張春燕，田亞平

解放軍總醫(yī)院醫(yī)學創(chuàng)新研究部 出生缺陷防控技術研究中心，北京 100853

孕前攜帶者篩查是阻止出生缺陷的一級預防措施。高通量測序技術在醫(yī)學領域的廣泛應用形成了可用于多基因攜帶者篩查的擴展性攜帶者篩查技術(expanded carrier screening，ECS)。ECS通過檢測多種基因，可以同時篩查幾十種、幾百種甚至上千種疾病，篩查效率大大提高。為此，自2008年以來美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會(ACMG)、美國婦產科學會(ACOG)等國際學術機構分別發(fā)布了近5項指南和指導意見、建議，對ECS的臨床應用進行推薦和指導[1-2]。國外相對較早開展了ECS工作和研究，近年來隨著高通量測序技術在國內的應用和普及，以及出生缺陷一級防控的迫切需要，國內臨床機構和第三方實驗室陸續(xù)開展ECS，本文總結了國內外ECS相關研究和工作，以期為ECS開展提供理論基礎。

1 單基因病致病基因攜帶

出生缺陷給患兒和家庭帶來極大的痛苦和負擔，出生缺陷兒中約30%在5歲前死亡，40%為終身殘疾。單基因病是出生缺陷重要病因之一，其單病種發(fā)病率低，但綜合發(fā)病率高，超過1/100(www.who.int)。在2018年公布的我國《第一批罕見病目錄》中單基因遺傳病就占到了大多數[3]。隨著基因技術臨床應用的發(fā)展，近年來每年新發(fā)現近100種新遺傳病。根據OMIM數據庫顯示，截止到2021年1月1日，明確的單基因病有8590種(www.omim.org/statistics/entry)，其中明確的常染色體和性染色體隱性遺傳病有1300多種[4]。在活產新生兒中，以隱性遺傳方式為主的遺傳代謝病(inborn errors of metabolism，IEM)的總體發(fā)病率高達1/500，且往往導致嚴重病情[5]。通過近30年我國IEM的篩查顯示，苯丙酮尿癥(phenylketonuria，PKU)和先天性甲狀腺功能減退癥(congenital hypothyroidism，CH)的發(fā)病率由之前的1/15930和1/6309升至1/11627和1/2032[6]，原因可能是新生兒篩查的普及使得我們能在更早期發(fā)現患兒，或強制婚檢取消而導致的出生缺陷一級預防方案和技術的缺乏[7]。在中國南方，出生缺陷的代表性疾病如地中海貧血是一種重要的隱性遺傳疾病，在廣西、海南、云南、廣東、貴州等南方省份其人群基因攜帶率達20%以上[8]。2019年，Coughlin等[9]報道了關于ALDH7A1基因變異導致吡哆醇依賴性癲癇的調研結果，通過數萬例數據的分析發(fā)現中國人群中吡哆醇依賴性癲癇的攜帶率高達1/66[7]。而之前這一疾病的發(fā)病率在臨床被嚴重低估。2015年，華大基因與歐洲最大輔助生殖中心Igenomix進行的623種隱性遺傳病攜帶者篩查研究表明，約84%(2161/2570)樣本攜帶至少一個致病突變；約5%(7/138)準備接受輔助生殖手術的夫婦檢出攜帶有同一遺傳病的致病基因突變；2%(6/287)女性受檢者檢出有X連鎖遺傳病的致病突變[10]。

導致隱性遺傳病發(fā)生率不斷升高的原因很多。研究數據表明，人群中約85%的個體可能是嚴重遺傳疾病的攜帶者，個體可攜帶隱性遺傳致病基因2～5個[11]，因此人類有較高的“遺傳負荷”，雖然攜帶者無疾病表型，但通過遺傳物質的組合和交換，將嚴重致病基因遺傳后代，使其具有患病的風險。隨著環(huán)境污染和人類生育方式的改變，基因的突變率也必將增加，而突變大多數是隱性的，這也將進一步提高人群的“遺傳負荷”，從而加重遺傳病對后代的危害。這些遺傳病給患者及其家庭帶來沉重的經濟、精神和社會負擔，已經成為嚴重影響我國出生人口質量和兒童健康的重要障礙。在孤兒藥和罕見病治療技術研發(fā)嚴重滯后的當前，患者也往往面臨“無藥可治”“有藥治不起”“治起買不到”的局面。因此最根本的解決方案是在源頭對疾病進行防控，減少出生缺陷的發(fā)生。

2 擴展性攜帶者篩查技術

攜帶者篩查是指通過在孕前或孕早期識別出攜帶有常染色體或X連鎖隱性遺傳病。近年來，多項國內外研究表明孕前針對高攜帶率隱性遺傳病的攜帶者篩查是阻止出生缺陷的重要一級預防措施，這一策略使得特定的遺傳疾病在高危人群中的發(fā)病率顯著下降。傳統的攜帶者篩查重點篩查種族高發(fā)疾病[12]，如1971年在德系猶太人中開展的Tay-Sachs病篩查，使其發(fā)病率降低90%[13]。隨著高通量測序技術的發(fā)展和應用，擴展了篩查病種，使得特定人群以及更多沒有家族史的普通人群能在孕前/產前進行多種疾病的篩查，也稱ECS[14]。2011年，Bell等[11]首次報道了采用高通量測序技術進行遺傳病攜帶者篩查，通過對104例無關個體進行448種兒童期嚴重隱性遺傳病篩查，發(fā)現人均攜帶2.8個致病突變。至此開啟ECS技術在臨床的應用。

高通量測序技術又稱新一代測序技術(next generation sequencing，NGS)，允許對數以百萬計的不同DNA片段混合物進行并行的深度測序，具有通量高、信息量大和敏感度高的特點，為個性化的診斷和治療帶來了巨大的突破，尤其是單基因遺傳病相關領域[15-16]。高通量測序DNA水平的應用通常分為全基因組測序、全外顯子組測序及目標基因測序。全基因組測序是獲得人類整個基因組信息，包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)序列，可以獲得大量的單核苷酸多態(tài)性位點(SNP)、拷貝數變異(CNV)、插入缺失(InDel)、結構變異(SV)等變異信息，是最全面的基因組分析手段，但如何面對產生的海量數據以及如何從中分析到真正與臨床和科研工作相關的信息并進行有效的轉化是目前最大的難題；外顯子是基因行使其功能最直接的體現，全外顯子組占全基因組的2%左右，外顯子組測序則是指利用序列捕獲技術將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進行高通量測序的基因組分析方法，得到的信息大多是與蛋白質功能變異相關的遺傳突變，更直接、更便捷地幫助臨床與科研工作；目標序列捕獲測序是將特定基因組區(qū)域定制成特異性探針與檢測樣本基因組DNA進行雜交，將目標區(qū)域的DNA片段進行富集后再利用高通量測序技術進行測序的策略，可以低成本、快速地檢測相關基因，進而提升檢測效率。

就單基因遺傳病來講，目標序列捕獲測序技術相對經濟實惠，針對疾病目標基因設計富集探針，針對性地檢測疾病致病基因位點的同時，降低了測序成本和檢測周期，為孕早期孕婦行產前診斷留出寶貴的時間[17]。

3 擴展性攜帶者病種選擇和基因包

2017年ACOG先后發(fā)布了兩個委員會意見(No.690，No.691)[1-2]。針對ECS制訂了標準共識，臨床檢測疾病、檢測對象和遺傳咨詢意見?！痘蚪M醫(yī)學時代的基因攜帶者篩查》(No.690)對攜帶者篩查基因包中包括的疾病，提出應符合以下幾點標準[1]：1)攜帶頻率≥1%；2)有定義明確的表型；3)嚴重影響生活質量，造成認知和軀體損害，需要手術或醫(yī)療干預；4)在生命早期發(fā)?。?)疾病可產前診斷，得以產前干預而改善圍生結局；可制訂個體化分娩管理措施，以改善新生兒和嬰兒的結局；對父母進行產后特殊護理的培訓；6)不應包含成人發(fā)病的疾病。在《遺傳病攜帶者篩查》(No.691)指南對受檢對象提出指導意見[2]：1)應為每一名孕婦提供遺傳病攜帶篩查的相關信息；2)攜帶者篩查和咨詢最好在懷孕前進行；3)如果受檢者發(fā)現為某種疾病的攜帶者，受檢者的配偶應該進行相關檢測以便了解夫妻生育患兒風險的信息，進行遺傳咨詢；4)建議夫妻雙方同時篩查，以保證有充裕的時間進行產前診斷；5)有某種遺傳病家族史的受檢者應該提供針對該種疾病的攜帶者篩查，并進行遺傳咨詢；6)產前攜帶者篩查不能替代新生兒篩查，而新生兒篩查也不能取代產前攜帶者篩查的價值；7)如果受檢者要求對某種特殊疾病進行攜帶者篩查，而這種疾病可以通過現有檢測技術實現且合理，考慮其種族和家族遺傳史，經過遺傳咨詢該檢測的風險、獲益和局限性后，可為受檢者提供該檢測。

2017年8月，ACOG委員會發(fā)表《找尋構建臨床有效的擴展性攜帶者篩查Panel的中間地帶》評論，提出了擴展性攜帶者篩查基因Panel的具體標準，并選出符合篩查標準的96種疾病[18]。2018年有文章總結了34篇關于ECS的報道，Panel包含病種41～1792種，包含基因40～1556種，其中只有3種隱性疾病同時包含在16種Panel中[19]。這說明ECS病種選擇需要基于特定的人群和疾病發(fā)生率。

2017年，美國Counsyl公司的Beauchamp通過474644個ECS受檢者數據，分析攜帶率及聚集性，對檢測基因及相應的檢測方法進行了系統優(yōu)化[20]。2019年，Guo和Gregg[21]收集Gnom AD數據庫中123136個外顯子的數據，針對415例嚴重隱性遺傳疾病開展相關基因在不同人群中攜帶率的研究，發(fā)現32.6%(東亞)～62.9%(德系猶太人)的個體是至少一個基因的變異攜帶者，而對于夫婦來說，將有0.17%～2.52%的夫婦有可能生育疾病后代，僅篩選攜帶者率大于1.0%的40個基因就能識別出76%以上的高危夫婦。這兩項研究為篩選適合不同種族人群ECS覆蓋的疾病和基因，提供了一定的參考。

目前，基于中國人群的ECS數據比較有限。2019年Zhao等[22]對中國34個種族的10476對產前/受孕夫婦進行了12個基因(包含11種孟德爾疾病)的攜帶者篩查，結果表明多疾病攜帶者篩查可替代傳統的單病種篩查，主張擴大篩查病種。Xi等[23]對1462對(2923人)需要進行輔助生殖的夫婦開展了202個基因(121個常染色體隱性疾病和14個X連鎖疾病)的ECS檢測，結果表明ECS對于輔助生殖具有重要的臨床效用，其數據也為中國人群ECS基因Panel選擇提供了一些啟示。

2020年澳大利亞的一項10000對夫婦的ECS研究，提出基因Panel選擇標準應是兒童期致死或致殘疾病，和(或)早期診斷和干預將大大改變疾病預后，同時有強有力的基因表型關系證據[24]。ECS基因Panel的選擇是一個動態(tài)過程，需要不斷進行審查和完善。同年，Kristjan等[25]對93419個來自不同種族的個體進行96個基因的ECS檢測，Westemeyer等[26]對381014個體進行了274個基因的ESC數據分析，兩篇研究均提出，針對種族和家族史的傳統攜帶者篩查設計不足以滿足日益多樣化的多元文化群體，多病種同時篩查的ECS臨床應用將成為出生一級防控重要手段。

4 擴展性攜帶者篩查的臨床應用策略

隨著ECS在臨床的需求日漸強烈，在出生缺陷一級防控中如何正確規(guī)范應用ECS被提上日程。ACMG、ACOG、美國圍產兒保護基金會(PQF)、美國遺傳咨詢協會(NSGC)、美國母胎醫(yī)學協會(SMFM)、加拿大醫(yī)學遺傳學學院(SOMCCCMG)、皇家學院婦產科(RCOG)、國際產前診斷學會(ISPD)等多個專業(yè)學術組織先后發(fā)表關于高通量測序技術在孕前/產前進行遺傳病攜帶者篩查的指南和聲明建議[4,27]，肯定了擴展性攜帶者篩查的意義，對遺傳咨詢和臨床應用等提出指導意見。

檢測前需要知情告知，使患者了解檢測技術優(yōu)點和局限性；檢測后需要遺傳咨詢，針對檢測結果做出解讀。大多數情況下，ECS僅報告已知明確的致病(P)和可能致病位點(LP)，而對不確定位點(VUS)的報告比較謹慎，除非其同時攜帶P或LP位點[23]。一方面，告知患者其攜帶VUS可能會產生不必要的焦慮，因為大多數VUS最終被確定為非疾病引起的[10]。另一方面，VUS不能被完全忽略，因為其中一些具有致病性，尤其在夫妻雙方同時攜帶的情況下，需要遺傳咨詢師對各種證據進行評估后進行報告和咨詢。早孕期ECS篩查對于醫(yī)療機構而言，后續(xù)的遺傳咨詢和產前診斷要求較高，壓力較大。

目前，ECS技術臨床應用策略主要包括針對普通備孕人群的篩查、針對具有生育風險(如有家族史)人群的篩查以及針對不孕不育人群的篩查。國際上報道的ECS研究多集中與普通備孕人群和不孕不育人群。在我國，目前尚缺乏針對不同分層人群的系統研究，因此難以評判ECS臨床應用的最適宜策略。

在臨床實際應用中，針對接受篩查夫妻的檢測方案、檢測時間、后期對檢測結果的遺傳咨詢和輔助生殖方案的設計，是當前決定ECS是否能夠在臨床落實和推廣應用的關鍵。同時ECS還受檢測時效性、衛(wèi)生經濟學、倫理等諸多因素的影響。

ECS不僅需要臨床醫(yī)師和遺傳學家的參與，也同樣需要政府、政策、醫(yī)療救治以及社會救助的支持。2020年，Singer和Sagi-Dain[28]報道了以色列2015-2017年國家衛(wèi)生部組織的18個基因的攜帶者篩查，篩查例數919820，數據顯示，在政府的支持下，幾年后攜帶者篩查確實有效降低了以色列出生缺陷率，如囊性纖維化疾病從1990年的14.9%降低至6%等。Shen等[29]在文章中建議，在國內ECS的應用過程中，為了降低風險，提高獲益率，應該廣泛聯合政府、醫(yī)學遺傳學相關學會、醫(yī)學相關學會、醫(yī)療機構以及社會救助機構的力量，建立ECS工作組，使得這項工作系統化和規(guī)范化。因此，ECS臨床的實際應用可以通過綜合考量政策支持、本地醫(yī)療機構的醫(yī)療過程、醫(yī)療技術等因素后得出最適宜的方案。