馬 龍，李 莉，王玉梅，尹 才，李 杰，王曉亮，李知新

（寧夏回族自治區(qū)動物疾病預(yù)防控制中心，寧夏 銀川 750000）

1 流行概況

A場存欄奶牛4 650頭，2020年8月28日引進(jìn)奶牛420頭。據(jù)該場技術(shù)人員反映，2020年10月20日，該批牛體表皮膚陸續(xù)出現(xiàn)丘疹、破潰、結(jié)痂等癥狀。10月22日，1頭牛因后肢損傷嚴(yán)重死亡。10月31日，對該場引進(jìn)奶牛按山羊的5倍劑量，免疫吉林和元生物工程有限公司山羊痘活疫苗。經(jīng)調(diào)查，目前該批調(diào)入牛有20%左右表現(xiàn)出疑似牛結(jié)節(jié)性皮膚病臨床癥狀。

B場存欄奶牛1 427頭，2020年10月16日引進(jìn)奶牛197頭（該批牛起運(yùn)時共200頭，運(yùn)輸途中死亡3頭）。據(jù)調(diào)查，該批奶牛入場后發(fā)現(xiàn)有個別牛體表皮膚出現(xiàn)數(shù)量不等的小丘疹。10月27日，對該場所有奶牛按山羊的5倍劑量，全部免疫金宇保靈生物藥品有限公司山羊痘活疫苗。

C場存欄奶牛1 146頭，2020年10月13日引進(jìn)奶牛420頭。入場時，個別牛皮膚上有丘疹，但沒有引起足夠關(guān)注。

2 臨床癥狀

患病奶牛精神沉郁，不愿活動；食欲減退，流淚流涎；體溫升高，發(fā)熱后皮膚出現(xiàn)10～50 mm的結(jié)節(jié)，通常均勻分布在全身；病變部位出現(xiàn)潰瘍，吸引蠅蚊，反復(fù)結(jié)痂。結(jié)痂附近有明顯炎癥，皮膚組織有出血性滲出液，呈黃色。

3 實(shí)驗(yàn)室檢測

3.1 材料

單道微量移液器和多道微量移液器（Eppendorf公司）；IQ5高速熒光定量PCR儀（美國伯樂BIO-RAD公司）；一次性移液器吸頭（Axygen公司）；牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒熒光PCR檢測試劑盒、引物探針由青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心提供；核酸提取試劑盒（磁珠法）購自蘇州天隆生物科技有限公司（批號20082510T014）。

3.2 樣品采集 采集疑似發(fā)病牛只破潰結(jié)痂組織、口鼻拭子樣品15份，利用熒光PCR方法檢測牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒（LSDV）。

3.3 檢測方法

3.3.1 樣品處理 采集疑似發(fā)病牛只組織樣品，取少許加入石英砂，充分研磨，加入pH7.4 PBS緩沖液，制成1∶5～1∶10懸液，反復(fù)凍融3次，8 000 rpm離心2 min，取上清液56℃水浴消化1 h備用，作為PCR試驗(yàn)材料。

3.3.2 DNA提取 病毒總DNA按照蘇州天隆生物科技有限公司試劑盒說明書提取。對疑似發(fā)病牛只及同群牛進(jìn)行牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒熒光PCR檢測。

3.3.3 基因擴(kuò)增 將引物探針和酶反應(yīng)液瞬時離心后，將酶反應(yīng)液全部移至引物探針中，顛倒混勻6次，充分混勻，配制成PCR反應(yīng)液。

根據(jù)檢測樣品數(shù)量，每個PCR反應(yīng)管加入20 μlPCR反應(yīng)液；先取5 μl陰性對照、再取5 μl待檢DNA、最后取5 μl陽性對照（充分混勻）分別加到不同的PCR反應(yīng)管中，加樣結(jié)束后蓋緊PCR反應(yīng)管。熒光PCR反應(yīng)條件為50℃預(yù)變性2 min；95℃變性5 min；95℃變性15 s，58℃延伸60 s，共40個循環(huán)。設(shè)置58℃收集FAM熒光信號。

4 結(jié)果

對疑似患病牛只采集樣品進(jìn)行牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒核酸熒光PCR檢測，得到特異性擴(kuò)增曲線，且CT值≤37，陰性對照無特異性擴(kuò)增曲線。綜合臨床表現(xiàn)、病理特征以及熒光PCR檢測結(jié)果，確定患病牛只感染牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒。

5 措施及建議

一是檢測撲殺。對3個牛場調(diào)入牛逐頭采樣檢測，對所有發(fā)病和病原學(xué)陽性牛實(shí)施撲殺和無害化處理。二是封鎖隔離。對3個牛場實(shí)施封鎖30 d，嚴(yán)格禁止牛只移動[1]。同群病原學(xué)陰性牛嚴(yán)格進(jìn)行隔離飼養(yǎng)，全場牛按山羊的5倍劑量緊急免疫接種山羊痘活疫苗。三是消毒處理。對全場飼養(yǎng)環(huán)境、圈舍、場地、器具、交通工具等進(jìn)行嚴(yán)格徹底消毒。四是疫情報送。將陽性樣品送國家外來動物疫病研究中心復(fù)核確診，并向中國動物疫病預(yù)防控制中心報告疫情。同時，要求各級動物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)對轄區(qū)內(nèi)新引入牛只（奶牛、牧牛）開展排查摸底監(jiān)測，并實(shí)行日報告制度。五是免疫接種。建議所有奶牛場（牧場）自行采購山羊痘活疫苗進(jìn)行免疫接種。六是檢疫監(jiān)管。要求各地強(qiáng)化調(diào)入牛只檢疫監(jiān)管，重點(diǎn)對牛結(jié)節(jié)性皮膚病進(jìn)行臨床癥狀的查驗(yàn)和病原學(xué)監(jiān)測[2-4]。七是宣傳培訓(xùn)。強(qiáng)化動物疫情應(yīng)急值守，密切關(guān)注疫情動態(tài)，加強(qiáng)宣傳培訓(xùn)。