廖叢娟，張旭升，樊小容，譚小青，黃戰(zhàn)軍，蔡博治

近來研究發(fā)現(xiàn)，毛乳頭細(xì)胞通過分泌許多生物活性因子如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（ VEGF ）等調(diào)節(jié)毛發(fā)的生長(zhǎng)，在毛囊的周期性循環(huán)和毛發(fā)生長(zhǎng)中起重要作用[1,2]。尾加壓素Ⅱ（ urotensin Ⅱ，UⅡ）是一種最初發(fā)現(xiàn)于硬骨魚尾部下垂體的活性肽，其分布具有種屬普遍性，不同物種UⅡ的活性中心都是一個(gè)高度保守的環(huán)形六肽結(jié)構(gòu)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，UⅡ是一種內(nèi)源性絲裂原，可促進(jìn)多種細(xì)胞增殖，同時(shí)UⅡ還具有內(nèi)分泌效應(yīng)，可影響血漿催乳素、促甲狀腺素、VEGF 等生物活性因子的分泌[4]。本實(shí)驗(yàn)觀察了UⅡ?qū)w外培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞增殖及分泌VEGF的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 試劑

SPF級(jí)雄性SD大鼠（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。DMEM 高糖培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（Gibco公司）。胰蛋白酶（Sigma公司）。Urotensin Ⅱ（Rat，200 μg）（康肽生物有限公司）。CCK-8（碧云天生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將大鼠處死，于無菌環(huán)境下取大鼠觸須皮膚，用顯微剪分離大鼠觸須毛囊至生理鹽水中，再將觸須毛囊毛球部剪下，用Ⅰ膠原酶消化分離出毛球部的毛乳頭細(xì)胞。將毛乳頭細(xì)胞放入T25培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。貼壁后第1天細(xì)胞開始遷出呈現(xiàn)放射狀生長(zhǎng)，2周后細(xì)胞絕大部分融合?？梢姷降湫偷拿轭^細(xì)胞凝集性生長(zhǎng)的特性（圖1）。

圖1 毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)2周后的細(xì)胞形態(tài)鏡下所見（×100）

1.2.2 UⅡ?qū)w外培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞增殖的影響將第2～4代細(xì)胞消化、臺(tái)盼藍(lán)染活細(xì)胞計(jì)數(shù)，以每孔3×103的密度接種于96孔板內(nèi)，放置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，每孔加入100 μl含不同濃度UⅡ的DMEM培養(yǎng)基，UⅡ的濃度分別為10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol/L，對(duì)照孔加入不添加UⅡ的培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以鋪板24 h記為測(cè)量的0 h，分別于 0、24、48和72 h采用CCK-8法測(cè)量各孔的A值。測(cè)量時(shí)去除每孔的原培養(yǎng)液，懸空滴加含10% CCK8的新鮮培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中放置1 h后，在酶標(biāo)儀上測(cè)量波段為450 nm的A值。增殖率=（含UⅡ?qū)嶒?yàn)孔A值-空白對(duì)照孔A值）/（不含UⅡ?qū)φ湛譇值-空白對(duì)照孔A值）×100%。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)上清液中VEGF水平 取2～4代毛乳頭細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞消化、臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)后調(diào)節(jié)為105個(gè)/ml細(xì)胞懸液，接種于24孔板內(nèi)，每孔500 μl。將24孔板放置于5% CO2培養(yǎng)箱中，24 h后細(xì)胞穩(wěn)定貼壁，分別加 入 含10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol/L UⅡ的DMEM培養(yǎng)基各500 μl。對(duì)照組僅加入500 μl DMEM培養(yǎng)基。每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)72 h后，換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集上清，用 VEGF ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的VEGF 水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 毛乳頭細(xì)胞的培養(yǎng)

新鮮分離的毛乳頭接種于 DMEM 培養(yǎng)液中, 放置于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2周后絕大部分融合生長(zhǎng)，形狀似長(zhǎng)梭形的成纖維細(xì)胞，呈凝集性生長(zhǎng)特性（圖1）。

2.2 UⅡ?qū)γ轭^細(xì)胞增殖的影響

UⅡ10-6、10-7、10-8mol/L 可顯著促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞增殖（與對(duì)照組比較P＜0.05），說明UⅡ?qū)γ轭^細(xì)胞具有促增殖作用（圖2a）。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，濃度為10-6mol /L的UⅡ?qū)γ轭^細(xì)胞的促增殖作用明顯升高，48 h及72 h毛乳頭細(xì)胞的增殖率與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2b）。

圖2 CCK8 法檢測(cè)UⅡ?qū)w外培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞增殖的影響

2.3 不同濃度UⅡ?qū)γ轭^細(xì)胞上清中VEGF水平的影響

10-6、10-7mol /L UⅡ組毛乳頭細(xì)胞上清中分泌的VEGF水平高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 不同濃度U II對(duì)毛乳頭細(xì)胞上清中VEGF水平的影響 （n=3，ˉx ±s）

3 討論

毛乳頭細(xì)胞是一種生長(zhǎng)于毛囊基底部的真皮源性細(xì)胞，通過分泌許多生物活性因子形成信號(hào)分子網(wǎng)絡(luò)，對(duì)毛囊的生長(zhǎng)周期和毛發(fā)生長(zhǎng)起重要調(diào)控作用[5]。VEGF是毛乳頭細(xì)胞分泌的多種生物活性因子中的一種，體外培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞能高水平表達(dá)VEGF。VEGF 及其受體的表達(dá)與毛細(xì)血管的形成有關(guān)，是與血管新生有關(guān)的最重要的靶基因之一[6]。在毛發(fā)生長(zhǎng)周期中，VEGF 的表達(dá)和消失與毛球部血管的生成和消失保持一致[7]。有研究報(bào)道，VEGF通過誘導(dǎo)毛囊周圍血管形成而調(diào)控毛囊的周期性循環(huán)和促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)[8]。因此，對(duì)促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞分泌VEGF的研究是值得關(guān)注的。

UⅡ具有許多生理學(xué)效應(yīng)，例如刺激平滑肌細(xì)胞、心肌成纖維細(xì)胞、腎系膜細(xì)胞等增殖，促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞分泌纖維連接蛋白以及Ⅰ型、Ⅱ型膠原蛋白[9]。文獻(xiàn)報(bào)道，UⅡ可誘導(dǎo)缺氧人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VEGF，誘導(dǎo)外膜成纖維細(xì)胞分泌VEGF[10,11]，提示UⅡ很可能是促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞分泌VEGF的重要因子。

本實(shí)驗(yàn)采用體外分離培養(yǎng)的大鼠毛乳頭細(xì)胞，檢測(cè)不同濃度UⅡ?qū)w外培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞分泌VEGF水平的影響。研究結(jié)果表明，10-6、10-7、10-8mol /L UⅡ可顯著促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞增殖，說明UⅡ?qū)γ轭^細(xì)胞具有促增殖作用，且呈時(shí)間依賴性。但UⅡ?qū)γ轭^細(xì)胞的促增殖作用沒有劑量依賴性，其原因可能是高濃度的UⅡ?qū)γ轭^細(xì)胞有一定毒性，影響了毛乳頭細(xì)胞的凋亡，因此只有適當(dāng)濃度的UⅡ可促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞增殖。同時(shí)，10-6、10-7mol /L UⅡ處理毛乳頭細(xì)胞可明顯地干預(yù)VEGF表達(dá)，提示UⅡ被開發(fā)為一種新的促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)藥物的潛在可能性，其機(jī)制可能與促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞分泌 VEGF 從而促毛發(fā)生長(zhǎng)有關(guān)。

毛乳頭細(xì)胞上可表達(dá)多種生長(zhǎng)因子受體，如表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（HGF）、VEGF 受體等。下一步筆者將檢測(cè)UⅡ?qū)ζ渌L(zhǎng)因子受體分泌水平的影響，并集中研究UⅡ具體是通過哪一種信號(hào)通路對(duì)毛乳頭細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖進(jìn)行調(diào)節(jié)。