張雷，陶倩倩，朱彥*（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)組分中藥國家重點實驗室，天津 300193；2.天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院中藥新藥研發(fā)中心，天津 300457）

中藥發(fā)揮藥效具有多組分、多途徑、多靶點協(xié)同作用等特點，基于中醫(yī)理論的藥物配伍規(guī)律使中藥的基礎(chǔ)研究更為復(fù)雜。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的發(fā)展為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和藥理毒理學(xué)研究提供了強大的工具[1]。從分子水平預(yù)測出中藥調(diào)控疾病的潛在靶點，使后續(xù)的具體機制研究有的放矢。蛋白組學(xué)等新興的組學(xué)技術(shù)，可從整體水平、全面地呈現(xiàn)中藥有效成分進入機體后發(fā)揮的多途徑、多靶點調(diào)控過程，揭示中藥復(fù)雜組分的藥理毒理學(xué)機制[2]。

藥理毒理學(xué)研究通常以動物模型為基礎(chǔ)，實驗周期長，成本高[3]。其優(yōu)勢在于以模型動物整體評估中藥的藥效或毒性，具有系統(tǒng)性和整體性。然而，模型動物不能完全模擬人體的生理病理狀態(tài)，難以精準(zhǔn)反應(yīng)藥物-機體關(guān)系。傳統(tǒng)的藥物測試因考慮到研發(fā)成本、可操作性及可擴展性大多是用2D 細(xì)胞培養(yǎng)方法進行[4]。然而，越來越多的證據(jù)表明，與2D 細(xì)胞模型相比，3D 細(xì)胞模型在蛋白質(zhì)表達(dá)、藥物反應(yīng)、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞遷移等方面有很大差異[5]。在3D 模型中，由于細(xì)胞存在于立體空間中，增強了細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-細(xì)胞基質(zhì)之間的相互作用，因此可以更好地在體外模擬人體內(nèi)生理微環(huán)境。與細(xì)胞自聚體、微流控模式下的3D 細(xì)胞模式不同的是，3D 生物打印技術(shù)可以對細(xì)胞及生物材料實現(xiàn)更加精確的控制，使其圖案化、異質(zhì)化，從而更加接近復(fù)雜的生物器官。

3D 生物打印技術(shù)是3D 打印技術(shù)的延伸，可以在三維立體空間中使物料精確沉積從而構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)[6]。3D 打印最早是在1986年由Charles W.Hull.命名為“立體平版印刷術(shù)”提出，描述為使用紫外光固化的材料的薄層按順序?qū)訉哟蛴?，形成固體的3D 結(jié)構(gòu)。3D 生物打印技術(shù)是基于增材制造技術(shù)結(jié)合生物墨水（包括水凝膠、細(xì)胞、生長因子）來構(gòu)建3D 體外環(huán)境[7]。

在過去十年中，大量的3D 生物打印技術(shù)被開發(fā)出來用于廣泛的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，如高通量藥物篩選、病理機制分析、代謝模型建立及個體化的器官修復(fù)。本綜述討論了構(gòu)建可用于個性化藥物篩選和疾病建模的功能組織模型所需的生物打印技術(shù)和生物材料的選擇，重點關(guān)注了生物打印的癌癥、肝臟組織及心臟組織模型，因為它們在中藥藥物發(fā)現(xiàn)、藥理和毒理機制研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 生物墨水的選擇

3D 生物打印技術(shù)的發(fā)展得益于不斷涌現(xiàn)的3D 技術(shù)應(yīng)用以及生物材料發(fā)明。生物材料即生物墨水，被稱為細(xì)胞負(fù)載流體材料，具有細(xì)胞外基質(zhì)成分，且可以被加載到3D 打印機中以制造組織狀構(gòu)造[8]。生物材料應(yīng)該包括幾個特征，如機械彈性和強度、高孔隙率（允許營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣和廢物運輸）、生物功能化、生物可降解性、生物相容性等[9]。理想的可打印生物墨水必須具有適當(dāng)?shù)男阅?，以確保打印后保持其結(jié)構(gòu)和細(xì)胞活性。水凝膠是目前最常見的生物墨水，根據(jù)其來源可分為自然衍生的水凝膠（即天然水凝膠）和合成來源的水凝膠。自然衍生的水凝膠如海藻酸鹽、明膠、纖維蛋白等具有較好的生物相容性，但在力學(xué)性能上存在局限性。而合成來源的水凝膠如聚乙二醇（PEG）及其衍生物、聚乙烯醇（PVA）和聚丙烯（PP）等具有很好的力學(xué)性能，但缺乏對細(xì)胞黏附和遷移至關(guān)重要的錨定位點[10]。因此，可以將天然水凝膠進行化學(xué)改性以獲得具有更好性能的多材料生物墨水[11]。例如甲基丙烯酸酐酰化明膠（GelMA），其特點是結(jié)合明膠的細(xì)胞生物相容性和甲基丙烯?；煞仲x予的機械強度，可為細(xì)胞活動提供良好的環(huán)境。

1.1 天然水凝膠

在天然水凝膠中，膠原和明膠含有Arg-Gly-Asp（RGD）基序[12]，這種結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞附著，因此被廣泛應(yīng)用于3D 打印中。明膠是由膠原水解得到的，具有在低溫下形成物理交聯(lián)水凝膠的能力，并在25～40℃時融化?；谶@種特性，明膠很少單獨使用，經(jīng)常和其他水凝膠如藻酸鹽一起使用。Fantini 等[13]將6%海藻酸鈉和4%明膠混合凝膠在不同的溫度和打印壓力下測試神經(jīng)元細(xì)胞，結(jié)果表明在25℃、45～70 kPa 時，SHSY5Y 神經(jīng)元細(xì)胞表現(xiàn)出良好的細(xì)胞表型。由于明膠的溶膠-凝膠特性，明膠常作為犧牲材料來構(gòu)建中空結(jié)構(gòu)。Lee 等[14]將膠原前體和混有內(nèi)皮細(xì)胞的明膠做成類三明治結(jié)構(gòu)，將明膠完全包裹在內(nèi)，之后置于37℃培養(yǎng)箱中除去明膠以形成中空管路，并將其置于特殊設(shè)計的聚碳酸酯流動室中來提供剪切力，模擬血管結(jié)構(gòu)。

海藻酸鹽也是常用的天然水凝膠，由于其無毒、生物可降解、無免疫原性、價廉易得而被廣泛使用[15]。基于海藻酸鹽生物墨水的黏度取決于海藻酸鹽濃度、分子量及細(xì)胞密度，在使用時需要調(diào)整其黏度來適應(yīng)不同的打印方法。海藻酸鹽可與多價陽離子（如Ca2＋）實現(xiàn)快速膠凝。Khalil等[16]利用1.5%（W/V）海藻酸鈉和0.5%（W/V）CaCl2制造網(wǎng)格化結(jié)構(gòu)以支持內(nèi)皮細(xì)胞增殖。Xu等[17]通過將含有細(xì)胞的CaCl2溶液逐層打印到海藻酸鈉-膠原復(fù)合物中，創(chuàng)建了具有多細(xì)胞類型的三維異質(zhì)結(jié)構(gòu)。海藻酸鹽水凝膠也與其他水凝膠一起合用來增強生物墨水性能。Chen 等[18]開發(fā)了一種海藻酸鹽/明膠的互穿聚合網(wǎng)絡(luò)用于體外3D 細(xì)胞培養(yǎng)和器官生物打印。研究采用雙交聯(lián)模式，即Ca2＋交聯(lián)海藻酸鹽、轉(zhuǎn)谷酰胺酶（TG）交聯(lián)明膠分子，改善了海藻酸鹽/明膠水凝膠的保水性、硬度、結(jié)構(gòu)完整性以及細(xì)胞生物相容性。通過調(diào)節(jié)交聯(lián)順序，可以實現(xiàn)長期的SH-SY5Y 細(xì)胞體外培養(yǎng)。

1.2 半合成水凝膠

基于天然水凝膠的化學(xué)改性也豐富了生物墨水的選擇。GelMA 是一種半天然水凝膠，可通過明膠的甲基丙烯酸化合成，具有熱敏性和光敏性。GelMA 的特點是將明膠的生物相容性與甲基丙烯?；煞值慕宦?lián)性和機械強度相結(jié)合[19]，成為一種新的三維生物打印生物材料。Liu 等[20]利用微連續(xù)光學(xué)打印技術(shù)（μCOP）制造了各種基于GelMA的體外診斷支架，通過精準(zhǔn)固化，成功制造了GelMA 懸臂用于體外心肌細(xì)胞的拉力測試。盡管較低濃度的GelMA 對于細(xì)胞狀態(tài)是有利的，但對于維持其沉積后的三維結(jié)構(gòu)提出了挑戰(zhàn)。Liu 等[21]利用同軸噴嘴裝置將海藻酸鹽鞘作為核心GelMA的模板，隨后進行紫外交聯(lián)以固定結(jié)構(gòu)。Xie 等[22]采用相同思路，制備了外球形內(nèi)纖維絲結(jié)構(gòu)，為異質(zhì)性組織的體外構(gòu)建提供了新思路。

1.3 合成水凝膠

由于天然水凝膠的機械強度不夠，科學(xué)家們對合成水凝膠進行了大量的探索。PEG 是一種線性聚合物，因其水中溶解性好而成為用于細(xì)胞封裝的常用材料。單獨的PEG 不能形成水凝膠的3D 網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，需要與其他生物材料合用或化學(xué)改性來使用。Wu 等[23]通過優(yōu)化聚乳酸（PLA）、PEG 和Pluronic F127 的不同配比，開發(fā)了具有良好的流變、力學(xué)性能的半固態(tài)黏性生物墨水。Valot 等[24]為改善PEG 的溶膠-凝膠特性，以雙硅烷化聚乙二醇為模板水凝膠，篩選不同的親核催化劑催化凝膠過程，來獲得最佳的水凝膠性能。

2 3D 生物打印的主要方法

2.1 3D 生物打印的設(shè)計思路

生物打印的三維結(jié)構(gòu)因應(yīng)用場景不同而設(shè)計成不同形式。2014年Murphy 將不同設(shè)計思路歸納為3 種：即生物仿生、自主自組裝和微組織[6]。生物仿生模式的生物打印包括對組織或器官的細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的三維打印[25]。這種方法需要精確的微尺度復(fù)刻以及對打印對象微環(huán)境的深入了解。例如體外腫瘤模型的建立，Cao 等[26]開發(fā)了一種帶有血管和淋巴管的體外腫瘤模型，并進行了多比柔星（DOX）的藥物傳遞和藥效研究，實驗證明帶有灌注和排出微循環(huán)系統(tǒng)的MCF-7 乳腺癌細(xì)胞模型體現(xiàn)出了更加真實的藥物傳遞，為未來更加高效的藥物篩選提供了可能。Lee 等[27]利用自由可逆嵌入的懸浮打印模式使用膠原支架準(zhǔn)確地復(fù)制了由微型計算機斷層掃描得到的心臟解剖結(jié)構(gòu)。此外，該實驗還證明了印有心肌細(xì)胞的心室出現(xiàn)了生理效應(yīng)，如同步收縮、定向動作電位傳遞等。自主自組裝模式與由胚胎器官發(fā)育形成的生物組織過程有關(guān)。形成組織前的早期細(xì)胞成分，需要依靠自身生產(chǎn)的細(xì)胞外基質(zhì)成分、細(xì)胞信號及自主組織和圖案化，形成所需的微生物結(jié)構(gòu)和功能[28]。Langer 等[29]通過整合多細(xì)胞類型產(chǎn)生了特定無支架腫瘤體外模型并觀察到了間質(zhì)細(xì)胞表型的改變，包括細(xì)胞外基質(zhì)沉積、內(nèi)皮細(xì)胞自主圖案化為類血管網(wǎng)絡(luò)等。微組織，也稱功能構(gòu)建塊，用于重現(xiàn)組織中最小組織的結(jié)構(gòu)和功能。例如片上器官（organ-on-a-chip），可以用于疾病建模、藥物篩選、藥理機制研究等。如Homan 等[30]在體外打印出了3D 人腎近端小管模型，在灌注條件下保持了兩個月以上，可以為藥物活性篩選、體外毒理研究提供工具。

2.2 3D 生物打印的技術(shù)方法

為了實現(xiàn)上述構(gòu)想，主要的打印方法有3 種：噴墨打印、微擠出打印和激光輔助打印[31]。噴墨生物打印機可以在X、Y、Z 三維空間中精確提供受控體積的液體。其主要優(yōu)點為成本低、分辨率高、打印速度快、與多種生物材料兼容。其應(yīng)用的主要限制為可打印材料黏度低（通常為低于10 CP）、需要液相材料來生成液滴、可打印細(xì)胞濃度低等。此外，噴墨打印還可以通過改變液滴密度或大小在3D 結(jié)構(gòu)中引入其他細(xì)胞、材料或具濃度梯度的生長因子[32]。微擠出生物打印機通過氣動或機械系統(tǒng)控制材料擠壓和沉積到基底來執(zhí)行高分辨率3D 結(jié)構(gòu)。微擠壓體系允許使用高黏度材料，具有剪切變稀特性的材料也被用于微擠出應(yīng)用。微擠出系統(tǒng)的高分辨率使生物印刷能夠精確地重現(xiàn)CAD 軟件設(shè)計的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，并促進多細(xì)胞類型的圖案化。微擠出打印的主要優(yōu)點在于可以沉積含高密度的細(xì)胞生物墨水，從而為構(gòu)建組織工程提供條件。相對的，微擠壓技術(shù)由于高剪切力而無法保證高細(xì)胞存活率。激光輔助生物打印技術(shù)（LAB）不常見，其工作原理為使用聚焦的激光脈沖在光能量吸收層上產(chǎn)生高壓氣泡，將含有細(xì)胞的生物墨水推向收集器。由于LAB 無噴嘴設(shè)備，因此可以滿足具有高細(xì)胞密度、高分辨率和廣泛材料黏度范圍的需求，而細(xì)胞存活率和功能損失可以忽略不計[33]。相對的，應(yīng)用LAB 打印技術(shù)需要快速的膠凝才可以達(dá)到圖案保真度[34]。盡管現(xiàn)有的技術(shù)對于精準(zhǔn)重現(xiàn)人體組織、器官還有很大差距，但仍然涌現(xiàn)出很多新技術(shù)、新材料、新應(yīng)用來克服困難。在其他綜述中描述了諸多技術(shù)，如立體光刻（SLA）、數(shù)字光處理（DLP）用來建立3D 構(gòu)造[35-36]。生物打印的最終目的是建立仿生的體外結(jié)構(gòu)，從而為疾病建模、藥物篩選、藥理毒理機制研究、再生醫(yī)學(xué)提供工具。為了滿足不同的需要選擇最佳的打印條件，包括細(xì)胞來源、生物墨水、打印設(shè)備、結(jié)構(gòu)設(shè)計等。

3 3D 生物打印技術(shù)在藥理和毒理學(xué)中的應(yīng)用

藥物研發(fā)在臨床早期實驗因其毒性面臨強大的挑戰(zhàn)（淘汰率高達(dá)60%）[37]，很重要的原因在于沒有很好的臨床前模型來用于藥物發(fā)現(xiàn)和臨床前實驗[38]。中藥的現(xiàn)代化研究進程已經(jīng)得到極大的提升，提取分離方法的升級和優(yōu)化使中藥單體更加容易被分離和富集[39]；組學(xué)（基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)）的出現(xiàn)和應(yīng)用也使中藥復(fù)雜組分研究更為系統(tǒng)、更加全面、更為細(xì)微[40]。然而，與化學(xué)藥品相同，中藥藥理毒理學(xué)測試中也面臨生理/疾病模型的失真，不能正確反映藥物對人體的作用。盡管傳統(tǒng)的2D 細(xì)胞培養(yǎng)仍然是藥物篩選中的主要方法，但由于單層細(xì)胞模型的表型與正常生理狀態(tài)的細(xì)胞表型相似性較差，使得三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在藥代動力學(xué)/藥效學(xué)（PK/PD）建模、生物標(biāo)志物識別、安全信號的早期解析和藥物靶標(biāo)驗證方面的發(fā)展和應(yīng)用受限[41]。3D 生物打印技術(shù)允許細(xì)胞直接圖案化，避免了方法中將細(xì)胞種植到預(yù)制支架中由于細(xì)胞分布相對不受控制而導(dǎo)致的潛在的細(xì)胞聚集效應(yīng)。此外，3D 生物打印可以容納不斷增長的具有機械可調(diào)和生化特性的生物材料庫，相對于傳統(tǒng)的圖案化技術(shù)（如微接觸打印/微模塑），具有顯著簡化制造、快速迭代和增加維度等特點[42]。

雖然選擇合適的生物打印技術(shù)、生物材料和細(xì)胞的組合對于復(fù)雜組織的發(fā)展至關(guān)重要，但最終的目標(biāo)仍然是建立具有適當(dāng)物理、化學(xué)和生物特征的生理相關(guān)微環(huán)境[6]。對于藥物篩選、靶標(biāo)驗證等應(yīng)用，3D 生物打印技術(shù)為生成器官的微生理最小功能單位提供一種獨特的方法，而不需要重建整個系統(tǒng)來模擬藥物反應(yīng)、疾病狀態(tài)和潛在疾病治療作用[43]。檢索文獻，總結(jié)經(jīng)藥測試可以得到理想結(jié)果的仿生模型，可指導(dǎo)其今后在中藥工作中更好的應(yīng)用。下文將介紹3D 生物打印技術(shù)在建立癌癥、肝臟、心臟的生理模型，以及它們在藥理毒理學(xué)實驗中的應(yīng)用。

3.1 癌癥模型

根據(jù)世界衛(wèi)生組織最近的一份報告，因癌癥致死占據(jù)全球死亡總數(shù)的1/6[44]。盡管標(biāo)準(zhǔn)抗癌治療策略已經(jīng)取得進展，但由于患者之間和患者內(nèi)部的腫瘤異質(zhì)性導(dǎo)致效果各異。腫瘤的異質(zhì)性導(dǎo)致腫瘤增殖率、侵襲力、藥物敏感性和預(yù)后在個體間存在顯著差異[45]。因此，迫切需要建立一個高保真的臨床前癌癥模型，以便在基礎(chǔ)研究中篩選出更加有效的特異性藥物，并實現(xiàn)精準(zhǔn)的個性化的臨床治療。

3D 生物打印技術(shù)的進步使我們在體外復(fù)制腫瘤微環(huán)境（TME）中有了更好的工具。TME 是高度復(fù)制和異質(zhì)性的，其特征包括機械刺激、生化梯度、幾何線索、組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞-細(xì)胞/基質(zhì)相互作用[46]。腫瘤細(xì)胞可以影響局部TME，導(dǎo)致基質(zhì)細(xì)胞類型的增殖和活化。然后，基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生反饋，為腫瘤細(xì)胞提供有助于致癌表型的信號，包括增殖、遷移和耐藥性[47]。腫瘤之間或腫瘤內(nèi)不同TME 也有助于腫瘤間和腫瘤內(nèi)的表型異質(zhì)性和不同的藥物反應(yīng)[48]。Langer 等[29]使用3D 生物打印機將多種細(xì)胞類型整合到具有特定結(jié)構(gòu)的無支架腫瘤組織改進模型中。在實體腫瘤結(jié)構(gòu)的組織模型中，以腫瘤細(xì)胞為核心，周圍充滿負(fù)載基質(zhì)細(xì)胞的可調(diào)水凝膠，可提供前期腫瘤發(fā)展所需的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）。在腫瘤組織成熟過程中，觀察到間質(zhì)隔室的改變，包括ECM 沉積、內(nèi)皮細(xì)胞形成網(wǎng)絡(luò)等，概括了體內(nèi)TME 特征。3D 生物打印可以實現(xiàn)多種細(xì)胞共培養(yǎng)以及構(gòu)建與體內(nèi)相似的組織結(jié)構(gòu)，此模型可以評估復(fù)雜微環(huán)境對癌細(xì)胞增殖能力的影響。與2D 細(xì)胞模型相比，實驗發(fā)現(xiàn)生物打印組織對抗腫瘤藥物阿霉素、紫杉醇、吉西他濱具有更高的耐藥性。此外該模型可以使用不同的細(xì)胞類型來模擬不同的腫瘤亞型和間質(zhì)類型，并允許在復(fù)雜的微環(huán)境中對患者來源的細(xì)胞進行建模。盡管細(xì)胞自組裝模式允許形成自分泌ECM，但是與水凝膠支架相比耗時較長。Swaminathan 等[49]使用不同配制的水凝膠作支架，對比了有無預(yù)制腫瘤球體對紫杉醇的耐藥性，證明了3D 生物打印預(yù)制腫瘤微球可以快速創(chuàng)建體外腫瘤模型。

球體腫瘤模型雖然可以再現(xiàn)腫瘤的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，但它們通常缺乏腫瘤所經(jīng)歷的動態(tài)微環(huán)境，例如將藥物分子送至腫瘤位置所需的血液流動。在哺乳動物體內(nèi)，微循環(huán)系統(tǒng)根據(jù)血管的滲透和淋巴管吸收來維持間質(zhì)液體的動態(tài)平衡[50]。此外淋巴排除系統(tǒng)還為體內(nèi)抗腫瘤藥物提供優(yōu)先的循環(huán)途徑[51]。Cao 等[26]將3D 生物打印技術(shù)和微流控技術(shù)相結(jié)合，成功創(chuàng)建了具有生物打印的血管和淋巴管對的片上腫瘤（TOC-BBL）（見圖1a）。實驗研究了血管、淋巴管和腫瘤細(xì)胞不同的排列組合對抗腫瘤藥物阿霉素轉(zhuǎn)運的影響，表明具有雙通道系統(tǒng)的模型比其他情況下具有更高的轉(zhuǎn)運率，這提示了淋巴系統(tǒng)對抗腫瘤藥物的高清除率可以提高腫瘤的耐受劑量。此外，基于微流控技術(shù)的癌癥模型還可以通過模擬腫瘤區(qū)域的氧氣梯度分布[52]。Yi 等[53]在芯片上創(chuàng)建了一種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤類器官（GBMs-on-Chip），它結(jié)合了劃分的癌癥間質(zhì)結(jié)構(gòu)、氧氣梯度生成和腦脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)（BdECM）。這種高度的異質(zhì)性極大地促進了基底膜各種病理特征的出現(xiàn)。印有不同患者來源腫瘤細(xì)胞的GBMs-on-Chip，使用替莫唑胺（TMZ）的同步放化療（CCRT）后產(chǎn)生不同反應(yīng)，與臨床結(jié)果相匹配。此外，該模型在結(jié)合個人生物信息學(xué)分析的結(jié)果，可以成功篩選出最佳治療方案，為個性化腫瘤治療提供有力的工具。

3.2 肝臟模型

肝臟是人體重要的器官，為維持正常生命體征執(zhí)行很多功能，包括蛋白質(zhì)合成、異物代謝、膽汁生成和碳水化合物代謝等。由于肝臟在異物代謝和解毒中起至關(guān)重要的作用，因此肝臟毒性實驗是所有臨床前藥物研究的重要部分[54]。藥物性肝損傷（DILI）是臨床前和臨床藥物失敗、上市藥撤回及急性肝功能衰竭的主要原因[55]。盡管傳統(tǒng)中藥被認(rèn)為是“天然無毒”的，但事實上中藥藥物性肝損傷（TCM-ILI）在DILI 中占比已經(jīng)高達(dá)25.71%，且呈逐年上升的趨勢[56]。傳統(tǒng)的動物模型因無法真實捕捉人類肝臟毒性反應(yīng)而造成38%～51%的肝毒性藥物被忽略[57]，因此基于人源細(xì)胞的有效的體外肝臟模型是一種非常有力的，可作為理解疾病機制、篩選藥物的工具。

由于目前分離得到的肝癌細(xì)胞株表達(dá)非常低水平的藥物代謝酶，人們將焦點轉(zhuǎn)移到原代肝細(xì)胞（PHH）模型上，將之作為預(yù)測毒理學(xué)的金標(biāo)準(zhǔn)。PHH 模型在傳統(tǒng)2D 培養(yǎng)中迅速去極化而造成藥物代謝酶/藥物轉(zhuǎn)運蛋白喪失，阻礙了其在肝臟生理學(xué)和病理學(xué)中的研究及藥物新陳代謝和毒性研究中的有效性[58]。因此，有必要構(gòu)建更好的模擬人體環(huán)境并幫助維持體外肝功能的肝臟結(jié)構(gòu)。3D 生物打印技術(shù)具有對細(xì)胞和生物材料精確構(gòu)圖的潛力，是構(gòu)建新型體外肝臟模型的有力工具。Nguyen 等[59]建立了患者來源的肝細(xì)胞和非實質(zhì)性細(xì)胞（內(nèi)皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞）組成的具有特定結(jié)構(gòu)的人肝組織模型，結(jié)果表明，與2D 肝細(xì)胞培養(yǎng)相比，在持續(xù)培養(yǎng)4 周后，生物打印的肝臟模型仍可以維持ATP、白蛋白水平以及細(xì)胞色素P450 的表達(dá)和藥物誘導(dǎo)的酶活性，并成功將曲瓦沙星與其無毒的結(jié)構(gòu)類似物左氧氟沙星區(qū)分開來。此外，體外肝臟模型也可以用來模擬疾病的發(fā)生及藥理研究。Norona 等[60]使用3D 打印肝臟模型評估了庫普弗細(xì)胞（KCS）在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子β1和甲氨蝶呤誘導(dǎo)的早期纖維化損傷。

片上器官也被開發(fā)用于構(gòu)建體外肝臟模型。在微流控平臺上進行3D 生物打印的優(yōu)勢在于能夠創(chuàng)建開放的異構(gòu)微環(huán)境[61]。Li 等[62]結(jié)合3D 生物打印、微流控和細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)，提出高仿生的藥物篩選模型，即3DPF 模型。與2D 模型、普通3D 生物打印模型相比，3DPF 模型在抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒實驗中更為敏感，與小鼠單克隆抗體藥物的動物實驗結(jié)果較為相似。運用3D 生物打印技術(shù)創(chuàng)建的其他片上肝臟器官也可以檢測到對乙酰氨基酚造成的肝臟損傷[63-64]（見圖1b）?？傊?，這些研究表明，生物打印構(gòu)成了一種可以維持肝臟表型和功能的新興技術(shù)。然而，我們需要更加系統(tǒng)的評價以證明其在體外肝臟中具有藥物代謝和毒性預(yù)測的價值。體外肝臟模型的成熟將大大提高TCM-ILI 的評估效率和準(zhǔn)確度，為中藥安全用藥提供準(zhǔn)確預(yù)測，同時為靶向肝臟組織的中藥成分提供疾病建模和藥效評估。

3.3 心臟模型

藥物的心臟毒性也是上市后撤回的主要原因[65]。傳統(tǒng)的體外心臟毒性實驗通常缺乏天然3D細(xì)胞外微環(huán)境，導(dǎo)致心肌細(xì)胞非生理性排列，損害細(xì)胞-細(xì)胞/細(xì)胞外基質(zhì)的通信，因此得不到準(zhǔn)確的評估。目前亟需開發(fā)一種具預(yù)測性的人源細(xì)胞體外心臟模型，來取代缺乏人類轉(zhuǎn)化相關(guān)性的動物模型。原代心肌細(xì)胞因無法大量擴增而無法構(gòu)建體外模型。人源誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞（IPSC-CM）由于具有代表個體差異的潛力，成為眾多科學(xué)家的理想細(xì)胞源[66]。心臟中心肌細(xì)胞與3D 多層結(jié)構(gòu)中的微尺度特征相互作用，3D生物打印可以實現(xiàn)精確圖案化，使其微拓?fù)浜蜕€索促進細(xì)胞融合、排列以及組織結(jié)構(gòu)的生長和電各向異性，以模擬天然心肌的結(jié)構(gòu)和功能[67]。

Kumar 等[68]通過兩步交聯(lián)法保留人字形圖案，構(gòu)建了含有IPSC-CM 和心臟成纖維細(xì)胞（CF）的心肌細(xì)胞載體薄層。通過IPSC-CM 和CF的共培養(yǎng)及偶聯(lián)，對維持活體心臟壁的正常生理非常重要。目前開發(fā)的3D 體外心臟組織雖然為體外心肌細(xì)胞培養(yǎng)提供支架支持，但不能模擬多層排列的心肌以及組織力學(xué)特征，這成為建立用于藥學(xué)研究的體外心臟組織的阻礙。Liu 等[20]使用連續(xù)光學(xué)打印技術(shù)對GelMA 進行圖案化光固化，打印出懸臂系統(tǒng)，通過將GCaMP 鈣傳感器與3D打印懸臂系統(tǒng)配對，可以以非破壞方式同時評估心力和鈣瞬變，為藥物的發(fā)現(xiàn)及安全性評價提供有力工具。Zhang 等[69]提出一種混合策略，構(gòu)建內(nèi)皮化心肌芯片平臺（見圖1c）。通過打印技術(shù)制造出3D 內(nèi)皮細(xì)胞床，與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)，產(chǎn)生自發(fā)和同步收縮的排列好的心肌。隨后將其嵌入微流控灌注生物反應(yīng)器中，以實現(xiàn)長期灌流。使用此芯片平臺對不同濃度的阿霉素進行測試，結(jié)果顯示心肌結(jié)構(gòu)呈劑量依賴性地減弱搏動。

圖1 3D 生物打印構(gòu)建體外類組織模型Fig 1 Fabricating in vitro tissue-like models using 3D bio-printing technology

研究者還使用3D 生物打印技術(shù)建立了其他模型，如血管化、腎臟、肺部、腸道模型，為構(gòu)建體外人體系統(tǒng)作出有益探索[31，41]。體外仿生模型的發(fā)展將加速中藥的現(xiàn)代化進程，為中藥藥效評價、藥理機制研究、器官毒性評估提供有力工具。生物打印模型作為3D 細(xì)胞培養(yǎng)模型的一種，彌補了現(xiàn)有2D 細(xì)胞和動物模型的固有缺陷，為中藥藥物發(fā)現(xiàn)提供可靠的篩選模型。需要指出的是，盡管這些技術(shù)為藥物研究提供了新的方向，但目前仍然缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的分析方法來證明和量化3D打印生物模型對傳統(tǒng)模型的改進。此外，這些不同培養(yǎng)模型的分子表型表征不統(tǒng)一、測試藥物不統(tǒng)一等局限導(dǎo)致難以對它們進行橫向比較。

4 3D 生物打印技術(shù)在中藥研究中的可期應(yīng)用

3D 生物打印技術(shù)具有精確定位生物材料和活細(xì)胞、重建復(fù)雜結(jié)構(gòu)的能力，可用于疾病建模和藥物篩選。目前尚無報道將3D 生物打印技術(shù)應(yīng)用到中醫(yī)藥研究領(lǐng)域中。但我們相信應(yīng)用3D 生物打印技術(shù)將會加速中醫(yī)藥在藥物篩選、機制研究、毒性評估方面的發(fā)展（見圖2）。中醫(yī)治療著重整體觀念、辨證論治。3D 生物打印技術(shù)及其他新生技術(shù)（如微流控技術(shù)）的應(yīng)用，可以使對中藥的研究不局限于對單個細(xì)胞、單個器官的反應(yīng)。使用微流控技術(shù)可以將多個3D 仿生器官集成到一個芯片，實現(xiàn)藥物對不同器官反應(yīng)的全面監(jiān)測，滿足中藥多組分、多靶點的特點，更好、更全面地揭示中藥作用機制。此外，人源原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和多能干細(xì)胞的應(yīng)用也使個性化醫(yī)療成為可能。Yi 等[53]使用患者來源腫瘤細(xì)胞快速構(gòu)建了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤芯片，結(jié)合臨床個人生物學(xué)分析，篩選出最佳治療方案，實現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療。具體地說，3D 生物打印技術(shù)在中藥藥理毒理學(xué)研究中具有以下優(yōu)勢：

圖2 3D 生物打印技術(shù)在復(fù)方中藥研發(fā)中的應(yīng)用前景Fig 2 Application prospect of 3D bio-printing technology in the research and development of compound Chinese medicine

第一，中藥中存在數(shù)以千計的成分，3D 生物打印技術(shù)可以重復(fù)、高效地制造細(xì)胞微球模型，在實現(xiàn)高通量藥物篩選的同時又可使實驗結(jié)果更加可靠，實現(xiàn)對復(fù)雜中藥成分的藥理毒理學(xué)的初步認(rèn)知。

其次，具有潛在藥效（毒性）成分的中藥可以在具有仿生結(jié)構(gòu)的3D 生物打印模型進行藥物機制研究，以進一步揭示藥物對器官、組織的效應(yīng)。

第三，與微流控技術(shù)結(jié)合制造的多組織類器官仿生系統(tǒng)，可以更加全面地展現(xiàn)不同器官之間的藥物反應(yīng)以及給藥后不同效應(yīng)器官之間的相互作用，也可使需要生物代謝（如肝臟代謝）的前藥得到研究。此外，基于人體系統(tǒng)的仿生芯片也可模擬中藥的體內(nèi)代謝過程，為中藥安全劑量研究提供工具。

第四，可以快速制造仿生體成型的3D 生物打印技術(shù)也可以為臨床治療提供指導(dǎo)。患者來源的原代細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（IPSC）經(jīng)打印快速形成體外類器官，用于不同治療策略的中藥組方治療，從而得到最優(yōu)的中藥治療方案，闡釋中醫(yī)藥的同病異治、異病同治的精準(zhǔn)個性化治療，為中醫(yī)藥辨證論治提供科學(xué)依據(jù)。

5 評價及展望

3D 生物打印技術(shù)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用將大大加快新藥研發(fā)和臨床醫(yī)療技術(shù)變革的進程。在臨床方面，3D 生物打印技術(shù)結(jié)合計算機斷層掃描（CT）、磁共振成像（MRI）和超聲（US）等影像技術(shù)構(gòu)建立體的患者個性化病灶組織模型，利于復(fù)雜的病理組織展示，方便專家決策和學(xué)生教學(xué)[70]。此外，3D 生物打印的組織模型還可以在術(shù)前模擬、手術(shù)計劃、術(shù)中指導(dǎo)中發(fā)揮積極作用[71]。由于生物材料安全性、生物相容性等諸多因素影響，3D 生物打印組織模型還不能直接用于臨床器官移植，大多數(shù)的研究集中于用于藥物研發(fā)的體外組織模型的構(gòu)建。

單一的生物材料很難滿足當(dāng)前復(fù)雜的體外組織模型設(shè)計。為了開發(fā)功能性和仿生類組織結(jié)構(gòu)，需要異質(zhì)化的多生物材料來進行組織重塑。此外，生物支架的功能化改性也是獲得理想組織模型的重要途經(jīng)[72]。通過對材料進行物理、化學(xué)修飾獲得復(fù)雜組織打印所需要的生物墨水的特性，包括可打印性、生物相容性、生物可降解性及良好的物理機械性能。脫細(xì)胞技術(shù)也為生物支架材料提供更多可能。動物來源的脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)（dECM）支持細(xì)胞的分化和成熟，同時保留部分生長因子，保存了器官特異性細(xì)胞分化的線索[73]。4D 生物打印技術(shù)通過利用生物材料對各種類型的刺激響應(yīng)造成形狀變化的特征，賦予圖案化結(jié)構(gòu)按需轉(zhuǎn)化的能力。4D 生物材料的發(fā)展為制造具有按需、動態(tài)、可控形狀的復(fù)雜結(jié)構(gòu)創(chuàng)造了新的可能。

3D 生物打印技術(shù)提供了高通量開發(fā)活性三維組織的能力，結(jié)合先進的自動化光學(xué)檢測分析技術(shù)（如高內(nèi)涵）等，將大大提高中藥藥物篩選的效率。易于制造的標(biāo)準(zhǔn)化異質(zhì)化的微球模型有利于藥物測試的前期大規(guī)模篩選階段，適當(dāng)?shù)募?xì)胞與材料組合將使藥物-細(xì)胞的正確反應(yīng)有效率大大提高。此外，與微流控技術(shù)結(jié)合，制造出多器官組織聚合的芯片系統(tǒng)，也是3D 生物打印在中藥藥理毒理學(xué)應(yīng)用的另一個重要方向。利用微流控芯片將具有微生理功能的類器官連接起來，用來模擬某個生理系統(tǒng)，甚至整個人體系統(tǒng)的重現(xiàn)。這種片上器官（片上人體）有利于中醫(yī)藥理論中的“整體觀念”的研究和闡釋，使中藥治療多組分、多途徑、多靶點的特點集中展現(xiàn)。目前，還沒有足夠的證據(jù)證實3D 生物打印模型在藥物研究中具備與動物體內(nèi)模型藥理毒理作用的一致性[74]。但隨著3D 生物打印技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，其最終會成為藥物發(fā)現(xiàn)、機制研究、精準(zhǔn)醫(yī)療提供強有力的工具，為中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展提供有力支撐。