錢葉飛，陸林玲，張華鋒，蔡雪萍（蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，江蘇 蘇州 215104）

小兒咳喘靈口服液由麻黃、金銀花、板藍根、甘草、苦杏仁、石膏和瓜蔞7 味中藥組成，具有宣肺清熱、止咳祛痰平喘的功效，臨床上廣泛用于治療上呼吸道感染、咳嗽、支氣管炎、肺炎等病癥，是兒科常用的中成藥之一[1-3]。經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站查詢，目前小兒咳喘靈口服液生產(chǎn)廠家有85 家，涉及85 個批準文號，質(zhì)量標準主要收載于中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第四冊（WS3-B-0689-91）[4]，但該標準只有方中石膏與麻黃的理化鑒別，無薄層色譜鑒別及含量測定項，質(zhì)量標準簡單，專屬性不強，無法全面控制該類制劑的質(zhì)量，而對制劑中多指標含量控制是中藥質(zhì)量標準的大勢所趨，也是中藥現(xiàn)代化的必然要求。

目前文獻多采用HPLC 法分析小兒咳喘靈口服液中相關中藥的主要成分[5-12]，為節(jié)約時間成本，加快檢驗進度，本文建立了UPLC 雙波長法同時測定板藍根的活性成分（R，S）-告依春，金銀花的活性成分綠原酸，苦杏仁的活性成分苦杏仁苷及甘草的活性成分甘草苷和甘草酸共5 個成分的含量，可較全面反映小兒咳喘靈口服液的質(zhì)量；同時對不同廠家樣品的質(zhì)量特征分析，為小兒咳喘靈口服液質(zhì)量控制提供更多的數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試藥

Waters Acquity H-Class UPLC 超高效液相色譜儀[二極管陣列檢測器（PDA）、Empower 3 化學工作站（美國Waters 公司）]；電子天平（瑞士梅特勒托利多公司）；Millipore Synergy 超純水機（美國密理博公司）。

（R，S）-告依春、綠原酸、甘草苷、苦杏仁苷對照品（批號分別為111753-201706、110753-201716、111610-201607、110820-201607；純度分別為100%、99.3%、93.1%、90.7%）（中國食品藥品檢定研究院）；甘草酸對照品（批號為MUST-17060805，純度為99.65%，成都曼思特生物科技有限公司）。乙腈為色譜純；水為純化水；其他試劑均為分析純。

59 批小兒咳喘靈口服液樣品均為市售，來自于6 個廠家，具體信息見表1。

表1 59 批小兒咳喘靈口服液樣品Tab 1 Samples of 59 batches of Xiaoer Kechuanling oral liquid

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相，線性洗脫梯度（0～4.5 min，5%～6%A；4.5～12.0 min，6%～20%A；12.0～17.0 min，20%～30%A；17.0～21.0 min，30%～45%A；21.0～22.0 min，45%～90%A；22.0～24.0 min，90%A；24.0～24.1 min，90%～5%A；24.1～26.0 min，5%A）；體積流量0.3 mL·min－1；柱溫：35℃；檢測波長：207 nm（苦杏仁苷）、237 nm [（R，S）-告依春、綠原酸、甘草苷和甘草酸]；進樣量：1 μL。

2.2 混合對照品溶液的制備

?。≧，S）-告依春、甘草酸、甘草苷、苦杏仁苷和綠原酸對照品10.83、9.27、10.88、11.80、10.07 mg 置于10 mL 量瓶中，加入50%甲醇溶解并定容至刻度，分別制得含（R，S）-告依春1.0830 mg·mL－1、甘草酸0.9238 mg·mL－1、甘草苷1.0129 mg·mL－1、苦杏仁苷1.0703 mg·mL－1和綠原酸1.0000 mg·mL－1的對照品溶液儲備液。分別精密吸取對照品儲備液各2 mL 置于20 mL 量瓶中，定容至刻度，制得含（R，S）-告依春108.3000 μg·mL－1、綠原酸99.9951 μg·mL－1、甘草酸92.3756 μg·mL－1、甘草苷101.2928 μg·mL－1和苦杏仁苷107.0260 μg·mL－1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取本品10 mL，置20 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，超聲處理（功率250 W，頻率33 kHz）30 min，放冷，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備

按小兒咳喘靈口服液質(zhì)量標準規(guī)定中處方的藥材比例及生產(chǎn)制備工藝，分別制備缺板藍根、苦杏仁、甘草、金銀花的陰性樣品口服液。按“2.3”項下方法操作，分別制成缺板藍根、缺苦杏仁、缺甘草、缺金銀花的陰性樣品溶液。

2.5 含量測定

2.5.1 專屬性試驗 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各1 μL，注入液相色譜儀，按照“2.1”項下色譜條件進行測定。結(jié)果缺板藍根、缺金銀花、缺苦杏仁、缺甘草陰性樣品在對照品相應保留時間處無明顯色譜峰，表明陰性樣品對測定無干擾，該方法專屬性良好（見圖1）。

圖1 小兒咳喘靈口服液UPLC 色譜圖Fig l UPLC chromatogram of Xiaoer Kechuanling oral liquid

2.5.2 線性關系考察 精密吸取“2.2”項下的混合對照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL，分別置于10 mL 量瓶中，用50%甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，按“2.1”項下的色譜條件，分別進樣，記錄各組分的峰面積。以峰面積Y為縱坐標，質(zhì)量濃度X為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程以及相關系數(shù)。結(jié)果表明5 種有效成分的線性關系均良好（見表2）。

表2 線性關系考察Tab 2 Linearity

2.5.3 精密度試驗 精密吸取同一批供試品溶液（批號：171206），連續(xù)進樣6 次，結(jié)果（R，S）-告依春、綠原酸、甘草苷、甘草酸、苦杏仁苷5個成分峰面積的RSD分別為1.4%、0.11%、1.2%、0.38%、0.21%，均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一批供試品溶液（批號：171206），分別于0、6、12、18、24 h 進樣測定。結(jié)果（R，S）-告依春、綠原酸、甘草苷、甘草酸、苦杏仁苷的峰面積RSD分別為1.2%、1.2%、0.39%、0.90%、1.5%，均小于3.0%，表明供試品溶液24 h 內(nèi)較為穩(wěn)定。

2.5.5 重復性試驗 精密稱取同一批口服液樣品（批號：171206）6 份，按“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，進樣測定，結(jié)果（R，S）-告依春、綠原酸、甘草苷、甘草酸、苦杏仁苷5 個成分的峰面積的RSD分別為2.0%、0.22%、0.20%、0.41%、0.38%，均小于3.0%，表明該方法的重復性良好。

2.5.6 加樣回收試驗 取已知含量的同一批口服液樣品（批號：171001），精密量取9 份，（R，S）-告依春每份0.5 mL，綠原酸、甘草苷、甘草酸、苦杏仁苷每份5 mL，分別精密加入低、中、高濃度水平的對照品溶液，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，計算回收率，結(jié)果（R，S）-告依春低、中、高濃度的平均加樣回收率分別為103.3%、97.2%、96.2%，RSD分別為0.97%、0.74%、0.66%；綠原酸低、中、高濃度的平均加樣回收率分別為103.4%、97.1%、99.2%，RSD分別為0.69%、0.51%、1.1%；甘草苷低、中、高濃度的平均加樣回收率分別為101.1%、98.5%、99.6%，RSD分別為2.1%、1.3%、0.82%；甘草酸低、中、高濃度的平均加樣回收率分別為99.5%、97.2%、99.1%，RSD分別為2.2%、1.7%、0.49%；苦杏仁苷低、中、高濃度的平均加樣回收率分別為97.5%、96.3%、97.8%，RSD分別為0.71%、0.53%、1.9%。

2.5.7 耐用性試驗 本試驗考察了Waters Acquity BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），Waters Acquity HSS T3柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）兩種色譜柱，各組分均能夠達到比較理想的分離效果，表明該方法耐用性良好。

2.6 樣品含量測定

對6 個生產(chǎn)廠家的59 批小兒咳喘靈口服液樣品按“2.2”項下方法制備樣品，按“2.1”項下色譜條件進行測定，每個樣品平行2 份，計算5個成分的含量，結(jié)果見表3。

表3 59 批小兒咳喘靈口服液中5 個成分的含量(n ＝2，mg·L－1)Tab 3 Content of 5 constituents in 59 batches of Xiaoer Kechuanling oral liquid (n ＝2，mg·L－1)

2.7 不同廠家之間離散程度直觀分析

分別對6 個廠家多批次樣品各成分的含量范圍進行統(tǒng)計，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示所測5 個成分在所有批次樣品中均可檢出，但不同廠家之間的含量差異較大，廠家3 各成分的含量均較其他廠家較低。

表4 不同廠家小兒咳喘靈口服液5 種成分含量范圍(mg·L－1)Tab 4 Content range of 5 components of Xiaoer Kechuanling oral liquid from different manufacturers (mg·L－1)

對大于等于5 批次的生產(chǎn)廠家的所有批次樣本進行統(tǒng)計，計算其平均含量及RSD，以對各廠家樣本的批間一致性進行評估，結(jié)果見表5。由表5可知，小兒咳喘靈口服液不同廠家樣品中綠原酸、甘草苷和苦杏仁苷含量高低順序均為廠家5 ＞廠家2 ＞廠家1 ＞廠家4 ＞廠家3，（R，S）-告依春含量高低順序為廠家1＞廠家4＞廠家2＞廠家5 ＞廠家3，甘草酸含量高低順序為廠家2 ＞廠家1 ＞廠家5 ＞廠家4 ＞廠家3；5 種指標成分的均值均為廠家3 最低；此外各廠家5 種指標成分的批間差異亦較為明顯。

表5 不同廠家小兒咳喘靈口服液成分均值及RSD (mg·L－1)Tab 5 Mean ingredients and RSD of Xiaoer Kechuanling oral liquid from different manufacturers (mg·L－1)

2.8 單因素方差分析

為進一步客觀分析不同生產(chǎn)廠家樣品間差異，本實驗運用SPSS 18.0 軟件，采用單因素方差分析對所有樣本的主要成分含量[（R，S）-告依春、綠原酸、甘草苷、甘草酸、苦杏仁苷]差異進行統(tǒng)計分析。經(jīng)分析，樣品數(shù)據(jù)不具有方差齊性特點，因此選擇了Tamhane’s T2（基于t檢驗的多重比較）檢驗，結(jié)果見表6。由表6可知，小兒咳喘靈口服液中（R，S）-告依春，廠家1與廠家3，5，6 之間均存在顯著差異，廠家3 與廠家4，5 之間具有顯著差異，廠家4 與廠家5，6 之間具有顯著差異，廠家5，6 之間具有顯著差異；綠原酸，廠家3 與廠家1，2，4，5 均存在顯著差異，廠家4 與廠家1，2，3，5 間存在顯著差異，廠家6 與其余各廠家質(zhì)量接近；甘草苷，廠家5 與其余各廠家均存在顯著差異，廠家3 與廠家1，2，4 均存在顯著差異，廠家4 與廠家1，2 間存在顯著差異；甘草酸，廠家3 與廠家1，2，4，5 均存在顯著差異，廠家4 與廠家1，2，5 間存在顯著差異；廠家6 與廠家2 間質(zhì)量差異較大；苦杏仁苷，廠家2 與廠家1，5 之間無顯著差異，廠家4 與廠家6 之間無顯著差異，其余廠家間均具有顯著差異。整體認為，廠家3 和廠家4 分別與其他廠家之間都具有顯著差異。從成分來說，不同廠家之間的顯著性主要體現(xiàn)在苦杏仁苷和甘草苷上。

表6 小兒咳喘靈口服液Tamhane’s T2 檢驗Tab 6 Tamhane’s T2 test of Xiaoer Kechuanling oral liquid

3 討論

3.1 含量測定有效成分的選擇

麻黃為小兒咳喘靈口服液的君藥，但因其主要成分麻黃堿和偽麻黃堿具有揮發(fā)性，提取方法與其他成分不同，且普通的C18色譜柱對麻黃堿與偽麻黃堿的分離效果不佳[13-14]，故對制劑中麻黃的質(zhì)量評價需另行開展；而石膏、瓜蔞的主要成分尚不明確，故本試驗選擇板藍根、苦杏仁、甘草和金銀花4 味藥材的指標性成分作為該制劑的檢測分析對象。

3.2 檢測波長的選擇

本試驗采用二極管陣列檢測器在200～400nm 波長進行掃描考察，并結(jié)合2015年版《中國藥典》，以吸光度大小和分離度作為指標，最終選定237 nm 和207 nm 雙波長進行檢測。

3.3 小結(jié)

本試驗主要對6 個廠家共59 批次的小兒咳喘靈口服液中5 個指標成分的含量進行了測定并統(tǒng)計分析。從含量測定結(jié)果及RSD的結(jié)果可以看出，不同廠家和同一廠家不同批次生產(chǎn)的小兒咳喘靈口服液5 種成分含量差異均較大，質(zhì)量參差不齊，可能受藥材的產(chǎn)地、采收季節(jié)、生產(chǎn)工藝等因素的影響，亦可能與目前質(zhì)量標準中缺乏對其相關指標進行控制有關[15]，因此加強對指標成分的控制對于規(guī)范投料，提升藥品品質(zhì)尤為重要。此外，通過對各廠家的批間差異進行統(tǒng)計分析，反映出各廠家批間差異較大，這也是未來藥品生產(chǎn)過程中應該關注的問題。開展嚴格的投料控制和生產(chǎn)過程控制將有利于改善這一問題，這也是從根本上實現(xiàn)市售產(chǎn)品質(zhì)量控制，提高藥品安全性、有效性的可行路徑。