李奉瑾，姚欣雨，張玉萍

2012 年《出生缺陷防治報告》指出，我國出生缺陷發(fā)生率為5.6%[1]。據(jù)統(tǒng)計染色體病占出生缺陷遺傳性疾病的80%以上[2]，是由染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)目異常導(dǎo)致的疾病。其中多數(shù)染色體數(shù)目異?？蓪?dǎo)致流產(chǎn)和死胎，僅少部分三體和性染色體異?？纱婊?，而染色體缺失、重復(fù)等結(jié)構(gòu)異常，特別是微缺失微重復(fù)結(jié)構(gòu)異常所引起的疾病，在出生缺陷疾病中占很大比例。此類患兒智力低下、發(fā)育遲緩、多系統(tǒng)性畸形[3-4]，目前臨床尚無有效治療措施，給家庭和社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔(dān)。

染色體核型分析技術(shù)是產(chǎn)前診斷的金標準，其實驗周期長，不能檢測5 Mb 以下的拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNVs）。Wapner 等[5]研究發(fā)現(xiàn)在3 822 例核型正常的標本中，2.5%（96/3 822）存在致病或可能致病CNVs。Wang 等[6]對3 398 例羊水樣本檢測發(fā)現(xiàn)，3%（102/3 398）的樣本存在致病性拷貝數(shù)變異（pCNVs），其中0.97%（33/3 398）CNVs 片段小于5 Mb。目前臨床上用于CNVs 檢測的技術(shù)是染色體微陣列分析技術(shù)（chromosomal microarray analysis，CMA），其分辨率高，可檢測核型分析無法檢出的微缺失和微重復(fù)，常用于檢測產(chǎn)前超聲異常但核型分析正常的胎兒[7]，已成為國外推薦的一線檢測方法。但是CMA 的芯片探針設(shè)計有限，導(dǎo)致其對pCNVs 陽性檢出率較低[8]，而且其通量低、成本高的特點限制了在我國的廣泛應(yīng)用，不能緩解我國產(chǎn)前診斷供給不足的壓力。隨著分子診斷技術(shù)的發(fā)展，低深度全基因組測序技術(shù)（copy number variation sequencing，CNV-seq）可實現(xiàn)對產(chǎn)前染色體微缺失、微重復(fù)的檢測，檢測成本較CMA 低，通量高，為臨床提供了新的檢測手段。

1 CNV-seq 技術(shù)原理及特點

CNV-seq 技術(shù)基于下一代測序技術(shù)，采用邊合成邊測序的原理，對樣本DNA 進行全基因組水平的檢測，將測序結(jié)果與參考基因組進行比對，進行生物學(xué)分析以發(fā)現(xiàn)受檢樣本的CNVs。與其他技術(shù)相比，CNV-seq 技術(shù)具有以下優(yōu)勢：①對樣本DNA 量需求低，最低僅需10 ng DNA，在產(chǎn)前診斷樣本的檢測具有顯著優(yōu)勢；②操作簡便，自動化水平高，檢測周期短，不需要進行細胞培養(yǎng)，可減少實驗導(dǎo)致的誤差；③檢測范圍廣，可對全基因組CNVs 進行檢測，分辨率精確至100 kb；④通量高，一次可上機檢測70～80 個樣本，有效緩解我國產(chǎn)前診斷供給不足的狀況；⑤CNV-seq 檢測與無創(chuàng)DNA 篩查（noninvasive prenatal testing，NIPT）可聯(lián)合上機，同時使用同一臺高通量測序儀，節(jié)省了實驗室成本。但其也有一些局限性，CNV-seq 無法檢測單親二倍體、三倍體、多倍體、染色體平衡易位或倒位，也無法檢測單個堿基突變導(dǎo)致的單基因疾病。

2 CNV-seq 在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

為檢測CNV-seq 的臨床適用性，Liang 等[9]對72 例樣本檢測得出CNV-seq 對已知致病CNVs與單核苷酸多態(tài)性微陣列技術(shù)（single nucleotide ploymophism array，SNP-array）檢出率一致，還檢測出SNP-array 未檢出的次級CNVs（0.2～0.6 Mb）。2018 年，Wang 等[10]對3 429 例羊水標本前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，CNV-Seq 檢測出1.49%（51/3 429）致病或可能致病的CNVs，與CMA 對CNVs 檢測的準確度一致[11]。與核型分析技術(shù)相比，CNV-seq 將染色體異常的檢出率提高54.6%。2019 年《中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志》發(fā)表了CNV-seq 在產(chǎn)前診斷的專家共識，詳細介紹了該技術(shù)的特點，規(guī)范了該技術(shù)的臨床應(yīng)用[12]。另有研究也證明了CNV-seq 在高齡、先天性心臟病、結(jié)構(gòu)畸形、罕見染色體疾病等方面的檢測具有良好的特異性[13-16]，進一步證實了其作為一線檢測技術(shù)的應(yīng)用價值，充分肯定了該技術(shù)的應(yīng)用前景。

2.1 CNV-seq 技術(shù)在胎兒先天性心臟病（congenital heart disease，CHD）的應(yīng)用CHD 是我國最多見的出生缺陷疾病，位居出生缺陷患兒疾病首位，占出生缺陷數(shù)的26.7%[17]。染色體畸變是CHD 的主要遺傳因素，除外常見的非整倍體異常，染色體微缺失、微重復(fù)變異也可導(dǎo)致胎兒CHD 的發(fā)生。目前明確的與胎兒CHD 相關(guān)的染色體微缺失、微重復(fù)已超過40 種，常見的有22q11 微缺失、8p23 微缺失、7q11.3 缺失等。Jansen 等[18]研究發(fā)現(xiàn)除核型異常及22q11.2 微缺失外，在單一心臟畸形的胎兒中尚存在4%pCNVs。Zhu 等[19]采用CMA 和CNV-seq 技術(shù)對115 例胎兒CHD 的羊水標本檢測發(fā)現(xiàn)CNV-seq 對CNVs 檢測與CMA 的檢測效能一致，該研究還發(fā)現(xiàn)18.3%胎兒CHD 與明確致病的染色體畸變有關(guān)，其中包括4 例罕見pCNVs。鄧新娥等[20]用CNV-seq 對核型正常的胎兒CHD 進行產(chǎn)前檢測，發(fā)現(xiàn)CNV-seq 技術(shù)額外檢出9.2%的染色體畸變。郝曉艷等[21]對107 例圓錐動脈干畸形胎兒進行CNV-seq 產(chǎn)前檢測發(fā)現(xiàn)22 例存在pCNVs。CNV-seq 可檢測與CHD 相關(guān)的亞顯微結(jié)構(gòu)的微缺失、微重復(fù)，可發(fā)現(xiàn)罕見和新發(fā)的pCNVs，能檢出CMA 無法檢測的未知CNVs。

2.2 CNV-seq 技術(shù)在額外小標記染色體（small supernumerary marker chromosome，sSMC）中的應(yīng)用sSMC 是傳統(tǒng)染色體核型分析技術(shù)可發(fā)現(xiàn)但無法辨別其結(jié)構(gòu)及來源的異常染色體片段，在產(chǎn)前診斷的發(fā)病率為0.077%[22]，可分為環(huán)狀染色體、倒位重復(fù)、復(fù)雜重排及嵌合體型sSMC。與其有關(guān)的綜合征包括Pallister Killian 綜合征、貓叫綜合征和Emanuel綜合征等。熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）是檢測sSMC 染色體來源的常用方法，但其不能準確檢出未知染色體片段的變異位點及大小。張蔚卿等[23]報道1 例樣本經(jīng)常規(guī)G 顯帶分析提示核型為45,X[26]/46,X,+mar[43]，F(xiàn)ISH 檢測該sSMC 來源于著絲粒Y 染色體，通過CNV-seq 進行CNVs 檢測明確變異位點在Yq11.22，存在42.88 Mb 缺失片段，最終確定為Turner 綜合征的嵌合體核型。馮暄等[24]報道1 例胎兒核型分析示嵌合體型sSMC，CNV-seq 產(chǎn)前檢測發(fā)現(xiàn)該樣本12 號染色體p13.33-p11.1 存在拷貝數(shù)3.5、片段大小為34.70 Mb的嵌合重復(fù)區(qū)域，結(jié)合胎兒表型及檢測結(jié)果確診為Pallister Killian 綜合征。CNV-seq 可對未知來源sSMC 進行檢測，明確其遺傳物質(zhì)來源及大小，對嵌合體型sSMC 有獨特的檢測優(yōu)勢，可精確檢測低至5%的嵌合體[25]。

2.3 CNV-seq 技術(shù)在流產(chǎn)組織檢測中的應(yīng)用流產(chǎn)組織因胚胎死亡時間長、絨毛中活細胞少等導(dǎo)致體外細胞培養(yǎng)失敗率達10%～40%[26]。CNV-seq 技術(shù)不需對其進行細胞培養(yǎng)，可直接提取胚胎組織DNA，且對DNA 樣本量需求低，有利于檢測流產(chǎn)組織的染色體異常[27]。據(jù)統(tǒng)計核型分析正常的流產(chǎn)組織中15%存在pCNVs[28]。張建林等[29]對85 例絨毛組織檢測發(fā)現(xiàn)，在核型分析正常的68 例標本中CNVseq 技術(shù)檢測出2 例CNVs 和2 例嵌合體，細胞培養(yǎng)失敗的16 例標本中檢出4 例染色體畸變，核型分析難以確診的1 例標本經(jīng)CNV-seq 檢測后確診其核型。郭依琳等[30]對154 例流產(chǎn)樣本分別用CNV-seq和CMA 檢測后發(fā)現(xiàn)二者檢出的染色體異常率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.588），其中有2 例樣本因絨毛組織DNA 量少（＜200 ng）導(dǎo)致CMA 檢測失敗，但CNV-seq 均檢測出染色體異常。CNV-seq 技術(shù)可避免細胞培養(yǎng)，操作簡便，所需樣本量少，檢測時間短，還可檢測傳統(tǒng)核型分析技術(shù)檢測不出的染色體變異，提高染色體異常的檢出率[31]。

3 CNV-seq 的結(jié)果解讀

CNV-seq 技術(shù)的推廣和不斷發(fā)展有效地增加了pCNVs 的檢出率，也帶來了一定比例的臨床意義不明的CNVs（variants of uncertain significance，VUS）和次要發(fā)現(xiàn)（即與臨床主訴無關(guān)但具有臨床意義的CNVs）。對CNV-seq 檢測的結(jié)果解讀和遺傳咨詢給臨床醫(yī)師帶來了一定的壓力和挑戰(zhàn)，檢測結(jié)果也可能造成孕婦和家屬不必要的焦慮。2019 年美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會（American College of Medical Genetics，ACMG）新發(fā)布的CNVs 的解讀與報告技術(shù)標準描述了CNVs 的分類和性質(zhì)，闡明了與其分類有關(guān)的證據(jù)[32]。新指南為提高臨床CNVs 解讀的一致性，建立了統(tǒng)一判讀CNVs 致病性的打分系統(tǒng)，通過半定量評分的方式對參考證據(jù)（包括CNV 區(qū)域包含的基因類別及數(shù)量、文獻及數(shù)據(jù)庫的相關(guān)案例、患者表型及家族史）進行評估，最后計算總分值再對應(yīng)其分類。其中0.99 分以上為pCNVs，0.90～0.98 分為可能致病CNVs，-0.89～0.89 分為VUS，-0.98～-0.90 分為可能良性CNVs，-0.99 分以下為良性CNVs。VUS 類別較廣泛，可能包括將來發(fā)現(xiàn)以其他證據(jù)證明為致病性或良性變異的結(jié)果。檢測結(jié)果顯示為VUS 可能與以下情況有關(guān)：①CNV 超過實驗室的報告閾值，但在受影響的基因組間隔內(nèi)沒有基因；②一般人群中少數(shù)情況出現(xiàn)的CNV，但出現(xiàn)頻率過低被認為是VUS；③含有少量基因的CNV，尚不清楚其是否為劑量敏感基因；④相關(guān)文獻及數(shù)據(jù)庫中報道為VUS；⑤單個基因內(nèi)的CNV，尚不清楚其對轉(zhuǎn)錄本閱讀框的影響。遺傳醫(yī)師應(yīng)熟知各個證據(jù)的評分標準，嚴格按照指南進行分類評估，可參照評分證據(jù)對孕婦及家屬進行結(jié)果解讀，這樣更有利于醫(yī)患溝通，也可減輕孕婦的心理壓力。在檢測標本時還可發(fā)現(xiàn)與臨床主訴無關(guān)但具有臨床意義的CNVs，包括遲發(fā)疾病、與惡性腫瘤相關(guān)的變異和心血管相關(guān)疾病等，這些CNVs統(tǒng)稱為次要發(fā)現(xiàn)。在進行CNVs 檢測前臨床醫(yī)師需知情同意患者及家屬會有次要發(fā)現(xiàn)的可能，ACMG建議對于次要發(fā)現(xiàn)僅報告pCNVs 和可能致病CNVs。

4 CNV-seq 與全外顯子組測序技術(shù)（whole-exome sequencing，WES）

WES 技術(shù)是針對全部基因組的外顯子區(qū)域進行深度測序，可涵蓋基因組中的所有編碼區(qū)域，用于檢測單基因疾病、復(fù)雜疾病的致病基因及易感基因，但其不能檢測染色體結(jié)構(gòu)變異及全基因組CNVs。有研究表明WES 技術(shù)在單基因遺傳病的檢測上有獨特的價值[33]，而胎兒多發(fā)結(jié)構(gòu)畸形、神經(jīng)系統(tǒng)異常、心血管系統(tǒng)疾病與單基因疾病的發(fā)生有一定的關(guān)系。2020 年ACMG 發(fā)布《胎兒外顯子組檢測技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用指南》建議WES 技術(shù)可用于胎兒結(jié)構(gòu)異常但核型分析及CNVs 檢測均為陰性的補充檢測[34]。在我國胎兒系統(tǒng)彩超檢查時間為孕22～24周，如若進行常規(guī)產(chǎn)前診斷檢測之后再進行WES 檢測可能會造成孕婦孕周過大，延誤終止妊娠的時機。臨床醫(yī)師可對產(chǎn)前超聲提示結(jié)構(gòu)異常的孕婦行CNV-seq 與WES 聯(lián)合檢測，縮短檢測時間，提高產(chǎn)前診斷的準確度。

5 結(jié)語與展望

產(chǎn)前診斷是降低出生缺陷發(fā)生的有利手段，傳統(tǒng)的染色體核型分析對實驗操作和技術(shù)人員要求較高[35]，CMA 成本高、通量低，且不能覆蓋所有的CNVs。CNV-seq 技術(shù)在分辨率、檢測范圍、通量及成本效益上均展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢，已逐步應(yīng)用于產(chǎn)前診斷、明確遺傳學(xué)病因和流產(chǎn)組織檢測等臨床各個領(lǐng)域中。CNV-seq 技術(shù)的發(fā)展促進了我國產(chǎn)前診斷能力的提升，將CNV-seq 與其他技術(shù)合理地聯(lián)合應(yīng)用，優(yōu)勢互補，可充分發(fā)揮CNV-seq 的檢測效能，從而提高產(chǎn)前診斷的效率。隨著基因組學(xué)的迅猛發(fā)展和CNVs臨床病例的積累，我們對CNVs 的認識也會越來越充分，從而豐富我國的CNVs 數(shù)據(jù)庫，提高CNVs 解讀的準確性，更有利于發(fā)現(xiàn)新的致病基因。相信隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和成本的逐漸降低，CNV-seq 可能替代CMA 技術(shù)，顯著提高我國的出生缺陷防控水平。