干凈，會干擾反應(yīng)體系病毒與紅細(xì)胞的反應(yīng)，造成試驗(yàn)誤差。

配制好的紅細(xì)胞懸液當(dāng)日用不完的可置4℃冰箱保存，時(shí)間不超過1周，但實(shí)際工作中如果每天都使用，超過3d紅細(xì)胞就開始溶血不能使用，以免影響試驗(yàn)結(jié)果。

3 反應(yīng)板的選擇、使用對試驗(yàn)結(jié)果的影響

3.1 反應(yīng)板應(yīng)選擇質(zhì)量好的一次性96孔V型板，要保持板面及凹孔的干凈，板面應(yīng)水平，不能彎曲、傾斜，使用不合格的反應(yīng)板會嚴(yán)重影響結(jié)果。板孔傾斜的角度會影響紅細(xì)胞的沉降速度，角度過小，紅細(xì)胞沉降加快，血凝價(jià)偏低，血凝抑制價(jià)偏高。角度過大，紅細(xì)胞沉降減慢，血凝價(jià)偏高，血凝抑制價(jià)偏低。

3.2 在試驗(yàn)靜置過程中不能振動(dòng)反應(yīng)板。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間沒到而頻繁的取放、觀察反應(yīng)板，操作不甚，凝集會受到影響，測定的凝集價(jià)偏低，而凝集抑制價(jià)會偏高。因此在靜置過程中一定要輕拿輕放，最好是等到時(shí)間再看結(jié)果，才能保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

4 抗原效價(jià)的測定及配置對試驗(yàn)結(jié)果的影響

4.1 抗原的保存 血凝及血凝抑制試驗(yàn)用的抗原一般是干粉，應(yīng)-20℃保存。在進(jìn)行抗原效價(jià)的測定時(shí)，同一批號的抗原最好同時(shí)使用，并要經(jīng)過4HAU抗原回滴，對抗原進(jìn)行最終校正，重復(fù)試驗(yàn)，減少誤差?？乖哪瘍r(jià)在外界不穩(wěn)定，冷藏保存或反復(fù)凍融時(shí)其血凝價(jià)降低。測定好血凝價(jià)的抗原如果一次不能用完時(shí)應(yīng)分裝到滅菌離心管內(nèi)，管上標(biāo)注分裝日期和效價(jià)，每管的分裝量最好是一次使用量，避免反復(fù)凍融。使用反復(fù)凍融的抗原，血凝抑制滴度會偏高，一般血凝價(jià)相差的滴度與血凝抑制價(jià)相差的滴度相一致。

4.2 稀釋液

稀釋液應(yīng)使用pH為7.0～7.2的PBS緩沖液，pH值7.2時(shí)，紅細(xì)胞沉降最充分，圖形最清晰；PBS液的pH在5.8以下,紅細(xì)胞易自凝，試驗(yàn)結(jié)果不成立；pH7.8以上凝集的紅細(xì)胞洗脫加快，易造成觀察誤差，使得凝集價(jià)檢測偏低，凝集抑制價(jià)偏高。PBS液要現(xiàn)配現(xiàn)用，PBS要在高壓后調(diào)至pH7.2。如果用生理鹽水代替PBS液，要使用新開瓶的滅菌生理鹽水，稀釋液的配制時(shí)間不宜過長，一經(jīng)使用保存不要超過3周，否則可能被環(huán)境污染，不能保持無菌的反應(yīng)環(huán)境，使得檢測結(jié)果受到干擾，出現(xiàn)試驗(yàn)不成立、跳孔等現(xiàn)象。

4.3 4單位病毒液的配制使用 計(jì)算好本次試驗(yàn)所需要的病毒液量，配制的4U病毒液量應(yīng)適當(dāng)正好，避免浪費(fèi)和不夠，配制好的病毒液要混勻，混合不均時(shí)，病毒的含量不一，濃度高的血凝抑制價(jià)降低，濃度低的血凝抑制價(jià)升高。病毒液要現(xiàn)配現(xiàn)用，放置時(shí)間不應(yīng)超過6h，并置于4℃冰箱保存。加樣時(shí)從冰箱取出。時(shí)間過長，病毒的凝集力降低，不放冰箱保存，病毒的凝集力會很快下降，不能繼續(xù)使用。加入4U病毒抗原時(shí)應(yīng)該從稀釋倍數(shù)高的孔向稀釋倍數(shù)低的孔加入（即從后向前加），滴加過程中采取懸滴法，避免移液吸頭接觸液面而被反應(yīng)板中的液體污染。振蕩的時(shí)間一般不少于1min，時(shí)間過短不能充分混合，凝集抑制價(jià)升高，時(shí)間過長血球容易被破壞，結(jié)果失敗，陰、陽對照不能成立。

5 加樣過程對試驗(yàn)結(jié)果的影響

5.1 血清樣品 病毒懸液和紅細(xì)胞懸液在使用前一定要搖勻，以保證每一孔中加入的濃度準(zhǔn)確一致，避免加入的濃度高低不一，人為造成誤差。搖晃紅細(xì)胞懸液時(shí)力度不宜過大，防止紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)被破壞，造成溶血。

5.2 在使用微量移液器時(shí)，吸頭要安裝牢固，防止漏氣，操作時(shí)移液吸頭應(yīng)插到液面以下（要求懸滴的除外），手壓下的力度要均勻，否則移液量不準(zhǔn)，造成結(jié)果偏差。在使用多道移液器時(shí)，吸取液體后觀察幾個(gè)吸頭中液面是否水平一致，有時(shí)操作不注意可能某個(gè)吸頭吸入量或多或少，直接影響結(jié)果測定。吸取的過程應(yīng)該做到“慢吸快打”，在吸液時(shí)要慢、準(zhǔn)，放液時(shí)對準(zhǔn)后速度要快，可以避免打完后吸頭下存留液體，保證加入的液體體積一致。

5.3 加液體時(shí)，最好懸滴，避免吸頭與反應(yīng)板孔接觸造成污染。尤其是在最后加入紅細(xì)胞懸液時(shí)，孔內(nèi)已有稀釋液、血清、4U抗原等，如果吸頭接觸到孔內(nèi)混合液，會造成各個(gè)孔內(nèi)液體相互污染，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)誤差。所以在使用移液器時(shí)，一定要保持加樣器吸頭與凝集板孔間的距離，以保證每個(gè)凝集孔內(nèi)液體數(shù)量和濃度準(zhǔn)確。

5.4 倍比稀釋血清時(shí)，抽吸6～8次，在吸取第一孔時(shí)要先按下移液器，再插入反應(yīng)板孔內(nèi)，吸取后插入第二孔液面以下，在反復(fù)抽取過程中，移液器吸頭不要離開液面，防止產(chǎn)生氣泡，造成移液體積不準(zhǔn)確。

5.5 滴加1%紅細(xì)胞懸液時(shí)，要經(jīng)?；蝿?dòng)紅細(xì)胞懸液（注意不要用移液吸頭反復(fù)吹打或是攪動(dòng)，避免破壞紅細(xì)胞），使紅細(xì)胞均勻分散在PBS中，防止紅細(xì)胞下沉，從而影響結(jié)果判定。

6 溫度和時(shí)間對試驗(yàn)結(jié)果的影響

環(huán)境溫度通常應(yīng)在20～25℃，不能過高或過低，環(huán)境溫度除了用空調(diào)控制外，還可選擇將反應(yīng)板放置于室溫溫箱內(nèi)。溫度對HI試驗(yàn)值的影響有時(shí)較大，室溫低于4℃，紅細(xì)胞會發(fā)生自凝。溫度高于37℃，凝集的紅細(xì)胞易洗脫，紅細(xì)胞很快沉降下來，即出現(xiàn)反應(yīng)物解離和紅細(xì)胞溶血現(xiàn)象。低于20℃反應(yīng)速度減慢，在規(guī)定時(shí)間觀察，對照結(jié)果不成立，此時(shí)讀孔，血凝價(jià)易判高，血凝抑制價(jià)易判低。所以選擇在20℃～25℃完成血凝抑制實(shí)驗(yàn)，應(yīng)通過溫箱控溫。加入紅細(xì)胞靜置時(shí)間應(yīng)按照操作規(guī)程規(guī)定的時(shí)間及時(shí)觀察，超時(shí)10min以上，紅細(xì)胞發(fā)生裂解，結(jié)果不再有意義。

7 4HAU抗原回滴對試驗(yàn)結(jié)果的影響

抗原回滴時(shí)必須選取奇數(shù)排、列的方法，便于取值。方法通常是在微量反應(yīng)板選擇3排5列，第5列為紅細(xì)胞對照孔。加樣后室溫(20～25℃)下靜置30～40min后觀察結(jié)果很重要。若第1、2孔凝集,則視為抗原配制正確。若第2孔流淌，則4HAU抗原濃度低，HA效價(jià)判高，需添加抗原。若第3孔發(fā)生凝集，則4HAU抗原濃度高，HA效價(jià)判低，需補(bǔ)加PBS。然后再次回滴，直至第1、2孔凝集,抗原配制正確為止。

8 小結(jié)

在血凝和血凝抑制試驗(yàn)中，影響試驗(yàn)結(jié)果的因素很多，只有嚴(yán)格按規(guī)定操作，細(xì)致、耐心地做好每一個(gè)環(huán)節(jié)，發(fā)現(xiàn)問題及時(shí)糾正處理，才能保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確。