曹 陽， 陳 薇

病原微生物對抗菌藥物耐藥性的日趨增高是對全球人類健康的主要威脅，而對其快速檢測、定量分析及結(jié)合抗菌藥物管理，是控制耐藥性出現(xiàn)和傳播的關(guān)鍵干預(yù)措施。但目前臨床微生物工作中使用更多的還是表型抗菌藥物敏感性檢測（antibiotic susceptibility testing，AST），多為肉湯微量稀釋法、紙片法等。這些方法需要較長的孵育時(shí)間，不能及時(shí)指導(dǎo)抗感染治療。近年來開發(fā)了一些新型的技術(shù)應(yīng)用于耐藥菌檢測，現(xiàn)將相關(guān)的新興檢測技術(shù)綜述如下。

1 分子生物學(xué)技術(shù)在耐藥性檢測中的應(yīng)用

1.1 耐藥基因核酸檢測

現(xiàn)有多種新型耐藥性檢測的分子生物學(xué)方法，如核酸探針微陣列[1]，等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)[2]，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物高分辨率熔解曲線分析，以及將菌種鑒定、熔解曲線和機(jī)器學(xué)習(xí)（machine learning technique）相結(jié)合的方法[3]?；诤怂釘U(kuò)增技術(shù)的耐藥基因檢測方法可以縮短報(bào)告時(shí)間，早期進(jìn)行抗菌藥物調(diào)整進(jìn)行靶向治療。有許多商品化儀器如全自動(dòng)檢測分析系統(tǒng)GeneXpert利用PCR技術(shù)可檢測mecA和/或mecC基因，該系統(tǒng)還可以檢測萬古霉素耐藥基因vanA和vanB以及針對直腸拭子中碳青霉烯類耐藥基因KPC、NDM、VIM、OXA48 和IMP的篩查[4-6]，GeneXpert系統(tǒng)高度整合樣品制備、擴(kuò)增及檢測于一個(gè)獨(dú)立的試劑盒中，并將其自動(dòng)化，只需很少的人工操作，但受熒光通道限制，通常只能同時(shí)報(bào)告2～6種靶標(biāo)。近年來，數(shù)種新的多重?cái)U(kuò)增檢測系統(tǒng)可以同時(shí)進(jìn)行菌種的鑒定和耐藥基因的檢測。BioFire公司的 FilmArray BCID 檢測系統(tǒng)采用巢式多重PCR的原理，將核酸提取、PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測集成到一個(gè)封閉的測試條中，可檢出來自血培養(yǎng)中24種常見的菌血癥病原菌和3種耐藥基因mecA、vanA/B和KPC，該系統(tǒng)根據(jù)不同測試條組合，最多可同時(shí)報(bào)告43種病原體/耐藥基因結(jié)果。Curetis Unyvero系統(tǒng)采用多重PCR技術(shù)用于肺炎、植入物和組織感染、血流感染和腹腔內(nèi)感染的診斷，包含更為全面的病原體和耐藥基因檢測模塊[7-8]。Nanosphere VERIGENE系統(tǒng)利用金納米顆粒探針技術(shù)，應(yīng)用在陣列和擴(kuò)增兩種方法中，相對熒光基團(tuán)靈敏度更高，目前檢測試劑盒涵蓋了血流感染、胃腸道感染和呼吸道感染，2 h內(nèi)提供檢測結(jié)果。針對血培養(yǎng)陽性的標(biāo)本，具有兩種卡盒分別檢測革蘭陽性菌和革蘭陰性菌，該系統(tǒng)也包括一些耐藥基因（mecA、vanA、vanB、CTX-M、KPC、IMP、NDM、OXA和VIM）的檢測[9]。耐藥性的分子檢測方法具有快速與覆蓋范圍廣的特點(diǎn)，其臨床使用變得越來越廣泛。

1.2 耐藥性蛋白質(zhì)標(biāo)志物檢測

并非所有檢測耐藥性的分子生物學(xué)方法都是基于核酸?，F(xiàn)已報(bào)道了多種直接檢測耐藥性蛋白質(zhì)標(biāo)志物（例如β內(nèi)酰胺酶）的方法，如特定蛋白芯片[10]。這些方法通常使用抗體來捕獲和富集蛋白質(zhì)，可用熒光標(biāo)記抗體或蛋白質(zhì)便于觀察，但抗體與耐藥性蛋白之間的相互作用需要優(yōu)化。目前已經(jīng)開發(fā)了多種側(cè)向?qū)游鰴z測（LFA）產(chǎn)品用以檢測β內(nèi)酰胺酶。其中一項(xiàng)針對新德里金屬β內(nèi)酰胺酶NDM-1的LFA檢測，共收集了來源于緬甸的350株細(xì)菌，結(jié)果顯示具有100%的靈敏度和特異度[11]。在其他類似的研究中，有聯(lián)合檢測OXA48、IMP、NDM和VIM酶的LFA，還有針對mcr-1酶的LFA，研究結(jié)果都非常理想[12-13]。雖然目前已經(jīng)開發(fā)出多種可有效檢測和鑒定耐藥性相關(guān)大分子的方法，但檢測的靶目標(biāo)過于單一，無法掌握細(xì)菌的全部耐藥信息。

1.3 全基因組學(xué)耐藥性檢測

目前在分子診斷領(lǐng)域，出現(xiàn)了一種傾向使用基因組學(xué)方法來鑒定細(xì)菌種類和抗菌藥物耐藥性的趨勢。隨著測序技術(shù)的進(jìn)步，應(yīng)用全基因組測序，再加上生物信息學(xué)工具快速收集和分析這些測序得到的數(shù)據(jù)，基本上可以追蹤導(dǎo)致細(xì)菌耐藥的所有基因。但值得注意的是將生物信息學(xué)數(shù)據(jù)與不同的數(shù)據(jù)庫結(jié)合使用可能導(dǎo)致不同的檢測結(jié)果[14]。目前基因組學(xué)檢測常規(guī)應(yīng)用的最大障礙是缺少成本低廉的測序平臺(tái)以及對用戶“加入樣本，輸出結(jié)果”的生物信息解決方案。近來，引起廣泛關(guān)注的納米孔測序技術(shù)，該技術(shù)相對易于使用，并且生物信息學(xué)的界面已取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展[15]，該技術(shù)產(chǎn)生的序列很長，可以更容易組裝成完整的基因組，并且能夠鑒定質(zhì)粒和大規(guī)模的基因組重排，但在準(zhǔn)確性上仍落后于其他測序技術(shù)，而新的算法（例如機(jī)器學(xué)習(xí)）可以糾正這些缺陷。全基因組測序大大提高了基因型與表型之間的符合性，但這需要不斷地通過表型和基因型方法篩選新的耐藥性機(jī)制和標(biāo)志物、成熟的數(shù)據(jù)庫以及開發(fā)可視化智能軟件等才能逐步實(shí)現(xiàn)。

2 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF MS）檢測

近年來，雖然臨床微生物的鑒定越來越多通過MALDI-TOF MS來完成，但是耐藥性檢測仍很大程度上依賴于傳統(tǒng)或分子生物學(xué)技術(shù)。目前已有許多研究者在使用MALDI-TOF MS或其他質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行耐藥性檢測的研究，其中一些研究尚處于原理證明階段，但另一些已經(jīng)完成了商業(yè)化。

2.1 檢測細(xì)菌的耐藥性標(biāo)志物

通過質(zhì)譜進(jìn)行耐藥性檢測最直接的方法是檢測細(xì)菌內(nèi)的耐藥蛋白（如β內(nèi)酰胺酶)與發(fā)生改變或被修飾的細(xì)胞組分，根據(jù)耐藥菌與敏感菌的質(zhì)譜峰圖存在的單個(gè)峰值或峰簇差異進(jìn)行區(qū)分。β內(nèi)酰胺酶有多種類型，序列變異性高、分子量范圍從25～40 kDa，使用MALDI-TOF MS可以檢測到質(zhì)量超過數(shù)百kDa的蛋白質(zhì)，但通常僅在純化和濃縮步驟之后才能檢測到。Chang等[16]使用爆轟納米金剛石處理樣本后，能夠檢測到鮑曼不動(dòng)桿菌分離株中的碳青霉烯酶特征峰（m/z 40 279±87），但15株敏感菌中有4株在此質(zhì)量范圍內(nèi)也顯示信號。Espinosa等[17]使用芥子酸為基質(zhì)的雙層樣本制備技術(shù)處理大腸埃希菌，經(jīng)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)在所有產(chǎn)CMY-2型AmpC酶的菌株中都存在（m/z 39 800）峰，而對照組中沒有發(fā)現(xiàn)，靈敏度和特異度都達(dá)到了100%。這種方法還可用于檢測陽性血培養(yǎng)物中的KPC-2型碳青霉烯酶（m/z 28 544）。

黏菌素的耐藥機(jī)制多與脂多糖修飾有關(guān)，而脂質(zhì)A是脂多糖結(jié)構(gòu)的重要組成部分，當(dāng)通過至少一個(gè)磷酸基團(tuán)的取代修飾脂質(zhì)A時(shí)，黏菌素與脂多糖的相互作用會(huì)降低[18]。質(zhì)粒編碼的磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶可導(dǎo)致脂質(zhì)A的修飾，耐黏菌素大腸埃希菌與質(zhì)譜中野生型脂質(zhì)A的峰相比，脂質(zhì)A分子中的這些修飾可以對應(yīng)其1 796 m/z 相對分子質(zhì)量+123處的峰[19]。在肺炎克雷伯菌和鮑曼不動(dòng)桿菌中也可以檢測出類似的質(zhì)譜峰漂移[20]。

2.2 監(jiān)測抗菌藥物的降解

將質(zhì)譜作為追蹤抗菌藥物降解的工具，是分析臨床分離菌株耐藥性的另一種策略。將疑似含有抗菌藥物水解酶的細(xì)菌暴露于抗菌藥液中，在適當(dāng)?shù)臏囟认路跤A(yù)設(shè)的時(shí)間，離心后收集樣品，并將少量上清液轉(zhuǎn)移至靶板上，使用MALDI-TOF MS分析并記錄抗菌藥物代謝的動(dòng)力學(xué)。這種方法主要針對β內(nèi)酰胺酶水解活性的檢測，因其結(jié)果是基于β內(nèi)酰胺類抗生素和β內(nèi)酰胺酶水解產(chǎn)物的峰高比發(fā)生變化而獲檢測，故不適用于非產(chǎn)酶耐藥機(jī)制的細(xì)菌[21]。MALDI-TOF MS并不是完全定量的方法,使用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析最多只能得到半定量結(jié)果。這意味著在估算代謝率時(shí)，將考慮峰高或峰面積之比，而不是真實(shí)的濃度值。因此，在未能得出明確的陽性信號之前，抗菌藥物代謝反應(yīng)都必須持續(xù)進(jìn)行下去。這種檢測與細(xì)菌的接種菌量有關(guān)，即如果細(xì)菌接種物濃度足夠大，大多數(shù)碳青霉烯酶在不到一個(gè)小時(shí)內(nèi)即能迅速獲得檢測結(jié)果。如Kawamoto等[22]選擇美羅培南為底物，檢測了145株腸桿菌科細(xì)菌的碳青霉烯酶，即對美羅培南的水解反應(yīng)，結(jié)果顯示所有攜帶IMP金屬酶的菌株都被正確的識別為陽性，即使是有較低美羅培南MIC值（1 mg/L）的菌株；而所有不攜帶IMP金屬酶的菌株即使美羅培南MIC值很高（4 或8 mg/L）也被識別為陰性。也有研究者利用MALDI-TOF MS直接在報(bào)警的陽性血培養(yǎng)中快速檢測產(chǎn)碳青霉烯酶的細(xì)菌，結(jié)果都令人滿意[23]。對于水解活性低的OXA酶，孵育時(shí)間和催化物的添加也有至關(guān)重要的作用，Rapp等[24]發(fā)現(xiàn)將含有OXA酶的不動(dòng)桿菌孵育時(shí)間延長到12 h，可以得到100% OXA酶檢測陽性的靈敏度，而Papagiannitsis等[25]指出添加碳酸氫銨可以提高OXA-48酶的反應(yīng)活性，有助于質(zhì)譜的檢測。

2.3 抗菌藥物作用下微生物的生長檢測

該項(xiàng)技術(shù)可能是最接近常規(guī)抗菌藥物敏感性檢測的技術(shù)，并且可以提供分離菌株藥敏結(jié)果而不是其耐藥性信息。目前已經(jīng)提出了幾種方案，其中已商業(yè)化的MBT-ASTRA 似乎是最有希望的一種。該方案將菌株在有或無抗菌藥物的條件下孵育，裂解細(xì)胞時(shí)加入穩(wěn)定的蛋白質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)，便于測量多肽和小蛋白的數(shù)量，這些數(shù)量與菌株的數(shù)量有關(guān)，因此也與菌株的生長有關(guān)。通過對質(zhì)譜峰的定量分析，依據(jù)整體質(zhì)譜峰曲線下面積，計(jì)算相對生長比值以檢測細(xì)菌是否耐藥。Lange等[26]對108株克雷伯菌屬分離株的研究發(fā)現(xiàn)，在美羅培南濃度為8 mg/L的培養(yǎng)基中孵育1 h后，利用MBT-ASTRA方案檢測，與E試驗(yàn)結(jié)果相比靈敏度為97.3%，特異度為93.5%，該方法也適用其他多種細(xì)菌與抗菌藥物的組合。近期又提出一種新的方法，為直接靶向微滴生長試驗(yàn)（microdroplet assay）[27]，該方法是將數(shù)微升細(xì)菌懸液微滴直接加到有或無美羅培南的靶孔上孵育3 h后，將培養(yǎng)基與細(xì)菌分離，進(jìn)行MALDI-TOF MS檢測，結(jié)果通過軟件分析。如無抗菌藥物添加的生長對照細(xì)菌鑒定評分≥1.7，則判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果為有效，因此有抗菌藥物的細(xì)菌鑒定評分≥1.7 判定為耐藥，＜1.7為敏感。這樣可以進(jìn)行多個(gè)抗菌藥物濃度的測試，從而更接近CLSI或EUCAST指南中標(biāo)準(zhǔn)，而不是僅測試單一濃度。最近，Correa-Martinez等[28]對微滴生長試驗(yàn)進(jìn)一步改進(jìn)，它具有完整的抗菌藥物濃度（0.25～512 mg/L）并加入了β內(nèi)酰胺酶抑制劑（棒酸）。對于微滴生長試驗(yàn)，手動(dòng)去除液體培養(yǎng)基和接種密度等可能造成的不確定性也要予以關(guān)注。

3 新型工程技術(shù)在耐藥性檢測中的應(yīng)用

3.1 基于磁珠的耐藥性檢測

密歇根大學(xué)的研究人員開發(fā)了異步磁珠旋轉(zhuǎn)（asynchronous magnetic bead rotation，AMBR）傳感器，以測量單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的生長和藥物敏感性[29]。其原理是將磁珠放入細(xì)菌懸浮液中，并置于外部旋轉(zhuǎn)磁場內(nèi)以控制磁珠的旋轉(zhuǎn)。隨著時(shí)間的流逝，細(xì)菌會(huì)附著在珠子上，形成珠-細(xì)菌復(fù)合物。由于細(xì)胞分裂引起細(xì)胞長度發(fā)生變化，而旋轉(zhuǎn)動(dòng)力學(xué)也發(fā)生變化。加入抗菌藥物后，受影響的生長動(dòng)力學(xué)曲線在旋轉(zhuǎn)動(dòng)力學(xué)中產(chǎn)生獨(dú)特的可檢測特征，通過測量這些扭矩變化，可檢測到細(xì)菌長度的變化。后期他們使用了自組裝的簇狀磁性微粒來檢測鏈霉素和慶大霉素對大腸埃希菌的MIC，該方法在短時(shí)間內(nèi)（1.5 h）可以清楚地測量出細(xì)菌生長的微小變化。但是，此過程需要特定的懸浮培養(yǎng)物，并且對于較高濃度的細(xì)菌無效。

3.2 納米機(jī)械傳感器

納米機(jī)械傳感器是一種超靈敏振蕩器，用于測量由特定目標(biāo)物質(zhì)吸附或選擇性結(jié)合到所研究的基質(zhì)或樣品上而引起的質(zhì)量變化。其中原子力顯微鏡（atomic force microscopy）是應(yīng)用最廣泛的納米機(jī)械傳感器。不同濃度的抗生素，可以對菌體細(xì)胞產(chǎn)生不同的影響，從表面出現(xiàn)小孔到細(xì)胞壁完全溶解。有研究者已使用原子力顯微鏡成功測量了抗生素作用下敏感細(xì)胞的形態(tài)變化，但該方法不提供實(shí)時(shí)AST結(jié)果。Longo等[30]已經(jīng)開發(fā)了一種帶有原子力顯微鏡尖端的微懸臂梁來研究細(xì)胞的微運(yùn)動(dòng)，將細(xì)菌附著到懸臂的表面，并測量其動(dòng)態(tài)波動(dòng)，通過測量波動(dòng)幅度，研究在抗生素作用下大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的納米尺度運(yùn)動(dòng)及其代謝活性從而獲得MIC/MBC結(jié)果。

3.3 微流體技術(shù)

微流體技術(shù)可以將多種功能（細(xì)菌培養(yǎng)、核酸雜交與擴(kuò)增及細(xì)胞裂解等）合并到1個(gè)芯片上，也稱為“芯片實(shí)驗(yàn)室”，通過各種方式監(jiān)測微流體中生物樣本的物理或化學(xué)行為變化。2014年，Weibull等[31]開發(fā)了具備納升孔的微流體設(shè)備，使用光密度測量，實(shí)時(shí)觀察納升孔中大腸埃希菌在環(huán)丙沙星、頭孢噻肟和氨芐西林作用下的生長情況，并采用一種新的數(shù)學(xué)算法計(jì)算細(xì)菌生長的遲緩期，從而可在4 h內(nèi)獲得MIC。為了減少AST時(shí)間，Kaushik等[32]開發(fā)了基于微滴微流體技術(shù)的熒光設(shè)備，該設(shè)備具有內(nèi)置的孵育區(qū)，可在1 h內(nèi)提供抗菌藥物有效性檢測結(jié)果，是目前最快的表型抗菌藥物有效性檢測設(shè)備之一。在微流體技術(shù)的基礎(chǔ)上，又開發(fā)了多種新的技術(shù)，如梯度微流體、微流體pH傳感器、應(yīng)激誘導(dǎo)微流體等，都在快速檢測細(xì)菌耐藥性上做出了大量的嘗試。

除了以上介紹的新型耐藥性檢測技術(shù)外，還有拉曼光譜法、流式細(xì)胞術(shù)、表面等離子體共振、阻抗譜技術(shù)等多種新方法。相信在未來，新興的技術(shù)會(huì)更加成熟和完善，為患者感染性疾病的快速診療帶來希望。