劉 玲 楊曉瑜 程 明 鄭 丹 柯皓天， 任建宇 李瓊秀 杜國(guó)良

(1. 四川省絲綢工程技術(shù)研究中心，成都 610031；2. 四川省絲綢科學(xué)研究院有限公司，成都 610031；3. 四川省閬中蠶種場(chǎng)，四川 閬中 637400)

柞蠶微粒子病俗稱銹病、黑渣病等，柞蠶微孢子蟲(chóng)(Nosemapernyi,Np)是引起柞蠶微粒子病的病原。Np孢子通過(guò)食下傳染和胚種傳染2種途徑致病，其中胚種感染的危害最大，一旦發(fā)生會(huì)給柞蠶種繁育和柞蠶繭生產(chǎn)帶來(lái)毀滅性經(jīng)濟(jì)損失，因此柞蠶微粒子病一直是柞蠶產(chǎn)業(yè)的重要檢疫病害。盡早針對(duì)柞蠶微孢子蟲(chóng)進(jìn)行快速、準(zhǔn)確檢測(cè)并阻斷其傳播，仍是生產(chǎn)上對(duì)柞蠶微粒子病的主要防控措施。本文簡(jiǎn)要介紹已有的檢測(cè)柞蠶微孢子蟲(chóng)的4種方法，包括普通鏡檢法、常規(guī)PCR檢測(cè)法、膠體金免疫層析檢測(cè)法和熒光定量PCR檢測(cè)法，供生產(chǎn)上對(duì)柞蠶微粒子病的早期檢測(cè)診斷參考。

1 普通鏡檢法

自20世紀(jì)20年代開(kāi)始，我國(guó)柞蠶業(yè)就在蠶種生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)雌蛾抽樣后利用顯微鏡鑒定其是否含有Np孢子，進(jìn)而淘汰染病雌蛾產(chǎn)下的帶毒卵，這項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)被稱之為普通鏡檢法[1-2]。直到現(xiàn)在，在采用卵面、蠶具及蠶場(chǎng)環(huán)境消毒等綜合防治措施中，普通鏡檢法仍然是控制柞蠶微粒子病暴發(fā)流行最有效的手段。

普通鏡檢法具有成本低、操作簡(jiǎn)單、方便實(shí)用的特點(diǎn)。四川省通江縣柞蠶種場(chǎng)每年采用鏡檢法進(jìn)行的柞蠶雌蛾磨蛾集團(tuán)檢驗(yàn)，能將帶毒率控制在1‰以內(nèi)，并且可達(dá)到“兩降”(降低勞動(dòng)強(qiáng)度和檢驗(yàn)成本)、“兩省”(節(jié)省檢驗(yàn)時(shí)間，春季蠶種放養(yǎng)時(shí)間可提前5～6 d)、“三提高”(微孢子蟲(chóng)檢出率提高、檢出準(zhǔn)確率提高、蠶種質(zhì)量有效提高)的效果。

但是，普通鏡檢法對(duì)鏡檢人員的經(jīng)驗(yàn)和專業(yè)技術(shù)水平要求較高，需要具備能準(zhǔn)確識(shí)別柞蠶微孢子蟲(chóng)和辨識(shí)可交叉感染柞蠶的野外昆蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)[3-4]的能力。

2 常規(guī)PCR檢測(cè)法

鄧真華等[5]利用常規(guī)PCR技術(shù)對(duì)柞蠶微孢子蟲(chóng)進(jìn)行了有效檢測(cè)。之前還有研究者采用稍加改進(jìn)的斑跡抽提法[6]成功提取到柞蠶微孢子蟲(chóng)基因組DNA，采用的PCR擴(kuò)增引物為P1/P2和N1/N2，這2對(duì)引物是依據(jù)已報(bào)道的微粒子屬16S rRNA基因的保守序列[7-8]設(shè)計(jì)的。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，引物N1/N2的擴(kuò)增靈敏度比引物P1/P2的高。在總體積為25 μL的PCR反應(yīng)體系中，作為模板的柞蠶微孢子蟲(chóng)基因組DNA的含量為0.47 ng時(shí)，引物N1/N2仍能擴(kuò)增出清晰的條帶，表明常規(guī)PCR技術(shù)在檢測(cè)柞蠶是否被柞蠶微孢子蟲(chóng)感染具有較高的靈敏度。

由于柞蠶微孢子蟲(chóng)具有一層幾丁質(zhì)外殼，一般化學(xué)物質(zhì)很難去除，采用SDS法、CTAB法等常規(guī)DNA抽提法得到的微孢子蟲(chóng)基因組DNA在質(zhì)量方面很難達(dá)到檢測(cè)要求。采用斑跡抽提法[6]得到的DNA雖然能滿足PCR擴(kuò)增要求，但是提取步驟多、操作繁瑣，增加了時(shí)間成本。此外，PCR儀設(shè)備昂貴，許多柞蠶種場(chǎng)的財(cái)力尚不能承受此支出。這些都是應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)柞蠶微孢子蟲(chóng)難以實(shí)用化的原因。

3 膠體金免疫層析檢測(cè)法

王伯陽(yáng)等[9]利用柞蠶微孢子蟲(chóng)孢子液直接免疫家兔獲得柞蠶微孢子蟲(chóng)多克隆抗體后，采用以下2種方法制作了膠體金免疫層析試紙條。

雙抗夾心法：將柞蠶微孢子蟲(chóng)多克隆抗體與25 nm的膠體金顆粒結(jié)合并固定在金標(biāo)墊上，質(zhì)控點(diǎn)C上的物質(zhì)為羊抗兔二抗，檢測(cè)點(diǎn)T上的物質(zhì)為柞蠶微孢子蟲(chóng)多克隆抗體。

競(jìng)爭(zhēng)法：將柞蠶微孢子蟲(chóng)多克隆抗體與17 nm的膠體金顆粒結(jié)合并固定在金標(biāo)墊上，質(zhì)控點(diǎn)C同雙抗夾心法，柞蠶微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白作為檢測(cè)點(diǎn)T。

用2種試紙條同時(shí)檢測(cè)不同濃度的柞蠶微孢子蟲(chóng)懸液，當(dāng)懸液中的Np孢子濃度達(dá)到8×106mL-1時(shí)，檢測(cè)10 min后，試紙條檢測(cè)線顯色趨于穩(wěn)定。對(duì)比2種試紙條的檢測(cè)結(jié)果，采用雙抗夾心法制作的試紙條顯色更清晰，因而結(jié)果更可靠，更具實(shí)用價(jià)值。

該方法具有結(jié)果直觀、特異性強(qiáng)、可檢測(cè)活體柞蠶微孢子蟲(chóng)等優(yōu)點(diǎn)。但也存在2點(diǎn)不足：一是試驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定，靈敏度較常規(guī)PCR檢測(cè)法低；二是試紙檢測(cè)線顯色清晰度較差，需要進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)條件。

4 熒光定量PCR檢測(cè)法

米銳等[10]采用熒光定量PCR方法檢測(cè)柞蠶微孢子蟲(chóng)的基因組DNA。實(shí)驗(yàn)依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定熒光定量PCR的Ct值≤35作為檢測(cè)的敏感度區(qū)間，對(duì)柞蠶微孢子蟲(chóng)基因組DNA的最低檢出限為0.004 6 ng，約為常規(guī)PCR技術(shù)檢出限(0.470 0 ng)的100倍。

采用熒光定量PCR法、普通鏡檢法和常規(guī)PCR法檢測(cè)相同的100粒柞蠶蛹樣品，3種方法檢測(cè)出的呈柞蠶微孢子蟲(chóng)感染陽(yáng)性的樣品數(shù)分別為54個(gè)、2個(gè)和34個(gè)。作者還利用該方法和普通鏡檢法抽樣檢測(cè)生產(chǎn)中的柞蠶種繭和雌蛾，結(jié)果顯示，2種方法對(duì)柞蠶微孢子蟲(chóng)感染陽(yáng)性檢出率差異顯著(P<0.05)。

熒光定量PCR是目前所有檢測(cè)方法中靈敏度最高的。然而此方法檢測(cè)結(jié)果的特異性和靈敏度依賴于被檢測(cè)樣本的高質(zhì)量基因組DNA，采用斑跡抽提法[6]才能獲得高質(zhì)量的柞蠶微孢子蟲(chóng)基因組DNA，但這種提取方法的弊端如前面所述。

此外，熒光定量PCR儀價(jià)格昂貴，對(duì)操作人員的專業(yè)技術(shù)水平要求較高，一般柞蠶種場(chǎng)沒(méi)有相應(yīng)的設(shè)備和技術(shù)人員，限制了該方法的大范圍應(yīng)用。