韓俊源*,李亞娟*,王海學,王全軍
(1.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所,抗毒物藥物與毒理學國家重點實驗室,國家北京藥物安全評價研究中心,北京100850;2.國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心,北京100022)
蛋白降解靶向嵌合體(proteolysis-targeting chimeras,PROTAC)是將靶向蛋白募集到E3 泛素連接酶進行泛素化標記,然后通過泛素-蛋白酶體途徑將其降解的新型藥物分子。PROTAC 分子的發(fā)展經(jīng)歷了從第一代基于多肽片段的PROTAC 設計到2008 年開始的第二代小分子PROTAC 設計[1]。降解的靶蛋白從最早的甲硫氨酰氨肽酶、雄激素受體和細胞視黃酸結合蛋白等[2-3]發(fā)展到最近的雌激素受體、tau 微管相關蛋白和激酶類等[4-6]。目前涉及的疾病包括癌癥、類風濕和神經(jīng)退行性疾病等[6-7]?;谄渥饔脵C制,PROTAC 在消除轉錄因子和非酶蛋白質等未成藥蛋白靶標方面具有巨大潛力。然而,PROTAC 藥物對正常功能性蛋白的非選擇性降解及其穩(wěn)定性和血管穿透能力差等,決定了其非臨床評價研究不容忽視。目前對于PROTAC藥物的研究,重點在于強調藥物設計和作用機制,對其非臨床評價研究的報道很少。PROTAC藥物的研發(fā)的關注點之一就是藥物的安全性問題。做好非臨床安全性評價,有助于更全面地預測臨床安全性,更好地推動其進入臨床研究,最終用于人體疾病治療。本文對PROTAC藥物的發(fā)展歷程以及其優(yōu)缺點進行概述,重點對PROTAC藥物的非臨床評價策略進行詳細分析,以期為PROTAC藥物的研發(fā)提供參考。
2004 年諾貝爾化學獎授予了以色列科學家Aaron Ciechanover,Avram Hershko 和美國科學家Irwin Rose,以表彰他們共同發(fā)現(xiàn)了細胞是如何摧毀有害蛋白質的,即泛素調節(jié)的蛋白質降解過程。利用泛素調節(jié)蛋白質降解這一機制,Crews 和Deshaies 課題組在2001 年最早提出了PROTAC這個概念[8]。最初,PROTAC 只是被作為一種學術活動或如CREWS 所說是一種“可愛的化學珍品”。之后,經(jīng)過將近20 年的發(fā)展,PROTAC 被認為是一種新的藥物發(fā)現(xiàn)模式并可能會成為重磅炸彈療法[9]。PROTAC 是一種異雙功能小分子,由3 部分構成,中間的連接體(linker)一端連接目標蛋白的抑制劑(結合靶蛋白的配體),另一端連接E3 泛素連接酶的結合配體分子[10-11]。PROTAC 將靶向蛋白募集到E3 泛素連接酶進行泛素化標記,然后通過泛素-蛋白酶體途徑將其降解。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的正常生理功能是清除細胞中變性、突變或有害的蛋白質[12]。PROTAC 是一種全新的藥物設計策略,通過設計這樣的三聯(lián)體藥物,理論上可以將任何過表達和突變的致病蛋白清除,從而治療疾病。
2001 年,Crews 和Deshaies 課題組利用與泛素連接酶E3 體系S 期激酶相關蛋白1-cullin-F 盒蛋白〔S-phase kinase-associated protein 1(Skp1)-cullin-F-box protein,SCF〕結合的10 肽,加上甲硫氨 酰 氨 肽 酶2(methionine aminopeptidase 2,MetAP2)的共價抑制劑ovalicin(天然產(chǎn)物),設計并合成了首個用于降解MetAP2 的PROTAC-1[8]。蛋白試驗驗證了PROTAC-1 可快速降解MetAP2,但由于使用的10 肽上有磷酸化的絲氨酸,導致PROTAC 分子無法透過細胞膜。為解決這個問題,研究者發(fā)現(xiàn)一個7 肽ALAPYIP 鏈接上一個D-精氨酸多聚體,可以使PROTAC成功透過細胞膜,且不被非特異性蛋白酶水解[13]。在這個PROTAC分子中,用ALAPYIP取代抑制性核因子κBα(inhibitor kappa B alpha,IκBα)-磷酸肽組分,是一個人工配體共軛AP21998 靶標(F36V)FKBP12 蛋白質。這種能透過細胞膜的PROTAC 已被證明可以在細胞中破壞其靶蛋白。在穩(wěn)定表達增強型綠色熒光蛋白-(F36V)FKBP12 的HeLa 細胞中,加入PROTAC靶向的(F36V)FKBP12,觀察到綠色熒光減弱。Western 印跡法也證實,PROTAC 導致(F36V)FK?BP12 發(fā)生降解。細胞滲透PROTAC 的發(fā)展,為靶向體內致病蛋白提供了可能,在細胞生物學特別是藥物開發(fā)中的應用展現(xiàn)出前景。2008 年以前的PROTAC 均使用了多肽,雖然已經(jīng)可透過細胞膜,但多肽PROTAC本身相對分子質量較大且肽鍵不穩(wěn)定,導致合成、純化和穩(wěn)定性方面的諸多問題。為克服這一系列問題,研究者采用“全小分子”的PROTAC設計。全小分子PROTAC通過小分子配體去募集目標蛋白和E3泛素連接酶,快速靶向降解蛋白,有更好的細胞滲透性。芐林環(huán)連接酶(culin-ring ligase,CRL)E3 泛素連接酶復合物〔如鼠雙微體蛋白2(murine double minute 2,MDM2)、細胞凋亡抑制蛋白1(cellular inhibitor of apoptosis protein 1,cIAP1)、重組小腦蛋白和VHL〕和與一些E3泛素連接酶或基質受體蛋白結合的多種小分子已用于PROTAC開發(fā)。
以磷酸化酪氨酸結構域(phosphorylated tyro?sine binding,PTB)或非受體酪氨酸激酶同源結構域(Src homology 2,SH2)的招募蛋白為降解靶標,可使酪氨酸激酶信號通路失活,從而抑制腫瘤細胞增殖?;谶@一理念,有研究者開發(fā)了一種磷酸化依 賴 的PROTAC(phosphoPROTAC)[14]。phos?phoPROTAC 通過靶向下游效應蛋白降解,從而使受體酪氨酸激酶信號通路激活,而對正常細胞的毒性非常低,因為它通常只抑制發(fā)生在癌細胞中的受體酪氨酸激酶信號的激活。依靠酪氨酸激酶相互結合,磷酸化多肽PROTAC可降解不同信號轉導途徑的靶蛋白,在“無成藥性”(undruggable)靶蛋白的藥物設計領域有所突破。另外,HEIGHTMAN 小組[15]開發(fā)了一種名為CLIPTAC的先進PROTAC技術。CLIPTACS 是由2 個小前體分子在細胞內組裝成的PROTAC,該技術實際上是基于重組小腦蛋白的PROTAC,由四苯標記的沙利多米德衍生物(Tz-thalidomide)的快速反應形成,在細胞中具有跨環(huán)環(huán)-八烯標記的配體。此CLIPTAC 可以同時招募靶蛋白和E3 連接酶重組小腦蛋白,促進目標蛋白的蛋白酶體降解。2 個獨立的小前體分子能夠自組裝,在細胞中形成功能性PROTAC,因為其相對分子質量更小而具有更好的滲透性。
2013 年,Crews 創(chuàng)立了生物技術初創(chuàng)公司ARVINAS,為臨床應用開發(fā)PROTAC技術。2017年,ARVINAS 選擇了用于治療前列腺癌的雄激素受體PROTAC和乳腺癌的雌激素受體PROTAC 作為首批臨床試驗候選藥物[16-17]。ARV-110 是ARVINAS臨床評估的第一個PROTAC蛋白降解劑。目前,在轉移性抗性前列腺癌患者中,ARV-110 已經(jīng)完成第一階段的臨床試驗。結果顯示,35,70和140 mg劑量組耐受均良好,無劑量限制毒性,也未觀察到2,3或4級相關不良事件[18]。
目前,小分子抑制劑是靶向細胞內蛋白的主要治療手段。然而小分子抑制劑有比較明顯的局限性,其靶蛋白通常是具有囊泡或者活性位點的酶和受體,這就導致占人類蛋白組活性位點約75%的轉錄因子、支架蛋白和非酶蛋白在小分子抑制劑中無成藥性[19]。此外,小分子抑制劑持續(xù)的高全身藥物水平來維持足夠的細胞內藥物濃度達到治療效果,這往往會使小分子抑制劑由于其競爭的特性導致脫靶效應和不良反應。這些限制嚴重阻礙了小分子抑制劑的開發(fā)和臨床使用。
PROTAC 是一種利用蛋白酶水解靶向嵌合體的蛋白質降解策略。將目標蛋白質募集到E3 泛素連接酶進行泛素化標記,然后由蛋白酶體介導降解。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的正常生理功能是清除細胞中變性、突變或有害的蛋白質。通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)破壞致病蛋白,而不是使用傳統(tǒng)的小分子抑制劑抑制它們,從而提供了更有效的策略[20]。許多研究表明,降解蛋白質比抑制蛋白質具有更好的抗癌活性[21]。PROTAC 藥物的一個關鍵優(yōu)勢是可降解“無成藥性”靶蛋白。
此外,理論上PROTAC只需少量的催化藥物即可降解細胞內幾乎所有的蛋白質(包括膜蛋白),因此其具有廣闊的應用前景。
盡管目前研究者已采用全小分子的PROTAC設計策略,但其相對分子質量高導致的水溶性、口服吸收和透膜性均較差,同時PROTAC藥物的化學合成成本也較高。同時,必須意識到目標蛋白可能在其他正常生理活動中發(fā)揮作用,如果PROTAC藥物不能區(qū)分正常和病理組織,那必將會引起程度不等的不良反應。
另外,PROTAC 藥物的脫靶毒性更值得關注,因為泛素化標記不僅涉及到蛋白質降解,還關系到甲基化、乙?;土姿峄冗^程;不僅涉及蛋白質,還涉及到DNA。就像沙利度胺對胎兒的致畸性一樣,其脫靶效應在非臨床毒性篩選中不易檢測和跟蹤,其長期和生殖毒性是一個嚴峻的問題。
全小分子設計的PROTAC 藥物與傳統(tǒng)小分子藥物在體內的行為類似,非臨床安全性評價可以參考傳統(tǒng)小分子藥物進行,但研究過程中還需針對PROTAC 的特性而對實驗設計進行調整和優(yōu)化。結構中含多肽的大分子PROTAC 藥物的非臨床安全性評價,可以沿用多肽或抗體的評價思路進行。
PROTAC 是事件驅動,而小分子抑制劑和抗體藥物是占位驅動[22]。占位驅動是經(jīng)典受體藥理學的一個標志,需要高藥物濃度以保持目標占用水平,提供足夠的臨床療效。然而,藥物濃度高也與脫靶效應有關,可通過具有高特異性和良好的藥動學特性的藥物來降低脫靶效應。相反,PROTAC 具有催化作用,因此能夠在較低含量催化誘導蛋白酶體降解靶標[23]。
離體細胞水平已證實一些蛋白,如雄激素受體、雌激素受體、雌激素相關受體α 和溴結構域蛋白4,已可通過PROTAC 靶向破壞[23-27]。在體藥效研究中,PROTAC 藥物的非臨床評價首先需要確定種屬,即建立能夠表達PROTAC藥物靶蛋白的動物模型。如果PROTAC藥物的靶點僅在人體內表達,可通過開展替代分子在體藥效研究進行驗證;其次,動物藥效模型需盡量選用能反映疾病發(fā)病機制的模型,即應為致病蛋白(PROTAC 的靶蛋白)引起的疾病模型,才能更準確地模擬相應的疾病,驗證PROTAC的藥效;同時,藥效研究需要設置不同的給藥劑量對量效關系進行驗證。藥效除觀察指標外,應盡量選擇合適的藥效標志物,如通過Western 印跡法等對目標(致病)蛋白的表達量進行測定,以驗證PROTAC藥物對靶點的選擇性。
此外,由于PROTAC在藥動學方面與經(jīng)典的抑制劑不同,高濃度時經(jīng)常會觀察到“HOOK 效應”[28]。在高濃度情況下形成的PROTAC∶E3 連接酶和PROTAC∶POI 二元復合物,可阻礙靶蛋白降解所必需的三元復合物的形成。因此,藥效實驗要結合藥動學/藥效學參數(shù)設置給藥劑量,避免二元復合物的形成,制定合理的給藥方案。
PROTAC 分子必須與靶點蛋白和E3 泛素連接酶形成有效的三元復合物,才能實現(xiàn)靶蛋白降解的特性。因此,只有成功透過細胞膜進入細胞的PROTAC 才具有成藥性[22]。一旦進入細胞內,蛋白質降解分子必須同時與目標蛋白和E3 泛素連接酶形成三元復合物,避免形成二元復合物。三元復合物一旦形成,泛素必須以足夠的速率(快于三元復合物的本征壽命)轉移到靶蛋白受體位點上(通常是表面賴氨酸),所需底物的誘導泛素化也應以同樣的速率進行,以避免由二氫奎素酶競爭性去除泛素。最后,泛素轉移到底物蛋白上的模式應允許蛋白酶體容易識別,從而開始實際降解[30-32]。因此,在代謝研究中除關注PROTAC 藥物本身的藥動學特性外,還需要重點關注三元復合物的形成和穩(wěn)定性問題。如果是由小前體分子在細胞內組裝成的PROTAC 的前藥,還要關注起藥效作用的“組裝產(chǎn)物”及其代謝產(chǎn)物的藥動學特性。
生物利用度低、穩(wěn)定性和血管穿透能力差是PROTAC應用受限的主要原因,因此在代謝研究中首先要通過質譜確定體內外代謝產(chǎn)物的種類和結構,包括是否存在二元復合物以及游離個體,弄清藥物進入體內后的代謝途徑。在PROTAC 藥物的動物種屬選擇上,需要考慮靶蛋白在各動物種屬中的表達情況,需選取蛋白表達情況與人類相近的動物為相關種屬;進一步的動物種屬選擇可參考小分子藥物的種屬選擇方案,通過體外肝微粒體和肝細胞代謝實驗,確定不同種屬中代謝產(chǎn)物種類和比例,為種屬選擇以及毒理試驗中需要監(jiān)測的代謝產(chǎn)物提供參考依據(jù)。代謝研究需要藥物對肝代謝酶的鑒定以及對代謝酶的誘導和抑制作用,為臨床上藥物的相互作用提供參考。此外,基于PROTAC本身的作用特點,在代謝研究中需要關注藥物與血漿蛋白結合的問題。綜上所述,在進行代謝研究時,建議小分子PROTAC 進行的實驗包括不同動物種屬體外肝微粒體和肝細胞代謝產(chǎn)物鑒定和穩(wěn)定性實驗,最好加做不同種屬體內血漿中代謝產(chǎn)物的鑒定實驗、CYP 酶亞型鑒定實驗、CYP 酶誘導和抑制實驗,血漿蛋白結合實驗、血漿穩(wěn)定性實驗和相關種屬的體內藥動學、組織分布和排泄實驗。
PROTAC 的相對分子質量范圍一般為70~1000,與傳統(tǒng)小分子藥物相比,較大的相對分子質量使PROTAC 口服吸收更具挑戰(zhàn)性。但一旦被吸收,PROTAC 與傳統(tǒng)小分子藥物在體內的循環(huán)無差異。經(jīng)靜脈、腹腔或皮下注射PROTAC,其在體內表現(xiàn)出與傳統(tǒng)小分子藥物相似的代謝特點,暴露量與給藥劑量相關,優(yōu)化的PROTAC會有較低的肝清除率。另外,對于結構中含有多肽的大分子PROTAC藥物,需參考大分子藥物代謝研究程序,并且需對藥物的免疫原性進行驗證。
PROTAC藥物安全性問題除需要考慮藥物整體的安全性外,還需確定藥物進入體內后PROTAC的連接子是否會斷裂,組成藥物的3 個部分是否會分離,繼而需要考慮各部分單獨的安全性隱患。在毒理研究中,針對PROTAC的穩(wěn)定性、生物分布和血管穿透能力差的特性,要充分考慮其代謝產(chǎn)物和(或)形成的復合物的毒性,及其因蓄積引起的臟器損傷問題。
安全性評價研究需進行一般毒理、安全藥理、遺傳毒理和生殖毒理等研究?;赑ROTAC 藥物的作用機制特點,劑量-毒性反應關系可能有別于傳統(tǒng)的小分子藥物,所以在進行實驗的劑量選擇時,需進行充分的預實驗探索,最終確定起效劑量與毒性反應劑量之間的關系。
PROTAC 藥物的安全性評價中,動物種屬的選擇與其他藥物相同,需要首先確定藥物的相關種屬。但針對PROTAC的特殊性,首先需要考慮動物種屬中靶蛋白的表達情況,優(yōu)先選取蛋白表達與人類相似的動物為相關種屬。進一步的動物種屬選擇中全小分子PROTAC 藥物可參考小分子藥物的種屬選擇方案,依據(jù)代謝產(chǎn)物研究的結果來確定;結構中含有多肽的大分子PROTAC藥物,可參考多肽或抗體藥物的安全性評價思路,使用多種技術(如免疫化學或功能活性評估)確定相關種屬[33];選取藥物代謝與人類更為相似的動物種屬進行安全性評價。
全小分子的PROTAC 藥物的劑量選擇可參照小分子藥物的實驗設計思路,從單次給藥劑量遞增實驗到不同劑量連續(xù)給藥實驗,確定正式實驗的給藥劑量。建議正式實驗時根據(jù)前期的結果最少設置3 個給藥劑量,以確定劑量-毒性反應關系。由于PROTAC 通過在亞化學計量的水平上催化誘導蛋白酶體降解靶標而起到藥效作用,理論上其藥效劑量相當于催化劑的量。所以在安全性評價尤其是安全藥理研究中,在設計實驗的低劑量時應充分考慮與藥效劑量之間的關系。劑量選擇不宜過高,與藥效劑量相當或稍高于藥效劑量即可。同時,基于使用高濃度PROTAC 時會觀察到“HOOK 效應”這一特性,在實驗過程中PROTAC很可能會達到暴露量飽和的情況。但在非臨床安全性評價研究中,建議在飽和時觀察到的毒性反應嚴重程度較輕時,繼續(xù)適當升高劑量或達到適當?shù)南拗苿┝?,在監(jiān)測藥物暴露量的基礎上,觀察在“HOOK 效應”形成二元復合物的情況下,藥物潛在的毒性反應,以更好地指導臨床安全性研究。針對大分子的PROTAC 藥物,劑量選擇也應能提供反映劑量-反應關系的信息,包括毒性劑量和未見不良反應劑量(no observed adverse effect level,NOAEL);對于某些毒性很小或無毒性的產(chǎn)品,可能無法規(guī)定一個特定的最大給藥劑量。在此情況下,應提供劑量選擇依據(jù)及其預計的人體暴露量倍數(shù)。選擇高劑量時,應該考慮其預期的藥理和生理作用、合適受試物的可獲得性及預期的臨床應用[28]。
PROTAC 藥物的非臨床安全性評價重復給藥實驗的給藥周期,需結合臨床試驗以及藥物上市后治療期限進行綜合考慮,實驗的給藥周期需長于藥物的治療期限以支持臨床試驗或藥物上市(參考ICH M3的要求進行)。臨床試驗最長期限≤2周的藥物,重復給藥實驗最短期限為2周;6個月的嚙齒類動物實驗和9個月的非嚙齒類動物實驗通??芍С纸o藥期限≥6個月的臨床試驗[34]。同時,在一般毒理試驗中,需要設置足夠長時間的恢復期,以考察停藥后不良反應的恢復情況。給藥頻率根據(jù)藥物的藥效/藥代參數(shù)和臨床擬用頻率進行設計,試驗中的給藥頻率需≥臨床的給藥頻率。
在進行PROTAC藥物安全性評價時,基于其獨特的化學結構,除需要考慮藥物整體的安全性外,也需要考慮各組分的潛在毒性問題。首先確定分子在不同動物種屬內連接斷開及其代謝情況,測定游離狀態(tài)各組分及其代謝產(chǎn)物的占比。在安全性評價過程中,如果人體中游離狀態(tài)的組分及其代謝產(chǎn)物的暴露量超過動物中的暴露量時,需要單獨對游離組分或其代謝產(chǎn)物進行非臨床評價。
PROTAC 藥物的安全性評價試驗的檢測項目及指標可參照常規(guī)藥物的檢測進行,在一般毒理試驗中主要需包括臨床觀察、攝食量、體重、眼科檢查、體溫(僅非嚙齒類)、血壓和心電圖檢查(僅非嚙齒類)、血液學和血液生化學檢測、尿液觀察和分析、大體剖檢和組織病理學檢查等;安全藥理試驗需要對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的功能進行研究,同時針對可能存在引起人體其他系統(tǒng)擔憂的特定PROTAC藥物,需根據(jù)具體情況進行安全藥理學的補充試驗(如腎/泌尿系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸道系統(tǒng)等)[35];遺傳毒理試驗中,除需要將PROTAC 當作一個整體,通過體外和體內遺傳毒性試驗組合的方法進行遺傳毒性的研究外,針對在體內會發(fā)生連接斷開和代謝的PROTAC藥物,還需要對游離各組分進行遺傳毒性的檢測;生殖毒性試驗針對臨床用藥人群,在適當?shù)臅r候分階段進行,可在其他藥理和毒理試驗已獲得部分結果后,參考有關潛在生殖毒性信息的基礎上開展研究[36];重復給藥試驗的伴隨毒代檢測至關重要,可以通過暴露量作為風險控制的重要依據(jù),PROTAC 藥物除需要監(jiān)測母藥的暴露量外,還需結合不同種屬中代謝產(chǎn)物鑒定的結果,對可能存在的表達量較高的游離組分、形成的復合物以及代謝物進行監(jiān)測;大分子的PROTAC 藥物需要同時進行免疫原性評估,以及監(jiān)測是否有抗藥抗體的產(chǎn)生。
脫靶毒性是業(yè)界最為關注的問題之一。傳統(tǒng)靶向蛋白活性的大分子和小分子藥物,甚至小核苷酸,對蛋白活性的抑制一般不會太徹底,多不影響骨架蛋白的表達,這樣雖然增加了耐藥性發(fā)生的概率,但殘留活性也可能保障正常細胞、組織器官基本的生理活性,降低潛在毒性。PROTAC 降解靶標更為徹底,即使是以前驗證過的靶點,會不會帶來嚴重的毒性需要進行確證。脫靶效應在毒性篩選中不易檢測和跟蹤,增加了后期開發(fā)的風險。因此,在非臨床安全性評價研究中應對PROTAC的脫靶毒性進行重點關注。
迄今為止,PROTAC 技術已被應用于不同的靶點,從蛋白酶到核激素受體、表觀遺傳因子和激酶等。PROTAC 技術在不可成藥靶點的應用,有望解決目前80%蛋白因無可作用靶點而缺少調控的現(xiàn)狀,是未來可進一步研究和探索的內容。盡管PROTAC 技術從肽到全小分子有了顯著的提升,穩(wěn)定性、溶解度、血管穿透能力和組織分布得到了一定程度的改善,但與傳統(tǒng)的小分子藥物相比,以上問題依然是非臨床研究所面臨的難題。改進PROTAC 的藥動學、生物利用度和組織分布,進一步降低相對分子質量和毒性,需今后進一步研究。