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        哈蟆油蛋白多肽的透皮作用研究

        2021-03-26 08:10:02張玉堯徐云鳳李香艷

        張玉堯,徐云鳳,王 涵,李香艷,荊 禮,張 鶴,3

        (1長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)/吉林省中藥生物大分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)春130117;2長(zhǎng)春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司,長(zhǎng)春130012;3長(zhǎng)春中醫(yī)院大學(xué)附屬醫(yī)院,長(zhǎng)春130021)

        0 引言

        哈蟆油(Ranae Oviductus)是中國(guó)林蛙(Rana temporaria ChensinensisDavid)的干燥輸卵管,也稱林蛙油,是中國(guó)東北地區(qū)的名貴藥材。具有“滋補(bǔ)軟黃金”的美譽(yù),是各種體虛、身體疲勞的理想滋補(bǔ)品,也是美容養(yǎng)顏、抗衰老[1]、抗氧化[2]、抗疲勞[3]的理想佳品。哈蟆油中含有豐富的蛋白質(zhì)(含量高達(dá)56%)和對(duì)人體有益的不飽和脂肪酸、磷脂、激素、維生素及微量元素等[4],這些天然成分易被皮膚吸收,加快細(xì)胞更新速度,減少黑色素生成,對(duì)細(xì)微皺紋、干燥和松弛的肌膚有營(yíng)養(yǎng)滋潤(rùn)效果,防止皮膚皺紋的產(chǎn)生,有延緩老化和調(diào)節(jié)女性內(nèi)分泌的明顯功效[5]。目前中國(guó)林蛙及哈蟆油作為一種新的化妝品原料已被開(kāi)發(fā)利用,劉春娟等[6]開(kāi)發(fā)的林蛙油保濕乳液具有較好保濕性能。由于哈蟆油中含有大量膠原蛋白和黏蛋白,遇水易膨脹,膨脹度大于55,且粘稠度較大,不利于生產(chǎn)加工和皮膚吸收。采用蛋白酶酶解的方法可以降低哈蟆油蛋白分子量,水溶性好[7];且雙酶法制備哈蟆油蛋白多肽更優(yōu)于單酶法[8]。董穎等[9]采用雙酶法制備的哈蟆油蛋白多肽,僅從酶解前后分子量分布情況進(jìn)行比較,而酶解前后粘度的改變也是考察的重要指標(biāo)之一[10]。因此本研究在董穎等的研究基礎(chǔ)上,采用雙酶法制備哈蟆油蛋白多肽,根據(jù)分子量和粘度的變化對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià);應(yīng)用體外離體試驗(yàn),研究哈蟆油蛋白多肽的透皮吸收情況,為哈蟆油化妝品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        林蛙:蛟河市前進(jìn)鄉(xiāng);堿性蛋白酶、胃蛋白酶:北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司;標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白(Mr 6.5 kDa,Mr 13.7 kDa,Mr 29 kDa,Mr 43 kDa,Mr 75 kDa):GE Healthcare;血管活性腸肽(Mr 3.323 kDa):美侖生物技術(shù)有限公司;多肽(GLLGASVLGL,Mr 0.899 kDa):中肽生化有限公司;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸鈉:美國(guó)Fluka公司;Zenix SEC-100色譜柱,美國(guó)Sepax公司。SPF級(jí)昆明小鼠,長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司。試驗(yàn)在長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省中藥生物大分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,于20013年2—11月份進(jìn)行。

        1.2 主要儀器

        Aglient1100 HPLC色譜儀:美國(guó)Aglient公司;RYH-6B透皮吸收儀:天津市光學(xué)儀器廠;AB135-S分析天平,PHS-25數(shù)顯酸度計(jì):梅特勒-托利多儀器有限公司;UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):日本島津;WFO烘箱:上海愛(ài)郎儀器有限公司;DV-Ⅱ+P型旋轉(zhuǎn)黏度計(jì),美國(guó)BROOKFIELD公司。

        1.3 哈蟆油蛋白多肽制備及黏度測(cè)定

        采用雙酶法制備哈蟆油蛋白多肽[9],取哈蟆油20 g,按料液比1:100加入pH 4.5的檸檬酸2 L,浸泡36 h,樣品濃度1.0 g/100 mL,室溫條件下應(yīng)用旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)測(cè)定其黏度,記錄黏度值(浸提液);勻漿后加入4 L蒸餾水,煎煮2 h,濃縮,樣品濃度3.8 g/100 mL,冷卻至室溫測(cè)定黏度值(水煮液);用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH 2.0~3.0,按酶與底物比1:2000加入胃蛋白酶10.0 mg,37℃酶解2 h,酶解后樣品煮沸15 min,使酶失活,樣品濃度3.8 g/100 mL,冷卻至室溫測(cè)定黏度值(胃蛋白酶酶解液);用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至pH 9.0~10.0,按酶與底物比1:100加入堿性蛋白酶200.0 mg,55℃酶解6 h,酶解后樣品煮沸15 min,使酶失活,樣品濃度7.0 g/100 mL,冷卻至室溫測(cè)定黏度值(堿性蛋白酶酶解液);調(diào)pH 6.8~7.2,0.22 μm濾膜過(guò)濾,上清液凍干,凍干粉即為哈蟆油蛋白多肽。

        1.4 哈蟆油蛋白相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

        1.4.1 高效液相色譜條件 色譜柱為Zenix SEC-100;流動(dòng) 相 為 0.1 mol/L Na2HPO4,0.1 mol/L NaH2PO4,0.1 mol/L Na2SO4,pH 6.4;流速 1 mL/min;進(jìn)樣量20 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm。

        1.4.2 分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線 不同分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白(Mr 0.899 kDa,Mr 3.323 kDa,Mr 6.5 kDa,Mr 13.7 kDa,Mr 43 kDa,Mr 75 kDa)溶于pH 6.4的流動(dòng)相,按高效液相色譜條件進(jìn)樣。以分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)(log Mr)為橫坐標(biāo)(x),保留時(shí)間(min)為縱坐標(biāo)(y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,見(jiàn)公式(1)。

        1.4.3 樣品測(cè)定 取酶解前和酶解后樣品,0.22 μm濾膜過(guò)濾,取20 μL注入高效液相色譜儀,記錄色譜峰的保留時(shí)間和峰面積百分比,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品相對(duì)分子質(zhì)量。

        1.5 哈蟆油蛋白多肽透皮率測(cè)定

        1.5.1 皮膚制備 Wistar雌性小鼠,將鼠斷頸處死后,剪去腹部毛,分離腹部皮膚,去除皮下筋膜和脂肪,用生理鹽水反復(fù)沖洗,至無(wú)渾濁為止,用鋁箔包裹后放入-20℃冰箱冷藏備用。

        1.5.2 透皮吸收測(cè)定 將鼠皮固定在透皮吸收試驗(yàn)裝置的擴(kuò)散室與接受室之間,角質(zhì)層面向擴(kuò)散室,在接收室中注入生理鹽水接收液6.87 mL,使液面完全與皮膚內(nèi)層接觸,分別在擴(kuò)散池內(nèi)分別加2 mL酶解前和酶解后的哈蟆油蛋白溶液(100 mg/mL),加樣平衡30 min后開(kāi)始計(jì)時(shí),開(kāi)啟電磁恒溫?cái)嚢杵?,溫?7±2℃,100 r/min恒速攪拌,分別于1、2、4、6、8、10、12、24、30 h和36 h從接收池中取樣0.3 mL,同時(shí)補(bǔ)加0.3 mL生理鹽水并排盡氣泡。采用Lowry法測(cè)定不同時(shí)間透皮液中蛋白多肽含量,按上文色譜條件測(cè)定各樣品中相對(duì)分子質(zhì)量,根據(jù)公式(2)計(jì)算透皮率。

        式中,Y為透皮率(%);Cn—第n個(gè)取樣點(diǎn)測(cè)得的蛋白多肽濃度,mg/mL;Ck—第n個(gè)取樣點(diǎn)前所有取樣點(diǎn)相對(duì)應(yīng)測(cè)得的蛋白多肽濃度,mg/mL;Vn—接收液體積,mL;Vk——第n個(gè)取樣點(diǎn)前所有取樣點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的取樣體積,mL;m—原樣品中蛋白質(zhì)的質(zhì)量,mg。

        2 結(jié)果

        2.1 哈蟆油蛋白多肽相對(duì)分子量測(cè)定結(jié)果

        從圖1可以看出,哈蟆油蛋白酶解前后主要有2個(gè)色譜峰,5.015 min和10.812 min,相對(duì)應(yīng)的分子質(zhì)量分別為1147 kDa和6.8 kDa。分子質(zhì)量為1147 kDa的色譜峰峰面積百分比從酶解前的75.36%降到8.83%,而6.8 kDa的色譜峰峰面積百分比從酶解前的14.27%增加到74.49%。雙酶法制備的哈蟆油蛋白多肽相對(duì)分子質(zhì)量小于10 kDa約占91%,表明此條件下哈蟆油蛋白已大部分酶解為小分子多肽。

        圖1 哈蟆油蛋白酶解前后HPLC圖

        2.2 哈蟆油蛋白多肽黏度分析結(jié)果

        哈蟆油蛋白多肽粘度測(cè)定結(jié)果如圖2,隨著對(duì)哈蟆油處理的變化,哈蟆油蛋白多肽提取液濃度增高,哈蟆油蛋白多肽溶液的黏度越低。采用檸檬酸浸泡36 h后哈蟆油黏度最大為5278.85 mPa·s(1.0 g/100 mL);依次加入胃蛋白酶和堿性蛋白酶后,哈蟆油蛋白的黏度由酶解前2215.09 mPa·s(3.8 g/100 mL)降為酶解后12.56 mPa·s(7.0 g/100 mL)。表明哈蟆油中高分子量的蛋白質(zhì)在胃蛋白酶-堿性蛋白酶酶解之后相對(duì)分子質(zhì)量降低,黏度也明顯降低。

        圖2 哈蟆油蛋白多肽提取液黏度分析(±s,n=3)

        2.3 哈蟆油蛋白透皮吸收分析結(jié)果

        2.3.1 透皮率結(jié)果 透皮率測(cè)定結(jié)果如圖3,隨著時(shí)間的不斷延長(zhǎng),哈蟆油蛋白酶解前后透皮率均不斷增加,在相同透皮時(shí)間下,酶解后樣品透皮率均高于酶解前樣品,酶解前樣品在6 h時(shí)后透皮率趨于平緩,最高為4.50%;酶解后樣品在12 h時(shí)后透皮率趨于平緩,最高為9.14%,哈蟆油蛋白酶解后多肽比酶解前的蛋白透皮率增加了103.11%。

        圖3 酶解對(duì)哈蟆油蛋白透皮率的影響(±s,n=3)

        2.3.2 透皮液中哈蟆油蛋白多肽相對(duì)分子量測(cè)定結(jié)果從圖4可以看出,隨著透皮時(shí)間的增加,各吸收峰峰高明顯增加,表明透皮液中哈蟆油蛋白多肽濃度越來(lái)越高。從圖5結(jié)果可以看出,分子量1069 kDa、0.958 kDa和0.165 kDa蛋白多肽的色譜峰隨著透皮時(shí)間的含量顯著增加;7 kDa和2.46 kDa蛋白多肽色譜峰隨著透皮時(shí)間的增加含量降低;而分子質(zhì)量2.97 kDa蛋白多肽色譜峰隨透皮時(shí)間的增加在6 h達(dá)到含量最大,之后含量顯著降低。透皮時(shí)間為36 h時(shí),0.958 kDa蛋白多肽含量最高為39.44%,其次是0.165 kDa蛋白多肽和2.46 kDa蛋白多肽,分別占22.65%和13.34%。

        圖4 酶解后樣品透皮液中哈蟆油蛋白多肽HPLC圖

        圖5 不同透皮時(shí)間透皮液中哈蟆油蛋白多肽分子量分布(±s,n=3)

        3 討論

        3.1 雙酶法法制備哈蟆油蛋白多肽

        哈蟆油中含有高分子量的膠原蛋白和高度糖基化的黏蛋白,二者易吸水而膨脹形成不溶于水且黏度很大的水凝膠,通常采用蛋白酶酶解的方法降低黏度和增加水溶性。張梅等[11]比較了堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶酶解后哈蟆油蛋白黏度的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶對(duì)哈蟆油酶解作用最好,能明顯降低其黏度。周光新等[7]采用正交試驗(yàn)優(yōu)選胰蛋白酶酶解哈蟆油蛋白的工藝,最佳工藝條件為檸檬酸pH 4.5,料液比為1:100(g:mL),浸提時(shí)間為12 h,胰蛋白酶與底物比為1:100(g/g),酶解時(shí)間為12 h,分子量小于5 kDa的蛋白質(zhì)約占52.73%。劉詩(shī)超等[10]采正交實(shí)驗(yàn)研究堿性蛋白酶法制備哈蟆油蛋白酶解物,酶用量120 U/g,酶解溫度65℃,酶解時(shí)間40min,酶解后的哈蟆油由最初黏度3127 mPa·s降為8.86 mPa·s。董穎等[9]采用胃蛋白酶和堿性蛋白酶雙酶法制備哈蟆油蛋白多肽,酶解條件為按酶與底物比1:2000加胃蛋白酶酶解2 h后,加堿性蛋白酶(酶與底物比1:100)酶解6 h,酶解后哈蟆油蛋白多肽分子量小于5 kDa占94.85%。吳恒杰[12]采用正交試驗(yàn)優(yōu)選哈蟆油酶解的工藝,先后采用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和風(fēng)味酶制備哈蟆油酶解液,得到較高蛋白質(zhì)水解度的產(chǎn)品。綜合上述的研究結(jié)果,胃蛋白酶和堿性蛋白酶雙酶法為最佳制備哈蟆油蛋白多肽的方法。張梅等[13]考察了影響哈蟆油黏度的主要因素,發(fā)現(xiàn)pH偏酸或偏堿、料液比大于1:800(g:mL)、鹽濃度高于200 mmol/L和加熱時(shí)間4 h以上能顯著降低哈蟆油黏度,黏度從1300 cp多降低到50 cp。哈蟆油在偏酸或偏堿性條件下發(fā)生了水解,高分子量的糖蛋白降解為水溶性的蛋白質(zhì);高溫水加熱時(shí),蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)被破壞,使疏水基團(tuán)暴露在分子表面,包裹在其中的水分子被破壞,隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng),氫鍵被破壞,哈蟆油蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞,鎖水能力降低[13-14]。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中(圖2),水煮后的哈蟆油蛋白分子量仍特別高,主要在1147 kDa左右;然后采用胃蛋白酶和堿性蛋白酶先后進(jìn)行酶解,其中胃蛋白酶為一種酸性蛋白酶,最適pH 2~3之間,傾向于剪切氨基端或羧基端為芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)或亮氨酸的肽鍵;而堿性蛋白酶的最適pH 9~11之間,它可水解肽鍵、酰胺鍵和酯鍵。從圖2可以看出哈蟆油通過(guò)兩種蛋白酶酶解后,1147 kDa的色譜峰峰面積百分比從酶解前的75.36%降到8.83%,而6800 kDa的色譜峰從酶解前的14.27%增加到74.49%,黏度由酶解前的2215.09 mPa·s降至酶解后12.56 mPa·s。通過(guò)熱解和酶解后哈蟆油中蛋白質(zhì)分子斷裂,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞,使疏水集團(tuán)暴露在外,鎖水能力減弱,水分子被釋放從而使其黏度下降。

        3.2 哈蟆油蛋白多肽透皮作用

        皮膚分為表皮層和真皮層,一般影響皮膚透過(guò)率的主要屏障是位于表皮最外層的角質(zhì)層,主要因素包括親脂性、疏水性、水合作用、分子量大小等[15-16]。一般情況下,皮膚是選擇性透過(guò)分子量小,脂溶性好的成分。Zhang等[17]體外研究膠原蛋白的透皮作用中發(fā)現(xiàn),5~13 kDa的蛋白多肽易透過(guò)皮膚,起到保濕和抗氧化的作用。Cooperman和Johnsen[18]報(bào)道1~3 kDa的膠原蛋白水解物能透過(guò)皮膚或毛囊;進(jìn)而修復(fù)內(nèi)源性膠原蛋白和彈性蛋白纖維[19,20]。本文的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量小于1 kDa的蛋白多肽或氨基酸透過(guò)率最高,而7~2.46 kDa的蛋白多肽也能透過(guò)皮膚(圖4和圖5),可能是由于哈蟆油蛋白多肽中高含量的帶正電荷的精氨酸(含量為14.26%)[21,22],極性氨基酸(蘇氨酸、絲氨酸、酪氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸和谷氨酸)占56.21%和疏水性氨基酸(丙氨酸,纈氨酸,亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和脯氨酸)占38.72%的氨基酸組成特點(diǎn)[23],酶解后富含以上氨基酸的蛋白多肽易透過(guò)皮膚而被吸收。

        4 結(jié)論

        哈蟆油含有天然活性成分,安全、營(yíng)養(yǎng)將越來(lái)越受到人們的青睞,其產(chǎn)品具有極大的市場(chǎng)潛力。本研究采用胃蛋白酶-堿性蛋白酶雙酶制備哈蟆油蛋白多肽,分子量低,黏度小,水溶性好。通過(guò)體外透皮實(shí)驗(yàn),分子量小于1 kDa的小分子多肽能透過(guò)皮膚,其次是分子量小于2.46 kDa的蛋白多肽,哈蟆油蛋白多肽的透皮率為9.14%。雙酶法制備的哈蟆油蛋白多肽易于透過(guò)皮膚。本研究為哈蟆油的化妝品開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

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