李威威，劉金龍

（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 肝膽外科，河北 承德 067000）

胰腺癌是世界范圍內(nèi)最致命的惡性腫瘤之一，預(yù)后極差，5年生存率僅為9%[1-2]。大部分患者因缺乏特定癥狀，診斷時(shí)即為晚期，而失去寶貴的手術(shù)治療機(jī)會。臨床上胰腺癌多通過影像學(xué)檢查、生化檢查進(jìn)行診斷，通過組織活檢確診。影像學(xué)檢查敏感度較低且高度依賴于病變的大小[3]；CA 19-9 是目前胰腺癌中最重要并且應(yīng)用最廣泛的一種生物標(biāo)志物，但其低陽性預(yù)測值意味著它在無癥狀患者的大規(guī)模篩查中作用有限，而只適用于監(jiān)測治療反應(yīng)和疾病復(fù)發(fā)的標(biāo)志[4]。循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是腫瘤細(xì)胞凋亡、壞死釋放或活性釋放而釋放出來的一部分循環(huán)游離DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA），攜帶腫瘤基因組的全部表觀遺傳特征[5]。近年來，ctDNA檢測在胰腺癌的早期診斷、評估預(yù)后和化療效果、指導(dǎo)靶向治療中發(fā)揮越來越重要的作用。本文就ctDNA在胰腺癌中的臨床應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 ctDNA

1.1 ctDNA 簡介

血液中含有多種生物物質(zhì)，如循環(huán)細(xì)胞、血小板、細(xì)胞外小泡、mRNA、miRNA、蛋白質(zhì)和cfDNA。在癌癥患者的血液中，有一部分cfDNA是由腫瘤細(xì)胞通過凋亡、壞死或活性釋放而釋放出來的，這種DNA被稱為ctDNA[6]。ctDNA只占據(jù)cfDNA總量的一小部分（＜1.0%），平均長度約＜180 bp（堿基對），濃度為3.6～5.0 ng/mL[7]，且在循環(huán)中的半衰期非常短，最多只有幾個小時(shí)[8]。

一些解剖位置較為特殊的腫瘤，如胰腺癌解剖部位較深，腫瘤組織不易獲取，傳統(tǒng)組織活檢方式存在一定的困難與風(fēng)險(xiǎn)。ctDNA可在血液和其他體液中檢測到，如尿液、唾液、痰、糞便、胸膜液和腦脊液等[9]，因此它的取樣涉及無創(chuàng)或微創(chuàng)手術(shù)，減少了傳統(tǒng)組織活檢的并發(fā)癥，同時(shí)便于重復(fù)多次取樣，以便于動態(tài)監(jiān)測腫瘤的異質(zhì)性，是傳統(tǒng)組織活檢很好的補(bǔ)充[10]。ctDNA可用于檢測早期疾病，也可用于縱向監(jiān)測腫瘤的基因組圖譜，并在臨床癥狀或進(jìn)展的影像學(xué)證據(jù)出現(xiàn)之前檢測晚期環(huán)境中基因改變的出現(xiàn)。因此，ctDNA分析可以指導(dǎo)臨床決策，并通過與其他固體和液體活檢技術(shù)的結(jié)合，最終使癌癥的治療個性化[11]。

1.2 ctDNA 檢測技術(shù)

在體液樣本中，因?yàn)閏tDNA只占cfDNA的小部分， 所以需要高靈敏度的檢測。目前已被普遍接受的新的測序技術(shù)，如數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（digital polymerase chain reaction，dPCR）和下一代測序（next generation sequencing，NGS），較傳統(tǒng)的ctDNA定量方法，如分光光度法、比色DNA定量法和聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）等，在檢測敏感度和檢測效率方面有了極大的提高。這些進(jìn)展使得在基因組的廣泛范圍內(nèi)檢測超罕見的ctDNA突變成為可能[12-14]。

dPCR有著高靈敏度和靶點(diǎn)富集特點(diǎn)，為檢測ctDNA中罕見的腫瘤突變提供了一個選擇平臺。盡管dPCR功能強(qiáng)大，但在單個試驗(yàn)中可檢測的突變數(shù)量是有限的，不能檢測未知突變。另一種方法NGS可以檢測許多基因的多個突變，從而提高了單個樣本的利用率[15]。但是，在檢測ctDNA中的腫瘤突變方面，NGS敏感度目前不如dPCR，檢測限制為0.1%～10%MAF，而基于dPCR的方法為0.001%[16]。同時(shí)dPCR比NGS有著更短的檢測周期，意味著能夠更加快速檢測ctDNA的突變。這兩種方法在流程上可能是互補(bǔ)的，例如NGS可用于分析原發(fā)腫瘤和識別感興趣的核酸變異體，然后特異的突變可以通過特異的dPCR檢測在血漿中捕獲。但是這種工作流程可能無法在治療過程或后續(xù)隨訪中識別新突變[9]，這有待進(jìn)一步的探索。

雖然已經(jīng)存在幾種具有良好檢測限的分析方法，但仍需開展工作，以開發(fā)可以重復(fù)使用、更便宜、操作更簡單且能夠在學(xué)術(shù)實(shí)驗(yàn)室之外實(shí)施的分析方法，或提高已具有這些特性的已有技術(shù)的分析靈敏度和特異度[17]。近年來，微流體技術(shù)在化學(xué)、生命科學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。與微流體技術(shù)相結(jié)合的生物傳感器將實(shí)驗(yàn)室中不同單元的操作整合在一塊芯片上，具有先進(jìn)的自動化和集成度。微流控芯片在ctDNA檢測和分析方面具有巨大的潛力[18]。

2 ctDNA 在胰腺癌中的臨床應(yīng)用

2.1 DNA 突變檢測

想要探索ctDNA在胰腺癌中的臨床應(yīng)用，首先要清楚胰腺癌患者中的ctDNA有著怎樣的變化。Li等[19]對223例胰腺癌患者的血樣進(jìn)行ctDNA序列分析，共有152例（68.2%）患者從ctDNA中檢測到至少一種可報(bào)告的基因組改變，經(jīng)常改變的基因是KRAS（53.5%），其次是TP53（52.8%）和CDKN2A（15.1%）。其中KRAS突變患者中，87.0%的患者出現(xiàn)KRAS G12突變，分別為G12D（53.6%）、G12I（1.2%）、G12R（9.5%）和G12V（22.6%），其次為Q61H/L/R、V186I和N85H等突變。這些ctDNA中檢測到的突變與胰腺癌患者的組織樣本有著類似頻率的基因組改變。沈璟等[20]回顧性分析接受根治性胰腺切除術(shù)并接受靶向測序分析的247例胰腺癌患者，研究發(fā)現(xiàn)K R A S 突變可能與腫瘤分化程度和病理T 分期相關(guān)，TP53突變可能與腫瘤分化程度和切緣相關(guān)，CDKN2A突變可能與性別相關(guān)。

這些研究有助于更好地了解胰腺癌患者的ctDNA譜，血源性ctDNA測序可被視為對組織檢測有意義的補(bǔ)充，這就為探索ctDNA在胰腺癌中的臨床應(yīng)用提供了更有針對性的信息。最常見的ctDNA突變?nèi)鏚RAS突變等，可為胰腺癌的早期診斷和評估療效等方面提供方向。此外，還可以從胰腺癌患者的ctDNA譜中發(fā)現(xiàn)特定的藥物靶點(diǎn)，進(jìn)行針對性的靶向治療，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)個性化的精準(zhǔn)醫(yī)療。目前來說仍需要更多大型的前瞻性臨床研究，進(jìn)一步構(gòu)建和完善胰腺癌患者的ctDNA譜。

2.2 早期診斷

胰腺癌作為一類高致死性疾病，因起病隱匿、早期缺乏特定癥狀，大部分患者在被診斷時(shí)已經(jīng)處于晚期，失去了根治性手術(shù)的機(jī)會[21]，所以胰腺癌的早期診斷顯得尤為重要。但早期發(fā)現(xiàn)胰腺癌有很多挑戰(zhàn)，包括它的無癥狀性、缺乏能夠及時(shí)檢測到較小病變的影像學(xué)檢查以及迄今為止缺乏高敏感度和特異度的腫瘤標(biāo)志物，如CEA、CA19-9等血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物升高雖然常見于惡性腫瘤患者，但是特異度較差，不能明確腫瘤的來源，且不能排除良性病變引起的相關(guān)標(biāo)志物水平升高[14,22]。因此尋找穩(wěn)定可靠且敏感度高特異度強(qiáng)的腫瘤標(biāo)志物, 仍是胰腺癌早期診斷中需要解決與關(guān)注的問題[23]。

Cohen等[24]通過研究221例可切除胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）患者ctDNA的KRAS突變，以182例未發(fā)現(xiàn)癌癥的患者作為對照組。在66例胰腺癌患者的血漿中檢測到KRAS突變（30%），同時(shí)血漿中發(fā)現(xiàn)的每個突變都與隨后在患者原發(fā)腫瘤中發(fā)現(xiàn)的突變完全一致（100%）。來自對照隊(duì)列的182份血漿樣本中，只有一份DNA或蛋白質(zhì)生物標(biāo)記呈陽性（99.5%的特異度）。這意味著ctDNA中的KRAS突變可能是一種有前途的胰腺癌診斷的生物標(biāo)志物，但是單純ctDNA的檢測敏感度相對較低，這就大大影響了對胰腺癌的早期診斷。

Wang等[25]把突變體KRAS-ctDNA與CA19-9進(jìn)行聯(lián)合檢測，發(fā)現(xiàn)其對胰腺癌（尤其是在早期癌癥階段）診斷的敏感度明顯提高。Cohen等[24]嘗試通過結(jié)合ctDNA的KRAS突變和CA19-9與其他蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物進(jìn)一步提高敏感度，通過試驗(yàn)篩選出另外三種蛋白生物標(biāo)志物：癌胚抗原（carcinoem bryonic antigen，CEA）、肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN)。最終KRAS與四種蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物結(jié)合使用可將敏感度由單獨(dú)KRAS突變的30%提高到64%。這些研究都表明ctDNA和蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物聯(lián)合檢測優(yōu)于單一標(biāo)記物，這為ctDNA應(yīng)用于胰腺癌的早期診斷開拓了新的視野，但需要更多更大型的前瞻性研究來補(bǔ)充。

2.3 評估預(yù)后

目前胰腺癌患者預(yù)后評估主要靠影像學(xué)和蛋白質(zhì)腫瘤標(biāo)記物（如CA19-9、CEA等），但影像學(xué)檢查有一定的延后性，不能及時(shí)反映患者病情的進(jìn)展，蛋白質(zhì)腫瘤標(biāo)記物敏感度又較低，所以需要一種新的評估方式[26]。Strijker等[27]對58例未經(jīng)治療的轉(zhuǎn)移性PDAC患者進(jìn)行了回顧性分析，在26例（44.8%）樣本中檢測到ctDNA致病性突變，且檢測到ctDNA與未檢測到患者的中位總生存時(shí)間（overall survival，OS）相比明顯縮短。Hadano等[28]分析了105例行胰十二指腸切除術(shù)的PDAC患者，33例（31%）血漿中檢測到ctDNA。檢測到ctDNA的患者中位OS持續(xù)時(shí)間比沒有ctDNA的患者明顯縮短，前者預(yù)后明顯較差。這些研究結(jié)果顯示血漿樣本中ctDNA的存在可能是胰腺癌患者較差生存的一個重要而有力的評估因素，臨床應(yīng)用中可以評估患者預(yù)后，在治療前或治療中給予高?；颊吒嗟木C合治療手段，有益于獲得更高的效益。

2.4 評估化療效果

化療是改善中晚期胰腺癌患者預(yù)后的主要手段，及時(shí)評估化療敏感度并根據(jù)結(jié)果調(diào)整化療方案對于治療尤為重要。Del Re等[29]對27例晚期PDAC并接受一線5-氟尿嘧啶、伊立替康和奧沙利鉑或吉西他濱和納布紫杉醇治療的患者在開始化療前（基線）和治療第15天進(jìn)行ctDNA分析，并且每次臨床隨訪。19例患者在基線血漿樣本中顯示了KRAS突變。在第15天采集的樣本中，ctDNA增加患者的無進(jìn)展生存時(shí)間（progression-freesur vival，PFS）和OS明顯縮短。這項(xiàng)研究表明ctDNA中的KRAS接受化療前后的變化與胰腺癌化療患者預(yù)后有關(guān)。Kruger等[30]研究54例接受吉西他汀化療的晚期胰腺癌患者也發(fā)現(xiàn)，化療期間突變體KRAS-ctDNA水平的降低是腫瘤對化療敏感的早期指標(biāo)，而CA19-9、CEA或CYFRA21-1的動態(tài)改變與化療敏感度無顯著相關(guān)。

這些研究都說明ctDNA分析可能作為一種新的化療敏感度評估方式，可以根據(jù)ctDNA的變化評估化療敏感度進(jìn)而判斷治療效果，及時(shí)有針對性的調(diào)整治療方案，從而可以獲得更大治療效果。同時(shí)因?yàn)閏tDNA的半衰期比CA19-9的半衰期要短很多，大約為2 h，因此它更適合作為短期動力學(xué)的標(biāo)記物[31]，意味著ctDNA水平的變化比蛋白質(zhì)腫瘤標(biāo)志物的變化更加迅速和明顯，具有顯著的優(yōu)越性。但目前仍需要大規(guī)模的試驗(yàn)來形成標(biāo)準(zhǔn)的評估體系。

2.5 指導(dǎo)選擇抗腫瘤藥物

Li等[19]從胰腺癌患者的CTDNA中檢測到幾個潛在的藥物靶點(diǎn)，如NTRK家族基因（拉羅替尼的靶點(diǎn)）和DNA損傷反應(yīng)相關(guān)基因BRCA1和BRCA2（奧拉帕尼的靶點(diǎn)）。這些靶點(diǎn)基因可能將指導(dǎo)選擇抗腫瘤藥物。Drilon等[32]將55例TRK融合陽性的局部晚期或轉(zhuǎn)移性腫瘤患者納入研究并接受拉羅替尼治療，總有效率為75%（95%CI=61～85）。研究表明拉羅替尼在TRK融合陽性的癌癥患者中具有顯著且持久的抗腫瘤活性。Golan 等[33]將154例具有種系BRCA1或BRCA2突變以及轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者隨機(jī)分組并試驗(yàn)干預(yù)（92例接受奧拉帕尼治療，62 例接受安慰劑治療）。試驗(yàn)結(jié)果顯示在具有種系BRCA1或BRCA2突變以及轉(zhuǎn)移性胰腺癌的患者中奧拉帕尼組的無進(jìn)展生存期顯著長于安慰劑組（7.4 個月vs.3.8 個月，P=0.004）。

美國臨床腫瘤學(xué)會（Americ an Society of Clinical Oncology，ASCO）在最新指南中提出，對于轉(zhuǎn)移性胰腺癌和已確認(rèn)的種系BRCA突變患者，奧拉帕尼可能被推薦作為維持治療的一種選擇。對于存在NTRK1/2/3基因的腫瘤患者，建議使用拉羅替尼或恩特雷西替尼治療[34]。除了以上基因靶點(diǎn)，Cheng等[35]在轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者的ctDNA中還發(fā)現(xiàn)了另外幾種潛在的有臨床意義的基因突變，如EGFR、KDR和ERBB2等等。一項(xiàng)三期臨床試驗(yàn)證實(shí)，口服EGFR酪氨酸激酶抑制劑藥物埃羅替尼聯(lián)合吉西他濱可延長總生存期[36]，因此攜帶ctDNA的EGFR突變的胰腺癌患者可能受益于EGFR酪氨酸激酶抑制劑藥物治療。這些靶點(diǎn)和靶向藥物的出現(xiàn)為胰腺癌患者的治療帶來了新的突破。

基于ctDNA的液體活檢樣本進(jìn)行靶基因測序的分析可以指導(dǎo)選擇抗腫瘤藥物，進(jìn)而探索精準(zhǔn)個體化治療方法。這意味著患者在治療前可以通過對ctDNA的靶基因測序分析，根據(jù)個人情況選擇合適的治療方法，更有針對性與效率性。隨著技術(shù)的提高、分析方法的改進(jìn)和更多的藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，ctDNA可以成為定制個性化治療的有力的輔助手段。

3 小 結(jié)

總體來說，ctDNA在胰腺癌中的臨床應(yīng)用進(jìn)展非常迅速，但還需要更多更大規(guī)模的研究。盡管存在很多技術(shù)或生物學(xué)挑戰(zhàn)，ctDNA仍然展現(xiàn)了其在早期診斷，評估預(yù)后與化療效果以及指導(dǎo)選擇抗腫瘤藥物等方面的巨大潛力。相信隨著技術(shù)的逐漸發(fā)展與研究的不斷深入，ctDNA在胰腺癌的診治領(lǐng)域?qū)l(fā)揮更大的作用。