葉裕香

（寧德市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，福建 寧德 352100）

血凝和血凝抑制試驗(yàn)是進(jìn)行動(dòng)物疫病診斷和免疫抗體水平監(jiān)測(cè)最常用的方法之一，常用于禽流感、雞新城疫等動(dòng)物疫病的血清學(xué)監(jiān)測(cè)，在實(shí)際操作過程中，常因?qū)嶒?yàn)人員的操作水平，實(shí)驗(yàn)環(huán)境因素，血清采集質(zhì)量等環(huán)節(jié)的影響，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果偏差?，F(xiàn)將主要影響因素歸納如下，供參考。

1 試驗(yàn)前準(zhǔn)備的影響

1.1 試劑的配制準(zhǔn)備 稀釋液最好是用0.01mol/LpH7.2的等滲磷酸鹽緩沖液（PBS)，宜現(xiàn)配現(xiàn)用，如果用生理鹽水代替PBS液，要使用新開瓶的滅菌生理鹽水；阿氏液應(yīng)經(jīng)高壓滅菌4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)用1%雞紅細(xì)胞懸液的配制 試驗(yàn)前應(yīng)準(zhǔn)備好3只以上的無特定免疫公雞（SPF健康公雞）或無禽流感、無新城疫抗體的健康公雞，如果直接使用體內(nèi)存在上述抗體的公雞將會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。采血時(shí)，應(yīng)無菌操作，按采血量的一定比例先抽取配好的阿氏液，然后采血，采血量與阿氏液等體積混合，反復(fù)顛倒幾次，充分混均，防止血液凝固。采血后，將采出的3～4只公雞血混合后再離心，這樣配出的紅細(xì)胞均勻一致。洗滌紅細(xì)胞時(shí)切記吸放紅細(xì)胞及注入PBS液時(shí)應(yīng)盡量輕柔，切忌用力，否則紅細(xì)胞會(huì)破裂造成溶血，影響試驗(yàn)結(jié)果。在洗滌紅細(xì)胞過程中，每次離心后均應(yīng)將白細(xì)胞層等吸除干凈。如果所配制的紅細(xì)胞濃度偏高，則血凝價(jià)可能偏低，血凝抑制價(jià)可能偏高；如果紅細(xì)胞濃度偏低，則血凝價(jià)可能偏高，血凝抑制價(jià)可能偏低。

1.3 試驗(yàn)用反應(yīng)板的及耗材的準(zhǔn)備 試驗(yàn)用反應(yīng)板有兩種，分有機(jī)反應(yīng)板和塑料反應(yīng)板。一般使用96孔90度V型微量反應(yīng)板，最好使用一次性96孔90度V型優(yōu)質(zhì)塑料反應(yīng)板，可避免因有機(jī)反應(yīng)板清洗不凈和過度磨損影響試驗(yàn)結(jié)果和判定。

吸頭應(yīng)選擇密封良好的環(huán)口，薄壁和嘴口尖的吸頭，易于安裝或卸脫，吸頭表面光潔平滑，防止液體滯留外壁引起誤差。吸頭應(yīng)與加樣器上吸頭套管密封完好，可防止由于空氣泄露而造成加樣精度或準(zhǔn)確度的誤差、盡可能使用一次性吸頭。

2 試驗(yàn)中操作的影響

2.1 溫度的影響 試驗(yàn)測(cè)定前，首先應(yīng)保證在室溫（20～25℃）環(huán)境下進(jìn)行，也可將反應(yīng)板放在恒溫箱內(nèi)控制試驗(yàn)溫度。檢測(cè)時(shí)避免處于通風(fēng)口下或其附近，以免由于過冷或過熱引起蒸發(fā)。

2.2 移液器正確使用的影響 移液器使用時(shí)要用力均勻，吸頭要安裝牢固，吸取液體時(shí)一定要緩慢平穩(wěn)地松開拇指，不允許突然松開，以免因吸液過快，產(chǎn)生氣泡，影響加樣。使用時(shí)應(yīng)采用一檔吸液二檔排液的方法。移液器在滴加液體，特別是在加抗原和紅細(xì)胞懸液時(shí)一定不要深入液面中造成交叉污染，影響濃度造成結(jié)果較大誤差，可以嘗試懸空垂直加樣。

2.3 血凝結(jié)果的判定影響 血凝結(jié)果的判定，直接影響到4U抗原的配制。一定要準(zhǔn)確把握最大凝集度，就是凝集不流淌。4U抗原配備也要求準(zhǔn)確，如果配備的抗原效價(jià)高，抗體滴度就會(huì)低，反之抗體滴度會(huì)高，一般宜現(xiàn)用現(xiàn)配。可用回歸試驗(yàn)來判定效價(jià)測(cè)定的正確與否。做法：做4排，每排的1～4孔加入PBS液50μL，取配好的4U抗原50μL與第一孔做倍比稀釋至最后一孔并棄掉50μL，最后每孔加入50μL紅細(xì)胞懸液，震蕩，靜置20min觀察結(jié)果，如果第一和第二孔完全凝集不流淌，第三和第四孔不凝集流淌，則說明4U抗原配制正確。

2.4 試驗(yàn)時(shí)間把握的影響 正常在室溫（20～25℃）環(huán)境下，每孔加入4U抗原后，靜置時(shí)間應(yīng)至少30min，以完成抗原抗體反應(yīng)；然后再加入已配好的1%的紅細(xì)胞懸液，再靜置時(shí)間40min。最后傾斜45度，觀察結(jié)果。

3 結(jié)果判定的影響

試驗(yàn)結(jié)果判定的及時(shí)性會(huì)影響到準(zhǔn)確性。檢測(cè)中，每次試驗(yàn)均應(yīng)設(shè)抗原與PBS對(duì)照，加入1%的紅細(xì)胞懸液后，每隔5min應(yīng)觀察一次，一旦兩列對(duì)照孔圖像清晰地顯示出來時(shí)，應(yīng)立即對(duì)樣本進(jìn)行結(jié)果判定，過早過晚都會(huì)影響判定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4 其它的影響因素

4.1 血清樣品的保存 血清樣品離心后，分裝至1.5mL離心管中，標(biāo)記清楚，對(duì)應(yīng)編號(hào)冷藏送檢。一般情況下，在5d內(nèi)檢測(cè)的樣品可放置于4℃冰箱中冷藏，否則應(yīng)低溫冷凍保存。

4.2 非特異性因子的影響 檢測(cè)水禽時(shí)，還常常會(huì)出現(xiàn)前幾孔和最后幾孔凝集而中間孔沉淀的現(xiàn)象，這是由于水禽血清中含有非特異性血凝抑制因子導(dǎo)致的。建議試驗(yàn)中用水禽的血配制1%的紅細(xì)胞懸液來做水禽的抗體檢測(cè)，這樣可以大大地減少這種現(xiàn)象的發(fā)生。

4.3 倍比稀釋的影響 倍比稀釋時(shí)每孔至少反復(fù)吹吸5～6次，以便混合均勻，還應(yīng)注意盡量避免產(chǎn)生泡沫引起混合不均。加抗原及紅細(xì)胞時(shí)應(yīng)在板內(nèi)液面上方加樣，以免交叉污染，影響試驗(yàn)結(jié)果。

4.4 人為因素的影響 比如加樣時(shí)漏加或重復(fù)加樣等。因此，在試驗(yàn)中應(yīng)做到安靜并集中注意力，加好每個(gè)樣。