張建峰，王冠雄，黃 佳，姚宗沐，張潔婧

(吉林農業(yè)大學 生命科學學院,吉林 長春 130118)

磷是植物生長發(fā)育的必要元素之一[1],在植物生長過程中起著重要作用[2]。但是，植物對磷肥的利用效率僅為5%～25%[3]。磷肥的過量使用會導致土壤板結、植物根系生長受抑制、土壤中營養(yǎng)比例嚴重失調等不良結果。因此，提高磷肥使用效率對農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。溶磷微生物通過分泌有機酸或質子，降低土壤pH，將土壤中的難溶磷轉化為可溶性磷。大量研究表明，溶磷微生物不僅能將難溶性磷轉化為可溶性磷供植物利用，而且能分泌生長素促進植物生長[4-5]。Ahmad等[6]研究表明，溶磷菌株Q3和Q6使棉花幼苗芽長分別增加了71%和59%，根長增加了162%和136%，鮮質量分別增加了75%和87%。Ouahmane等[7]研究表明，溶磷菌株PH4使樟子松幼苗鮮質量增加了1.43倍。溶磷微生物數量約占土壤微生物總量的10%，其種類多樣[8]，包括細菌[9-10]、真菌[11-12]、放線菌[13-14]。大多數溶磷微生物只有在適應的環(huán)境條件下才會正常溶磷[15]，惡劣的自然環(huán)境條件會嚴重影響其代謝，從而降低其溶磷能力。Hueso等[16]和葉德練等[17]研究表明，干旱脅迫會影響微生物呼吸，從而影響其活性。目前抗旱能力強的溶磷菌株比較少見。林鳳蓮等[18]研究發(fā)現，大部分溶磷菌株的溶磷量均隨著干旱脅迫程度的加劇呈顯著下降趨勢，在重度干旱脅迫下,P6、P7和P25的溶磷量分別下降了74.96%，86.97%和44.43%?？梢姼珊得{迫會嚴重抑制溶磷菌的溶磷能力。土壤溫度也是影響土壤微生物生長最主要的因素[19]，不同的微生物群落有著其特定的溫度適應范圍。我國北方地區(qū)極端最低氣溫為―42 ℃，極端最高氣溫可達36.1 ℃[20]，溫度過低會使微生物減少或停止正常的代謝活動，而溫度過高會破壞微生物呼吸酶導致微生物不能正常生長[21]。鞏文峰等[22]研究表明，溶磷菌株PSB19在10 ℃的低溫條件下生長良好。李鳴曉等[23]研究表明，在50 ℃下培養(yǎng)溶磷菌株P1～P5 7 d后，其溶磷量為30.9～47.6 mg/L。目前報道的溫度適應性好、耐干旱的溶磷菌株較少，且多為細菌，尚未見溶磷真菌的相關報道，因此篩選一株抗旱能力強且溫度適應性好的溶磷真菌具有重要意義。本課題組前期從吉林西部鹽堿土壤中分離鑒定出一株繩狀青霉菌P1，該菌在適宜溫度下溶磷能力很強，可以達到1 120.52 mg/L(目前溶磷能力較強的微生物的溶磷量為900～1 100 mg/L)。為了探討繩狀青霉菌P1對植物生長的作用及干旱和溫度脅迫對其溶磷能力的影響，本試驗研究了其對綠豆種子萌發(fā)的影響及其在不同溫度和模擬干旱脅迫下的生物量、溶磷量以及發(fā)酵液pH，以期為生物磷肥的研制提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：繩狀青霉菌(Penicilliumfunicuiosum)P1，篩選自長春市農安縣西的鹽堿土壤，為吉林農業(yè)大學秸稈生物學與利用教育部重點實驗室―80 ℃冰箱中保存菌種。綠豆種子為中綠一號，購買于湖北省宜昌市民源種子專營店。

種子培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH自然。NBRIP培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，Ca3(PO4)27 g，蒸餾水1 L，pH 8。

1.2 P1對綠豆種子萌發(fā)的影響

綠豆種子用質量分數2%次氯酸鈉溶液消毒1 min，然后用蒸餾水沖洗5次。P1在PDA培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)72 h，用無菌水制成孢子懸液(1×104CFU/mL)。將綠豆種子用沾蘸法沾P1菌懸液5 s，置于鋪有2層濕濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，保持水的高度在種子的1/2處，以無菌水處理種子做對照，每處理重復3次，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，相對濕度為85%，記錄綠豆種子的發(fā)芽率、根長、芽長、鮮質量、干質量、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數和活力指數。具體計算公式[24]為：發(fā)芽率(r)=N4/N×100%，其中N4為處理4 d內發(fā)芽的種子粒數，N為供試種子數；發(fā)芽勢(p)=N3/N×100%，其中N3為處理3 d內發(fā)芽的種子粒數；發(fā)芽指數=∑(Gt/Dt)，其中Gt為每天發(fā)芽種子數，Dt為發(fā)芽時間?；盍χ笖?第4天幼苗鮮質量×發(fā)芽指數。

1.3 干旱脅迫下P1的溶磷能力測定

種子懸液的制備:將保存的P1菌種在PDA固體培養(yǎng)基上進行活化，培養(yǎng)72 h后制成孢子懸液(1×108CFU/mL)。向NBRIP培養(yǎng)基中加入聚乙二醇6000(polyethylene glycol，PEG)，制成極輕度(50 g/L PEG)、輕度(100 g/L PEG)、中度(200 g/L PEG)和重度(300 g/L PEG)干旱脅迫培養(yǎng)基[18]。取2 mL種子懸液分別接入到盛有100 mL NBRIP培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，同時設定不接種處理為對照(CK)，于搖床中振蕩培養(yǎng)(28 ℃，160 r/min)，每處理3個重復。分別在培養(yǎng)的0，1，2，3，5，7，9，11，13 d測量溶磷量、pH、P1生物量。pH用酸堿度檢測儀在室溫(25 ℃)下測定。P1生物量測定前，向三角瓶中添加稀鹽酸將剩余磷酸鈣完全溶解，蒸餾水洗滌3次后再用真空抽濾機過濾，烘干稱質量。取4 mL菌液于12 000 r/min離心5 min，上清液用鉬藍比色法測定磷含量。

1.4 溫度脅迫下P1的溶磷能力測定

P1種子懸液的制備同1.3節(jié)。取2 mL P1種子懸液分別接入到盛有100 mL NBRIP培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，同時設定不接種處理為對照，分別于5，10，12，15，20，25，28，35，40 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)(160 r/min)，每處理3個重復。分別在培養(yǎng)的1，2，3，5，7，9，11，13，15，17 d測量溶磷量、pH、P1生物量，測定方法見1.3節(jié)。

1.5 數據處理

試驗數據用“平均值±標準誤”表示，采用Excel進行統(tǒng)計，采用Origin 8.0制圖。

2 結果與分析

2.1 P1對綠豆種子萌發(fā)的影響

由表1可知，P1菌懸液對綠豆種子萌發(fā)有明顯的促進作用；與CK相比，P1菌懸液使綠豆幼苗的芽長和發(fā)芽率分別極顯著增長了149.14%和86.67%，綠豆幼苗的根長和鮮質量分別顯著增長了50.21%和44.44%；與CK相比，P1菌懸液使綠豆幼苗的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數和活力指數分別極顯著提高了95.33%，132.28%和237.25%；P1菌懸液處理與CK的干質量無顯著性差異(P>0.05)。

表1 繩狀青霉菌P1對綠豆種子萌發(fā)的影響

2.2 干旱脅迫對P1溶磷能力的影響

由圖1可知，隨著干旱程度的加劇，P1生物量下降，導致其最大溶磷能力逐漸降低。但是，P1溶解磷酸鈣的能力依然很強，在重度干旱脅迫下的溶磷能力仍可達418.85 mg/L。在培養(yǎng)前5 d內，干旱脅迫處理的溶磷量大于對照，這可能是受干旱脅迫的影響，P1的產酸能力在生長初期增強，故其溶磷能力隨干旱脅迫的增強而增大。

圖1 干旱脅迫對繩狀青霉菌P1溶磷能力的影響

2.3 培養(yǎng)溫度對P1溶磷能力的影響

由表2和表3可知，P1在10～35 ℃下均能夠生長，并具有溶磷能力，且在28 ℃時生物量最大，溶磷量在7 d后達到平臺期，最大溶磷量可達1 120.52 mg/L。當培養(yǎng)溫度低于28 ℃時，P1生物量和溶磷量均明顯下降，并且進入平臺期的時間點會后移，分析可能是由于溫度低導致P1生長速率變慢，致使產酸速率降低，導致溶磷量下降。如表2，P1在10，12，15，20和25 ℃時在11 d后達到平臺期，最高溶磷量分別為34.67，59.62，493.92，1 082.90和1 092.58 mg/L。當培養(yǎng)溫度高于28 ℃時，P1的生物量和溶磷量也明顯降低，P1在35 ℃時，最高溶磷量為364.97 mg/L，但最大溶磷量和生物量出現的時間點會前移，這與高溫增加了微生物的生長速率，導致產酸速率提高有關。由此可見，溫度低于或高于28 ℃時都會影響P1的溶磷能力。

表3 培養(yǎng)溫度對繩狀青霉菌P1生物量的影響

由表2～4可知，P1的溶磷能力與pH呈負相關關系，與生物量基本呈正相關關系，這說明生物量的累積會增加P1分泌有機酸或質子的數量從而促進溶磷，也進一步說明產酸是P1溶解磷酸鹽的主要原因。

表2 培養(yǎng)溫度對繩狀青霉菌P1溶磷量的影響

表4 培養(yǎng)溫度對繩狀青霉菌P1 pH的影響

3 討 論

種子萌發(fā)是植物生命周期中最關鍵的階段之一，研究表明根際促生菌(PGPR)可促進種子萌發(fā)[25]。Yoo[26]研究表明，蘿卜種子接種A.chroococcum孢子懸浮液(1×107CFU/mL)培養(yǎng)4 d后，與未接種對比，芽長提高了20 mm，根長提高了28 mm，發(fā)芽率提高了41.67%。Delgado-Sánchez等[27]的研究表明，真菌的孢子懸液有助于打破種子休眠期而提升發(fā)芽率。Zhao等[28]研究發(fā)現，接種HPP16菌懸液的綠豆發(fā)芽率比CK提高了35.48%。本研究中，P1對綠豆種子萌發(fā)的促生作用明顯優(yōu)于HPP16。菌株P1的菌懸液對綠豆種子萌發(fā)有較好的促生效果，可能是其菌懸液在接種至綠豆種子的4 d內，孢子萌發(fā)形成菌絲體，菌絲體釋放生長素(IAA和鐵載體)，促進了綠豆種子萌發(fā)。但是，大多數溶磷微生物只有在適宜的環(huán)境條件下才會正常溶磷[29]，惡劣的自然環(huán)境條件會嚴重影響微生物的代謝，從而影響其功能。P1如果具有良好的環(huán)境適應性，將是一株非常有潛力應用于農業(yè)生產的溶磷菌。因此，后續(xù)試驗應對P1的環(huán)境適應能力進行研究。

干旱脅迫會嚴重影響微生物呼吸、生長和活性[16-17]。在本研究中，隨著干旱程度的加劇，P1的最大溶磷能力逐漸降低，這與林鳳蓮等[18]的研究結果相似，但P1在重度干旱脅迫下的溶磷量仍然可達418.85 mg/L，是文獻[18]中菌株P8和P19溶磷量的3倍多。

溫度是影響微生物活性的重要因素，低溫會對細胞膜、酶活性及DNA復制和細胞結構造成嚴重的破壞[30]。同樣，溫度過高酶會失去活性，使代謝發(fā)生障礙。因此篩選一株對溫度適應性強的溶磷菌株在農業(yè)生產中有重大意義。鞏文峰等[22]研究表明，溶磷菌株PSB19在4～30 ℃的條件下均能生長，但在20 ℃以下生長有所延遲。P1在10～35 ℃的條件下均能生長，在20 ℃以下生長延遲且生物量低，這是因為隨著溫度的降低,微生物細胞內的酶活性下降，使得代謝過程中各種生化反應速度減慢，破壞了生化反應的協(xié)調性，導致微生物的繁殖速度減慢[21]。但P1的解磷能力與同類菌相比仍然較高，梁艷瓊等[31]的研究結果表明，黑曲霉PSFM在34 ℃下培養(yǎng)6 d后，發(fā)酵液中溶磷量達到317.45 mg/L，而菌株P1在35 ℃時溶磷量可達364.97 mg/L。

4 結 論

繩狀青霉菌P1對綠豆種子萌發(fā)有良好的促生效果，使綠豆幼苗的芽長和根長分別增長了149.14%和50.21%，使發(fā)芽率提高了86.67%，種子活力指數提升了237.25%。P1在干旱脅迫下仍具有很強的溶磷能力，在重度干旱脅迫下溶磷量可達418.85 mg/L。P1在10～35 ℃的條件下均能生長且具備溶磷能力，10 ℃時溶磷量可達34.67 mg/L，35 ℃時溶磷量可達364.97 mg/L。由此可見，繩狀青霉P1是一株對環(huán)境適應性較好且能促進植物生長的菌株，是制備微生物菌肥的良好菌種。