張麗麗，孫巍，顧小盼，王萍，張磊，張莉華，章順楠，葉正良*（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津 01617；.天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司，天津 00410；.天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司，中藥先進(jìn)制造技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津 00410）

復(fù)方丹參滴丸（compound danshen dripping pills，CDDP）主要由丹參、三七的水提取物及冰片組成。具有活血化瘀，理氣止痛的功效[1-2]。近年來，基于心肌、血管及血液等方面對其進(jìn)行了廣泛研究[3-5]，確認(rèn)了其能有效治療冠心病、心絞痛、糖尿病、高血壓等疾病[6-8]。其中抗血小板聚集藥效活性作為防治心血管疾病藥物的重要指標(biāo)，一直是研究熱點[9-10]。

中藥及其制劑的多組分、多靶點、多通路特點及體內(nèi)復(fù)雜代謝過程使得中藥質(zhì)量控制一直是中藥國際化的難題。多年來，“找成分，測含量”作為常規(guī)的理化檢測手段應(yīng)用于中藥質(zhì)量控制，然而量而不準(zhǔn)、難控難評、難關(guān)藥效等系列問題仍比較突出[11]，為保證中藥的內(nèi)在質(zhì)量及其安全性和有效性，F(xiàn)DA 于2004年發(fā)布的《植物藥研發(fā)指導(dǎo)原則》也提出了明確的指導(dǎo)意見及開發(fā)要求[12]。單一成分含量與整體效價活性聯(lián)合并重，才能更好地把控中藥及其制劑的質(zhì)量，因此，譜效學(xué)研究應(yīng)運而生，成為了中藥質(zhì)控的重要手段。經(jīng)文獻(xiàn)報道，臨床藥理均已驗證了CDDP、丹參及三七藥材的抗血小板聚集藥效活性[13-14]。但CDDP抗血小板聚集藥效活性與各成分相關(guān)性尚未見文獻(xiàn)報道。CDDP 的主要成分為丹參中的多酚酸和三七中的多皂苷，兩者成分理化性質(zhì)差距較大，很難用一張色譜圖將其全部成分展示清楚[15]，基于此，本研究初步建立了CDDP 穩(wěn)定性樣品多酚酸指紋圖譜，利用譜效關(guān)系分析方法，對CDDP抗血小板聚集藥效活性酚酸類物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行研究，為CDDP“量-效”關(guān)系提供研究依據(jù)。

1 材料

1.1 CDDP 受試樣品

CDDP 受試樣品均由天津天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司提供。隨機(jī)抽取一批零時CDDP 樣品（批號：20190303），分裝成11 份，其中5 份在常溫貯存條件下（20℃，50%RH）分別貯存0、3、6、9、12 個月，剩余6 份在高溫加速條件下（30℃，65%RH）分別貯存1、2、3、6、9、12個月，將貯存后的11 批穩(wěn)定性樣品作為本研究考察樣本，樣本編號為S1～S11。

1.2 儀器與試藥

Waters Acquity UPLCTM液相色譜儀-串聯(lián)紫外檢測器（美國Waters 公司）；Chrono-Log 700-4 血小板聚集分析儀（北京世帝科學(xué)儀器有限公司）；LDZ5-2 低速自動平衡離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；XP205 電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；丹酚酸U（規(guī)格：20 mg/瓶，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：93.49%，批號：20151105）、丹酚酸T（規(guī)格：20 mg/瓶，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：93.66%，批號：20151106）、迷迭香酸（規(guī)格：20 mg/瓶，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.0%，批號：BCBN6363V）、丹酚酸B（規(guī)格：20 mg/瓶，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：92.24%，批號：20151110）、丹酚酸A（規(guī)格：20 mg/瓶，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：96.26%，批號：20151111）、丹參素鈉（規(guī)格：20 mg/瓶，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：97.75%，批號：20151112）、原兒茶醛（規(guī)格：20 mg/瓶，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：92.24%，批號：20151113）（天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司中藥所）；二磷酸腺苷（ADP，批號：3490，美國Chrono-Log 公司）；檸檬酸鈉（分析純，批號：20130815，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；0.9%氯化鈉注射液（批號：1907312009，石家莊四藥有限公司）。

1.3 實驗動物

SPF 級雌性日本大耳白兔，2.0～2.2 kg [北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號SCXK（京）2015-0005]。

2 方法與結(jié)果

2.1 CDDP 多酚酸指紋圖譜的建立

2.1.1 UPLC 色譜條件 色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）。流動相：0.05 mol·mL－1磷酸水溶液（A）-乙腈溶液（B），梯度洗脫：0～1.6 min，18%B；1.6～1.8 min，18%～20.8%B；1.8～6.1 min，20.8%～25%B；6.1～8.0 min，25%～35%B；8.0～8.5 min，35%～90%B；8.5～10.5 min，90%B；10.5～11.0 min，90%～7%B；11.0～12.0 min，7%B。流速：0.4 mL·min－1；柱溫：40℃；檢測波長：280 nm。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 分別稱取適量丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸U、丹酚酸T、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A 對照品，加入適量75%甲醇，搖勻，定容至100 mL 量瓶中，均制成質(zhì)量濃度約為0.1 mg·mL－1的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 稱取復(fù)方丹參滴丸0.25 g，精密稱定，置10 mL 量瓶中，加純化水約5 mL 超聲15 min，溶解，定容，過0.22 μm水膜，即得。

2.1.4 指紋圖譜的建立與分析 精密吸取2 μL對照品及供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣檢測，得11 批CDDP 穩(wěn)定性樣品UPLC 多酚酸指紋圖譜，見圖1；標(biāo)準(zhǔn)對照品圖譜見圖2。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》軟件對11 批CDDP 穩(wěn)定性樣品色譜峰進(jìn)行相似度評價，結(jié)果11 批穩(wěn)定性樣品相似度均大于0.99，詳見表1。11 批穩(wěn)定性樣品通過色譜峰比對，共指認(rèn)出10 個共有峰，經(jīng)與混合對照品比對和文獻(xiàn)查詢，確認(rèn)峰1～5，峰8～10 分別為丹參素、原兒茶醛、丹酚酸U、丹酚酸T、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A[16]，峰6、7 代表成分有待進(jìn)一步探究。以峰1 為參照峰，各色譜峰相對峰面積見表2。

表1 11 批CDDP 穩(wěn)定性樣品相似度評價結(jié)果Tab 1 Similarity evaluation of 11 batches of CDDP stability samples

表2 11 批CDDP 穩(wěn)定性樣品HPLC 指紋圖譜共有峰相對保留時間和相對峰面積Tab 2 Relative retention time and relative peak area of the common peaks in the HPLC fingerprints of 11 batches of CDDP stability samples

圖1 11 批CDDP 穩(wěn)定性樣品HPLC 多酚酸指紋圖譜Fig 1 HPLC polyphenolic acid fingerprint chromatogram of 11 batches of CDDP stability samples

圖2 混合對照品UPLC 圖Fig 2 UPLC chromatogram of mixed reference substance

2.2 CDDP 抗血小板聚集活性探究

2.2.1 待測血漿的制備 用3%戊巴比妥鈉對禁食16 h 以上的日本大耳白兔耳緣靜脈進(jìn)行麻醉，麻醉劑量1 mL·kg－1，完全麻醉后進(jìn)行腹腔主動脈采血，在全血中按9∶1加入3.8%枸櫞酸鈉抗凝劑，1000 r·min－1離心10 min，吸取上清液，即得待測富血小板血漿（PRP）。將分離完的PRP 以3000 r·min－1離心10 min 后取上清液，即得貧血小板血漿（PPP）。將PRP 和PPP 血漿敞口靜置30 min后，上樣檢測。血漿在4 h 檢測完畢。

2.2.2 ADP 溶液的制備 精密稱取ADP 粉末2.50 mg，加入0.9%NaCl 溶液3 mL，搖勻待其完全溶解，補(bǔ)加2 mL0.9%NaCl 溶液，即得ADP 儲備液（1 mmol·L－1）。取100 μL ADP 儲備液分裝于塑料EP管中，－80℃條件下儲存1年至試劑有效期。取100 μL ADP 儲備液加入生理鹽水700 μL 混勻即得ADP 工作溶液（125 μmol·L－1）。ADP 工作液遵循現(xiàn)用現(xiàn)配原則。

2.2.3 對照組溶液的制備 稱取丹酚酸B（SAB）粉末15 mg，精密稱定，置于1 mL 量瓶，加入適量0.9%NaCl 溶液溶解并定容，搖勻即得儲備液。用0.9%NaCl 稀釋配制成15.0、12.0、9.60、7.65、6.15、4.95、3.90、3.08 mg·mL－1的對照品溶液。

2.2.4 供試品溶液的制備 稱取復(fù)方丹參滴丸約1.4 g，精密稱定，置于10 mL 量瓶，加入適量0.9%NaCl 溶液震蕩溶解且定容，搖勻即得儲備液。用0.9%NaCl 稀釋配制成154.8、117.0、79.2 mg·mL－13 個濃度，即得供試品溶液。

2.2.5 CDDP 生物效價的測定 將血小板聚集分析儀預(yù)熱至37℃，取300 μL PPP 進(jìn)行基線調(diào)零，精密吸取274 μL PRP 和20 μL 不同濃度的藥液加入反應(yīng)杯中（空白組用20 μL 0.9%NaCl），放進(jìn)反應(yīng)通道孵育 5 min 后，調(diào)平基線，加入6 μL ADP 溶液，待各通道均出現(xiàn)最大聚集率后終止測定，記錄最大聚集率，計算出抑制率（%），平行測定3 次，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)分別繪制出SAB 和CDDP 的量效關(guān)系曲線，采用斜率比法求得相對效價值。最終效價結(jié)果為3 次測得平均數(shù)。結(jié)果顯示陽性藥丹酚酸B 及CDDP 均具有抗血小板聚集藥效活性，且在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系，相對效價值結(jié)果見表3。

表3 11 批CDDP 穩(wěn)定性樣品抗血小板聚集相對效價值(±s，n ＝3)Tab 3 Relative potency value of antiplatelet aggregation of 11 batches of CCDP stability samples (±s，n ＝3)

表3 11 批CDDP 穩(wěn)定性樣品抗血小板聚集相對效價值(±s，n ＝3)Tab 3 Relative potency value of antiplatelet aggregation of 11 batches of CCDP stability samples (±s，n ＝3)

批次 相對效價 批次 相對效價S1 0.1568±0.007 S7 0.1600±0.007 S2 0.1450±0.009 S8 0.1445±0.001 S3 0.1374±0.002 S9 0.1395±0.022 S4 0.1216±0.009 S10 0.1078±0.002 S5 0.1100±0.007 S11 0.0710±0.030 S6 0.1639±0.011

抑制率（%）＝（空白組聚集率－加藥組聚集率）/空白組聚集率×100%

相對效價＝KCDDP/KSAB

其中K為量效關(guān)系曲線斜率，CDDP 為復(fù)方丹參滴丸，SAB 為丹酚酸B。

2.3 譜效關(guān)系分析與物質(zhì)基礎(chǔ)確認(rèn)

2.3.1 偏最小二乘法（PLS）回歸分析 以抗血小板聚集相對效價值（Y）為因變量，共有峰峰面積（X）為自變量，采用SIMCA 14.0 軟件對11 批次穩(wěn)定性樣品進(jìn)行PLS 回歸分析，得標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)（見圖3A）與VIP（見圖3B），擬合出標(biāo)準(zhǔn)化回歸方程為：Y＝－0.07X1＋0.14X2＋0.10X3＋0.05X4＋0.14X5＋0.10X6＋0.11X7＋0.04X8＋0.13X9＋0.05X10，由回歸方程可以看出，抗血小板聚集藥效活性是由多種成分共同作用的結(jié)果。除1 號峰，其他9 個峰的標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)均大于零，說明其藥效活性與峰面積成正相關(guān)，即含量越高，抗血小板聚集藥效活性可能越大；1 號峰的標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)為負(fù)，說明該峰所對應(yīng)成分含量與藥效活性成負(fù)相關(guān)。

變量投影（VIP）被用于判斷單個自變量在解釋因變量時的重要性，VIP ＞1 時，自變量對因變量具有重要意義。由圖3B 可知，峰5、2、9、7、3 的VIP 值均大于1，且回歸系數(shù)均為正，說明這些峰所對應(yīng)的成分與藥效活性具有強(qiáng)關(guān)聯(lián)性，即成分含量越高，對抗血小板聚集藥效活性貢獻(xiàn)越大，對其抗血小板聚集藥效活性具有重要意義。

圖3 11 批CDDP 穩(wěn)定性樣品PLS 標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)圖（A）和自變量投影（VIP）值（B）Fig 3 PLS standardized regression coefficient（A）and the variable independent projection（VIP）values（B）of 11 batches of CDDP stability samples

2.3.2 Pearson 雙變量相關(guān)性分析 為了進(jìn)一步驗證分析結(jié)果，采用SPSS 23.0 軟件對共有峰峰面積與效價活性值進(jìn)行雙變量相關(guān)性Pearson 分析，結(jié)果見表4。從結(jié)果可以看出，峰5、2 代表成分與效價活性成強(qiáng)相關(guān)性（r＞0.8；P＜0.05，P＜0.01），峰9、7 代表成分與效價活性成中等相關(guān)（0.5 ＜r＜0.8；P＜0.05，P＜0.01）。

表4 11 批CDDP 穩(wěn)定性樣品譜效關(guān)系雙變量相關(guān)性分析Tab 4 Bivariate correlation of spectrum-effect relationship of 11 batches of CDDP stability samples

2.3.3 兩種分析方法結(jié)果綜合分析 通過對兩種分析方法結(jié)果的綜合分析，分析結(jié)果基本具有一致性。綜合兩種分析結(jié)果，篩選出VIP＞1且r＞0.8 的重疊峰分別是峰5 和峰2，即丹酚酸D、原兒茶醛，說明這兩個成分與抗血小板聚集效價活性具有強(qiáng)相關(guān)；峰9、7 代表成分與效價活性成中等相關(guān)（0.5 ＜r＜0.8；P＜0.05，P＜0.01），對抗血小板聚集效價活性均有不同程度的貢獻(xiàn)率，其余峰沒有顯著相關(guān)性。

3 討論

本研究建立了CDDP 多酚酸譜效關(guān)系分析方法，采用PLS 與雙變量相關(guān)分析方法對譜效關(guān)系進(jìn)行相互比較與佐證。結(jié)果表明多個酚酸類成分都對CDDP 抗血小板聚集活性有所貢獻(xiàn)，不同的酚酸成分對藥效活性貢獻(xiàn)率也不盡相同。其中丹酚酸D、原兒茶醛對其抗血小板聚集效價活性貢獻(xiàn)最大，其次是丹酚酸B、峰7 等成分，其他峰代表成分與效價活性暫未顯現(xiàn)出顯著相關(guān)性，有待進(jìn)一步考察及驗證?？寡“寰奂钚允荂DDP 治療心血管疾病眾多途徑之一，研究中所得出的部分與含量相關(guān)的酚酸類成分尚不能代表其整體活性評價成分，因此還需進(jìn)一步建立不同模型對其生物活性及其相關(guān)成分進(jìn)行多方面考察，健全評價方法，從而多方位評價其生物活性及產(chǎn)品質(zhì)量。

此外，本實驗前期在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上還建立了體外抗血小板聚集生物效價檢測方法及其標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，對標(biāo)準(zhǔn)對照品、藥液顏色、PRP 血漿濃度、PRP 血漿pH 值、ADP 濃度、血漿離心轉(zhuǎn)速、PRP 血漿穩(wěn)健性等條件進(jìn)行了考察，最終確定了最優(yōu)試驗條件[17]。其中標(biāo)準(zhǔn)對照品的選擇在植物藥生物效價檢測中具有重要意義，直接關(guān)乎到檢測結(jié)果的平行性與準(zhǔn)確性。最理想的標(biāo)準(zhǔn)對照品應(yīng)與檢測樣品同質(zhì)，且在一定濃度范圍內(nèi)，受試樣品可視為標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋或濃縮物。除此之外，對照品本身也要具備準(zhǔn)確、均一、穩(wěn)定的特點。由于植物藥成分的復(fù)雜性，目前在生物效價領(lǐng)域，對其標(biāo)準(zhǔn)對照品的選擇和制備均具有一定難度[18-19]。本研究相繼以阿司匹林、精氨酸阿司匹林、丹酚酸B 作為標(biāo)準(zhǔn)對照品做了考察，最終從溶解度、線性范圍、結(jié)果穩(wěn)定性等多角度綜合考慮，確定以丹酚酸B 作為本研究的標(biāo)準(zhǔn)對照品。

綜上所述，本實驗對CDDP 抗血小板聚集活性酚酸類成分的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了初步探究，為CDDP 量效關(guān)系提供了一定依據(jù)。而酚酸類成分主要來自其君藥丹參，尚未對三七中多皂苷成分的譜效關(guān)系進(jìn)行研究，因此本研究尚不能代表CDDP 抗血小板聚集活性的全部物質(zhì)基礎(chǔ)情況，更全面的物質(zhì)基礎(chǔ)仍有待進(jìn)一步探究。