覃鳳嫻 劉小勇 陳 翔 （廣西醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，柳州545005）

炎癥細胞在炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用。腫瘤作為一種慢性炎癥性疾病，常常伴有大量炎癥細胞浸潤。中性粒細胞是最重要的炎癥免疫細胞之一，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。在腫瘤微環(huán)境中，常常聚集有大量中性粒細胞，研究者將此類細胞稱為腫瘤相關中性粒細胞（tumor associated neu?trophils，TANs）。目前，TANs 在腫瘤中的作用引起研究者的廣泛關注，其對腫瘤的促瘤和抑瘤作用已被越來越多研究者認可［1］。利用TANs 的兩面性靶向治療腫瘤已成為腫瘤學研究領域的熱點［2］。本文就近年來靶向作用TANs 治療各種腫瘤的研究進展進行綜述。

1 TANs對癌癥結局的雙重性

中性粒細胞是人類最豐富的循環(huán)白細胞，含有大量細胞毒性分子、蛋白酶和其他蛋白質(zhì)，是抵御感染的第一道免疫防線［3］。在趨化因子作用下，外周血中的中性粒細胞被募集至腫瘤組織內(nèi)，即TANs。類似于M1/M2 型腫瘤相關巨噬細胞，腫瘤微環(huán)境中的TANs可分為N1和N2兩種表型。其中，N1型具有抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用，其機制包括直接細胞毒作用、抗體依賴的細胞毒性作用（antibodydependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）及激活其他免疫細胞等作用。N2型TANs則促進腫瘤細胞增殖轉(zhuǎn)移，并抑制機體的腫瘤免疫，最終促進腫瘤進展。早在 1970 年，BUBENIK 等［4］和 GODLESKI等［5］就觀察到TANs 對人膀胱腫瘤和大鼠乳腺癌具有抑制作用。后來，TAKASUGI 等［6］又發(fā)現(xiàn)，循環(huán)中的中性粒細胞對多種腫瘤細胞均具有細胞毒作用。在接下來的幾十年里，大量報道表明TANs 在體外對癌細胞具有細胞毒性和細胞抑制作用。SOUTO等［7］報道稱，將中性粒細胞直接轉(zhuǎn)移到腫瘤組織后，腫瘤的生長減少了49%。隨著研究的深入，研究者逐漸認識到，TANs在腫瘤發(fā)生的不同階段發(fā)揮不同功能。ALBANESI 等［8］研究發(fā)現(xiàn)，如果在腫瘤發(fā)生的早期階段將TANs 剔除，腫瘤細胞的生長速度明顯加快；而在腫瘤發(fā)生的中晚期階段，TANs 在腫瘤微環(huán)境的作用下發(fā)生功能改變，其釋放的多種蛋白酶不僅抑制了腫瘤細胞凋亡，還促進腫瘤血管新生。以上提示TANs 主要在腫瘤發(fā)生發(fā)展的早期階段發(fā)揮抗腫瘤作用，而在腫瘤晚期階段，受腫瘤微環(huán)境的影響，TANs 發(fā)生功能的改變，其釋放的細胞因子發(fā)生變化，從而發(fā)揮促進腫瘤進展作用。AEED 等［9］研究證實，在腫瘤發(fā)生的中晚期階段，TANs 可分泌多種基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallo?proteinases，MMPs），后者對基底膜有較強的降解能力，從而增強了乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移潛能。RAKAEE等［10］對 536 例肺癌組織進行基因芯片技術分析，證實了肺腺癌患者體內(nèi)TANs 數(shù)量與患者的不良預后密切相關。該結論在ZHANG 等［11］的喉癌研究中也得到證實。動物模型研究進一步證明，外周血中性粒細胞比例隨著腫瘤的進展不斷地增加，清除中性粒細胞后，腫瘤的發(fā)生受到顯著抑制。以上諸多研究提示TANs 在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有抑瘤和促瘤的雙重作用，靶向抑制TANs 的促腫瘤作用或誘導其抗腫瘤作用，可為腫瘤治療提供新的策略。

2 靶向TANs治療腫瘤

鑒于TANs 在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮抑瘤及促瘤的雙重作用，充分合理地利用其雙重作用有可能為腫瘤的治療提供新的思路和新的方法。將TANs 作為靶標治療相關腫瘤，根據(jù)TANs 雙重特性制定相應的腫瘤免疫治療策略，如通過多種方式靶向抑制TANs 的促瘤作用從而達到控制腫瘤發(fā)生發(fā)展的目的；另外，充分增強或誘導TANs 的抗腫瘤作用也是抑制腫瘤進展的有效途徑。

2.1 抑制TANs 募集至腫瘤微環(huán)境 TANs 以及循環(huán)中的中性粒細胞均來源于粒細胞樣髓源抑制細胞（granulocytic-myeloid derived suppressor cells，GMDSCs）［12］。腫瘤細胞可產(chǎn)生多種強有力的中性粒細胞化學引誘劑和激活劑，進而將循環(huán)中的中性粒細胞募集至腫瘤組織，形成TANs。目前發(fā)現(xiàn)募集作用最強的趨化因子是IL-8/趨化因子8（chemokine 8，CXCL8），另外 CXCL1、CXCL2、CXCL5 及 CXCL6 等其他趨化因子對TANs 也有較強的趨化作用［13］。募集至腫瘤微環(huán)境的TANs 可進一步合成、分泌大量蛋白酶參與腫瘤微環(huán)境重塑，導致更多炎癥細胞聚集。ZHOU 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，TANs 可進一步招募巨噬細胞、T 淋巴細胞等共同參與促進肝腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。TANs的數(shù)量還與肝腫瘤大小、腫瘤組織內(nèi)血管新生及腫瘤組織分期分化呈正相關。因此，抑制TANs 廣泛募集至腫瘤微環(huán)境，減少腫瘤微環(huán)境TANs 的形成，可能在癌變的早期起到一定的預防作用［15］。鑒于趨化因子對TANs 募集的重要作用，改變腫瘤微環(huán)境中趨化因子的水平，破壞腫瘤微環(huán)境的穩(wěn)定狀態(tài)，可有效減少TANs 在腫瘤組織內(nèi)的募集。有研究表明，采用IL-8 拮抗劑（ABXIL8）可有效降低腫瘤組織中TANs的浸潤，使得黑色素瘤與肺癌等腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移能力明顯減弱，腫瘤組織內(nèi)的血管新生也得到明顯抑制［16］。C-X-C趨化因子受體2（C-X-C motif chemokine recep?tor 2，CXCR2）中和抗體或小分子抑制劑的使用也可顯著抑制TANs 的聚集，從而抑制腫瘤生長［17］。另有研究報道，采用CXCR1小分子拮抗劑Reparixin可顯著減少TANs 在腫瘤組織中的浸潤并抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展［18］。趨化因子的產(chǎn)生和活性主要受相關通路的調(diào)節(jié)，如ras 癌基因上調(diào)CXC 趨化因子的表達，導致腫瘤發(fā)生部位大量TANs 聚集，因此抑制相關通路的激活也可達到減少TANs浸潤的目的［19-20］。

2.2 阻斷TANs 的促腫瘤效應 TANs 在腫瘤微環(huán)境的作用下釋放多種促腫瘤因子進而促進腫瘤發(fā)展，這是目前普遍公認的TANs 促瘤機制。N2 型TANs可釋放多種蛋白酶，促進腫瘤細胞的惡性增殖和轉(zhuǎn)移。其中彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）主要參與腫瘤的惡性增殖過程；MMPs 主要調(diào)控腫瘤的血管新生及轉(zhuǎn)移。阻斷或減少這些蛋白酶的產(chǎn)生有望達到抑制腫瘤進展的目的。HOUGHTON等［21］在大鼠肺癌模型研究中發(fā)現(xiàn)，TANs分泌的大量NE 能夠直接促進癌細胞增生，而減少NE 的分泌能夠顯著抑制肺癌細胞生長［22］。CARUSO等［23］研究發(fā)現(xiàn)，高水平的NE 可促進乳腺癌細胞增殖能力，而沉默小鼠NE 基因后，腫瘤生長速度明顯減慢，腫瘤體積也顯著減小。MMPs 可降解細胞基底膜，破壞組織學屏障，促進癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。其中MMP-9被認為是癌細胞轉(zhuǎn)移擴散過程中最重要的蛋白酶之一。高劑量的MMP-9 除了可以降解腫瘤細胞外基質(zhì)，還可刺激血管新生，加速腫瘤擴散［24］。TANs可分泌大量MMP-9，是MMP-9的主要來源細胞。采用MMP 強效拮抗劑唑來膦酸抑制腫瘤微環(huán)境中MMP-9 的表達和作用，可有效減少腫瘤組織內(nèi)的血管新生，進而抑制宮頸癌進展［25］。另有研究發(fā)現(xiàn)，通過安卓奎諾爾抑制MMP-9 基因表達及活性，可顯著抑制乳腺癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲［26］。此外，在腫瘤細胞及腫瘤微環(huán)境的影響下，TANs可促進前動力蛋白2（prokineticin 2，PROK2）表達，后者可通過促進內(nèi)皮細胞的增殖加速血管生成。PROK2 抗體的使用可有效抑制腫瘤血管新生和腫瘤生長［27］。此外，通過特異性阻斷重要信號通路的激活，抑制TANs 來源的促瘤物質(zhì)產(chǎn)生，也可對腫瘤的形成、進展及轉(zhuǎn)移進行抑制。LEE 等［28］進一步研究發(fā)現(xiàn)，安卓奎諾爾可能通過調(diào)控核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）/MMP-9信號通路抑制MMP-9的表達及活性，進而抑制腫瘤的進展。PENG 等［29］發(fā)現(xiàn)，將中性粒細胞和黑色素瘤細胞共培養(yǎng)后，中性粒細胞內(nèi)NF-κB通路被異常激活；采用抑制劑阻斷該通路后，腫瘤細胞的增殖能力受到明顯抑制。另有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞培養(yǎng)基上清能夠快速激活中性粒細胞的 PI3K/Akt 通路［30-31］。該通路在 TANs 發(fā)揮促腫瘤效應方面起重要作用，阻斷這些通路的激活可以減少TANs 趨化因子及MM-9 等多種酶類的分泌，達到抑制腫瘤進展的目的。

2.3 剔除腫瘤微環(huán)境中的TANs 盡管早期的研究主要聚焦在TANs 的抗腫瘤作用，但最近越來越多的研究卻發(fā)現(xiàn)TANs 能夠通過多種機制促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。多數(shù)臨床研究認為大量浸潤的TANs是腫瘤患者預后不良的評估指標之一［32］。清除腫瘤組織中的TANs 浸潤，抑制機體的炎癥狀態(tài)有望成為抑制腫瘤進展的有效途徑。有研究發(fā)現(xiàn)，在氧化偶氮甲烷/右旋糖酐硫酸酯鈉（azoxymethane/dex?tran sodium sulfate，AOM/DSS）誘導的結腸炎相關結腸癌（colitis associated colorectal cancer，CAC）小鼠模型中，聚集在腫瘤組織中TANs 生成MMP-9 和NE的能力明顯增強，導致腫瘤組織過度的血管再生和細胞增殖。采用中性粒細胞中和抗體耗竭小鼠體內(nèi)的TANs 能顯著減少腫瘤的數(shù)量和大小，并逆轉(zhuǎn)腫瘤的發(fā)生［33］。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中浸潤的TANs 能夠產(chǎn)生大量IL-1β，后者誘導腸上皮細胞和單核細胞釋放IL-6 和IL-17，促進CAC 發(fā)展；將TANs 剔除后，CAC 的進展被顯著抑制［34-35］。以上提示，清除機體的TANs，控制腫瘤微環(huán)境的快速形成，減少局部組織異常炎癥反應，也是抑制腫瘤進展的一種有效途徑。然而，中性粒細胞是體內(nèi)最重要的先天性免疫細胞之一，目前的研究手段暫無法僅僅針對N2 型TANs 進行剔除。TANs 的剔除將從源頭上消除所有中性粒細胞的生物學功能，包括中性粒細胞機體防御功能及N1 型TANs 抗腫瘤功能等；中性粒細胞的缺失，也容易導致機體的免疫力低下。因此，體內(nèi)耗竭中性粒細胞療法目前僅停留于動物模型實驗。

2.4 增強TANs抗腫瘤能力 通過增加N1型TANs的數(shù)量和活性，增強TANs 抗腫瘤能力可能有助于腫瘤的治療。ERUSLANOV 等［36］直接將 N1 型 TANs與肺癌細胞共培養(yǎng)一段時間后發(fā)現(xiàn)，與未加入N1型TANs的肺癌細胞組相比，共培養(yǎng)組中腫瘤細胞數(shù)目明顯減少，表明增加的N1 型TANs 能夠顯著抑制腫瘤細胞的增殖能力。TANs 主要通過中性粒細胞的細胞毒作用發(fā)揮抗腫瘤特性。中性粒細胞含有大量的細胞毒介質(zhì)，包括活性氧（reactive oxygen spe?cies，ROS）、過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）以及可溶性細胞殺傷介質(zhì)，如 TNF-α、IL-1β 和干擾素（interferons，IFNs）等。這些細胞毒介質(zhì)可誘導腫瘤細胞凋亡、死亡和溶解。有學者發(fā)現(xiàn)在腫瘤發(fā)展的早期階段，TANs對腫瘤細胞表現(xiàn)出更強的細胞毒性作用，其可大量分泌一氧化氮（nitric oxide，NO）、H2O2、TNF-α及ROS等細胞毒介質(zhì)殺傷腫瘤細胞，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展；而在腫瘤發(fā)展的后期階段，TANs的這些功能被下調(diào)，其分泌的細胞毒介質(zhì)水平明顯下降，TANs 的促瘤表型占優(yōu)勢，導致腫瘤進展加速［37］。BLACHE等［38］在腫瘤組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量聚集的TANs 可產(chǎn)生大量ROS，同時伴隨著腫瘤細胞的明顯凋亡，提示TANs 產(chǎn)生的ROS 可誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。因此，增強TANs 的N1 型能力，刺激N1型TANs 活化并產(chǎn)生大量細胞毒介質(zhì)直接殺傷腫瘤細胞，可起到抑制腫瘤進展的作用。TAKESHIMAA等［39］發(fā)現(xiàn)，在腫瘤微環(huán)境中，放射誘導的中性粒細胞（RT-recruited tumor-associated neutrophils，RT-Ns）會產(chǎn)生更多的ROS 攻擊腫瘤細胞，其誘導腫瘤細胞凋亡的能力也明顯增強。另外，N1 型TANs 的抗腫瘤作用機制還包括抗體依賴的細胞毒性作用。抗體通過TANs 表面的Fc 受體（Fc receptor，F(xiàn)cR）識別腫瘤細胞抗原，誘導中性粒細胞釋放細胞毒介質(zhì)，發(fā)揮細胞毒性作用，從而殺傷腫瘤細胞［40］。因此，可以通過抗腫瘤單克隆抗體（mAbs）的應用，增強TANs 的ADCC 潛能。已有的研究發(fā)現(xiàn)，抗腫瘤融合抗體可進一步增強TANs的ADCC 作用［41］。例如，在中性粒細胞對表達表皮生長因子受體1（human epi?dermal growth factor receptor-1，HER1）和 HER2 腫瘤細胞的殺傷作用研究中，研究者發(fā)現(xiàn)相對于抗體的單獨使用，IgG 和IgA 融合抗體使中性粒細胞具有更強的細胞毒作用，能夠更有效地殺傷腫瘤細胞，抑制腫瘤的進展。

2.5 誘導極化中性粒細胞 除了增強N1 型TANs的抗腫瘤活性，誘導N2 型TANs 向N1 型轉(zhuǎn)化，使所有TANs 均發(fā)揮抗腫瘤作用，有望成為靶向TANs 治療腫瘤的最佳策略。鑒于TANs 的表型轉(zhuǎn)換主要受腫瘤微環(huán)境內(nèi)因子水平的影響，改變腫瘤微環(huán)境中的因子水平可能促進N2 型TANs 向N1 型轉(zhuǎn)化。SUN 等［42］研究發(fā)現(xiàn)，N2 型 TANs 在體外經(jīng) IFN-γ 和TNF-α 預激后，其能夠恢復為具殺瘤活性的N1 型，主要體現(xiàn)在TANs 的細胞毒作用和活化其他免疫細胞的能力顯著增強。IFN-β 也能夠誘導N2 型TANs向 N1 型轉(zhuǎn)化。ANDZINSKI 等［43］發(fā)現(xiàn)抑制 IFN-β 通路后黑色素瘤和纖維肉瘤組織內(nèi)N2型TANs浸潤數(shù)明顯增多，腫瘤細胞生長迅速，腫瘤組織內(nèi)血管新生明顯；而用 IFN-β 處理 TANs 后，小鼠血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及MMP-9 的表達水平明顯下降，小鼠的成瘤能力被顯著抑制。另有研究表明，腫瘤中的TGF-β 可促進N1型TANs 向促瘤型極化，而阻斷TGF-β 后能使TANs發(fā)揮抑瘤作用。在間皮瘤小鼠模型中，將小鼠體內(nèi)的TGF-β 下調(diào)后，腫瘤組織內(nèi)募集的TANs 對腫瘤細胞有較強的細胞毒性，并且表達較高水平的炎癥因子；另外CD8+T細胞也被顯著激活，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移［44］。小鼠肺癌模型研究進一步證實：當 TGF-β 通路激活時，中性粒細胞獲取 N2 表型，而阻斷TGF-β通路可誘導TANs獲取N1表型［44］。課題組在前期研究中也發(fā)現(xiàn)，采用TGF-β 抑制劑阻斷結直腸腫瘤中的TGF-β信號通路后，TANs的細胞毒作用明顯增強，其分泌的趨化因子水平下降，導致腫瘤細胞凋亡明顯，腫瘤細胞遷移能力減弱。在小鼠模型試驗中也觀察到TGF-β 信號通路的阻斷能顯著抑制腫瘤的進展［45］。值得一提的是，與同時進行TANs剔除的小鼠相比，僅僅抑制TGF-β信號通路的小鼠表現(xiàn)出更顯著的抑瘤效果。以上說明抑制TGF-β 通路可誘導 N2 型 TANs 向 N1 型轉(zhuǎn)化，抑制腫瘤的進展。此外，脂質(zhì)A能夠誘導TANs發(fā)揮抗腫瘤作用，與化療藥物奧沙利鉑聯(lián)用時可以更好地發(fā)揮抗腫瘤效應［46］。SHRESTHA 等［47］最近發(fā)現(xiàn)，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑的使用能夠誘導TANs 發(fā)揮抗腫瘤效應，從而抑制腫瘤生長。另有研究發(fā)現(xiàn)IL-35 能夠刺激機體產(chǎn)生大量IL-6和粒細胞集落刺激因子，后兩者可誘導TANs向N2極化并促進腫瘤生長［48］。因此，通過控制腫瘤微環(huán)境中IL-35 的表達，可在一定程度上抑制TANs向N2 轉(zhuǎn)化，達到控制腫瘤發(fā)生發(fā)展的目的。可見，誘導TANs 型別向抗腫瘤效應轉(zhuǎn)化，可為腫瘤的治療提供一種新的策略。

3 結語

TANs 在腫瘤中的作用目前已成為腫瘤學研究領域的熱點，如何利用好TANs 的兩面性將成為未來的一項嚴峻挑戰(zhàn)。目前靶向治療的方式多樣，但仍未取得顯著的臨床結果。如雖然大量體內(nèi)外研究證實阻斷MMP-9 在治療腫瘤中的良好效果，但Ⅲ期臨床試驗結果顯示晚期癌癥患者未能夠從應用MMP-9 抑制劑中獲益［26］。另外，目前的研究大多僅限于細胞學實驗及動物體內(nèi)試驗，尚缺乏對腫瘤患者進行臨床綜合研究。如高劑量ROS 的致癌性，TANs耗竭導致機體的免疫力低下等，都是從實驗研究跨度到臨床應用需要面對的重要問題。要利用TANs 兩面性進行腫瘤治療，必須充分明確TANs 在腫瘤微環(huán)境中的生物學活性和作用，更為全面地探索TANs 促瘤或抑瘤作用的途徑及機制。令人欣慰的是，一項關于黑色素瘤的臨床治療研究表明，Ⅰ型IFN 能夠使黑色素瘤內(nèi)的TANs 類型從N2 型向N1 型轉(zhuǎn)化，進而抑制腫瘤的進展，這為其他臨床治療研究提供基礎，也為后續(xù)的醫(yī)學轉(zhuǎn)化帶來了希望，從而使得基礎研究真正服務臨床［43］。