沈君子，武曉劍，殷 紅，陳永建，馬長雨，錢 勇

(1.上海佰年詩丹德檢測技術(shù)有限公司，上海 201314；2.寧波立華制藥有限公司，浙江 寧波 315174；3.上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，上海 201314；4.國家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心中藥標(biāo)準(zhǔn)分中心，上海 201314）

白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根。夏、秋二季采挖,洗凈,除去頭尾和細(xì)根,置沸水中煮后除去外皮或去皮后再煮,曬干。白芍具養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽的功能。用于血虛萎黃、月經(jīng)不調(diào)、自汗、盜汗、脅痛、腹痛、四肢攣痛、頭痛眩暈［1］。白芍在種植過程中易感染多種病蟲害且發(fā)病率高,濫用農(nóng)藥造成了白芍的直接污染,此外,白芍生長周期長(一般3～4 年［2］),土壤和空氣中殘留的農(nóng)藥容易在植物組織中富集,又會對白芍產(chǎn)生間接污染［3］。杜雪純等［4］通過CE-MS 建立了一種測試白芍中19 種有機(jī)氮類農(nóng)藥殘留的方法。程玲等［5］通過大體積進(jìn)樣-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法建立了一種測試白芍中有機(jī)氯、有機(jī)磷和擬除蟲菊酯類等15種農(nóng)藥殘留的方法。劉小勤等［6］建立的SPE 凈化和GCQqQ-MS 相結(jié)合的檢測方法適用于白芍中多農(nóng)藥殘留的同時篩查測定。

隨著我國藥品標(biāo)準(zhǔn)提高計劃的實施和不斷推進(jìn),國家藥品標(biāo)準(zhǔn)體系已初步建立,藥品監(jiān)管信息化建設(shè)步伐加快,藥品標(biāo)準(zhǔn)管理工作更加趨于規(guī)范和完善。但中藥提取物標(biāo)準(zhǔn)化工作仍顯得相對滯后。白芍總苷原料藥,是寧波立華制藥有限公司將白芍飲片經(jīng)過乙醇提取,乙酸乙酯、正丁醇萃取后得到的白芍濃縮干燥粉末［7］。浦錦寶等［8］對白芍總苷原料藥中芍藥苷及總皂苷的含量研究發(fā)現(xiàn),其中芍藥苷含量均大于15%,總皂苷的含量均大于60%。賀妮等［9］研究發(fā)現(xiàn)白芍總苷原料藥對小鼠有抗抑郁及抗炎作用,可能通過影響中樞單胺神經(jīng)功能對抑郁及炎癥進(jìn)行調(diào)節(jié)。楊德芳等［10］研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸/白芍組提取物可通過抑制子宮收縮,改善子宮供血,從而對原發(fā)性痛經(jīng)產(chǎn)生治療作用。目前針對白芍中農(nóng)藥殘留的報道較多,尚未見有關(guān)白芍總苷原料藥測試農(nóng)藥殘留方面的資料。白芍總苷原料藥中主要成分為皂苷類,極性大,如參考常規(guī)藥材前處理方法用酸水浸泡或乙腈等極性較大的溶劑對農(nóng)藥殘留進(jìn)行提取,會將皂苷類成分同時萃取出來,干擾農(nóng)藥殘留的檢測。本實驗采用甲苯提取、硅膠凈化,建立GC-MS 法測定白芍總苷原料藥中22 種有機(jī)氯類農(nóng)藥的殘留量,以期為白芍總苷原料藥標(biāo)準(zhǔn)制訂和質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

Agilent 7890A/5977AGC-MS 聯(lián)用儀 (美國安捷倫公司)；FA2004 電子天平、XS205 電子天平(瑞士梅特勒托利多公司)；L500 離心機(jī)(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；氮吹儀 (美國Organomation Assoc.INC 公司)；W2-100SP 恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司)；Vortex Genins3 渦旋振蕩器(德國IKA 公司)。

農(nóng)藥對照品α-六六六、六氯苯、β-六六六、γ-六六六、五氯硝基苯、δ-六六六、七氯、艾氏劑、氧化氯丹、順式環(huán)氧七氯、反式環(huán)氧七氯、反式氯丹、β-硫丹、順式氯丹、4,4′-滴滴伊、狄氏劑、異狄氏劑、α-硫丹、4,4′-滴滴滴、2,4′-滴滴涕、4,4′-滴滴涕、硫丹硫酸鹽(上海安譜實驗科技股份有限公司)。白芍總苷原料藥(批號171209,寧波立華制藥有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 稱取22 種對照品10 mg,精密稱定,置于10 mL 量瓶中,用丙酮溶解并定容至刻度,配置成1 mg/mL貯備液；取100 μL 貯備液,用丙酮定容至10 mL,制備成質(zhì)量濃度為10 μg/mL 的溶液,取1 mL,用丙酮稀釋至10 mL,得1 μg/mL 混合對照品溶液。

2.1.2 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液 提取物直接取樣,稱取供試品2 g,稱定,置15 mL 具塞離心管中,加入10 mL 甲苯,分別加入混合 對照品溶 液10、20、40、100、200、400、800 μL,超聲20 min,4 000 r/min,離心5 min,取上清液至15 mL離心管中,加入無水硫酸鎂900 mg,硅膠300 mg,渦旋1 min,4 000 r/min,離心5 min,取上清液,置于40 ℃水浴中氮吹至干,加入甲苯2 mL 定容,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾,取濾液即得。

2.2 供試品溶液 提取物直接取樣,稱取供試品2 g,稱定,置15 mL 具塞離心管中,加入10 mL 甲苯,超聲20 min,4 000 r/min離心5 min,取上清液至15 mL 離心管中,加入無水硫酸鎂900 mg,硅膠300 mg,渦旋1 min,4 000 r/min離心5 min,取上清液,置于40 ℃水浴中氮吹至干,加入甲苯2 mL 定容,經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾,取濾液即得。

2.3 色譜條件 HP-5MS 色譜柱 (30 m × 0.25 mm,0.25 μm)；程序升溫(60 ℃維持2 min,以16 ℃/min 升至150 ℃維持0 min,以10 ℃/min 升至200 ℃維持0 min,以3 ℃/min 升至220 ℃維持0 min,以25 ℃/min 升至290 ℃維持8 min)；進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣量1 μL；載氣體積流量1 mL/min；分流模式不分流。

2.4 質(zhì)譜條件 離子源電子轟擊源(EI)；離子源溫度230 ℃；質(zhì)譜傳接口溫度280 ℃；質(zhì)譜監(jiān)測模式SIM,監(jiān)測離子結(jié)果見表1。

表1 22 種有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留質(zhì)譜監(jiān)測離子結(jié)果

2.5 結(jié)果計算 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察 取“2.1.2” 項下基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液,在“2.3” “2.4” 條件下測定,以信號強(qiáng)度為縱坐標(biāo)(Y),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X) 進(jìn)行回歸,結(jié)果見表2,表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 22 種有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留線性關(guān)系

2.6.2 精密度試驗 考察不同日期、不同分析人員對精密度的影響,2 個檢測人員對重復(fù)性下濃度的各6 份平行進(jìn)行檢測,RSD 6%～19%,均不大于32%,表明儀器精密度良好。

2.6.3 重復(fù)性試驗 藥材粉碎過3 號篩,按“2.1” 項下方法制備供試品溶液；在“2.3” “2.4” 條件下測定,22種農(nóng)藥RSD 為5%～13%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.4 加樣回收率試驗 提取物直接取樣,稱取供試品2 g,稱定,按 “2.1” 項下方法制備供試品溶液；在“2.3” “2.4” 條件下測定,計算每種農(nóng)藥的平均回收率,結(jié)果見表3。

2.6.5 定量限 在“2.3” “2.4” 條件下,把已知低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進(jìn)行比較,計算出能被可靠地檢測出的被測物質(zhì)最低濃度,制備估算濃度的加標(biāo)樣品6 份,考察定量限濃度下的準(zhǔn)確度和精密度,結(jié)果見表3,每種農(nóng)藥的定量限未超過2015 年版《中國藥典》 四部通則2341 第二法規(guī)定限值。

表3 22 種有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留在白芍總苷原料藥中的定量限

2.6.6 耐用性考察

2.6.6.1 不同填料對方法耐用性的影響 準(zhǔn)備無水硫酸鎂900 mg、硅膠300 mg 至15 mL 具塞離心管中；無水硫酸鎂900 mg 至另一支10 mL 具塞離心管中；市售農(nóng)殘凈化管,分別加入6 mL 甲苯、農(nóng)殘混合對照品100 μL,渦旋1 min,4 000 r/min 離心5 min,取上清液,置氮吹儀上40 ℃水浴氮吹至干,加甲苯1 mL,渦旋混勻,經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾,取濾液即得,在“2.3” “2.4” 條件下檢測；比對市售農(nóng)殘凈化管、無水硫酸鎂+硅膠、無水硫酸鎂的回收率,考察填料不同對方法的影響。結(jié)果見表4,表明單獨使用無水硫酸鎂無法很好凈化白芍藥材基質(zhì)對于農(nóng)藥的干擾,農(nóng)殘凈化管與無水硫酸鎂+硅膠的凈化效果相當(dāng)。

2.6.6.2 對照品溶液穩(wěn)定性 制備混合對照品溶液,分別考察在2、4、6、10、14、17、30 h 內(nèi)離子豐度變化；以2 h為對照,核查不同時間內(nèi)的回收率,在85%～115%范圍內(nèi)判斷為符合驗收標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示,除艾氏劑在30 h 時,回收率降低至82%,其余化合物在30 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6.6.3 供試品溶液穩(wěn)定性 空白樣品被證實22 種農(nóng)藥殘留均低于檢出限,因此改為考察加標(biāo)供試品溶液的穩(wěn)定性。制備藥材加標(biāo)溶液,分別考察在2、4、6、10、14、17、30 h 內(nèi)離子豐度變化；以0 h 為對照,核查不同時間內(nèi)的回收率,在85%～115% 范圍內(nèi)判斷為符合驗收標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示,供試品溶液中4,4′-滴滴涕從2 h 開始回收率降低、β-硫丹第6 h 開始回收率不穩(wěn)定、異狄氏劑第17 h 開始回收率不穩(wěn)定,其余化合物基本符合要求；建議供試品溶液制備2 h 內(nèi)完成檢測。

表4 不同填料對方法耐用性的影響

2.6.6.4 載氣體積流量 將設(shè)備載氣體積流量分別設(shè)置為0.8、1.2 mL/min,其他參數(shù)不變,選擇五氯硝基苯和六氯苯作為代表農(nóng)藥,考察回收率,在85%～115%范圍內(nèi)判斷為符合驗收標(biāo)準(zhǔn)。0.8～1.2 mL/min 的體積流量對加標(biāo)供試品溶液中五氯硝基苯、六氯苯無影響,見表5。

表5 不同載氣體積流量、初始柱溫、進(jìn)樣口溫度對方法耐用性的影響

2.6.6.5 初始柱溫 將設(shè)備初始柱溫分別設(shè)置為50、70 ℃,其他參數(shù)不變,選擇五氯硝基苯和六氯苯作為代表農(nóng)藥,考察回收率,在85%～115%范圍內(nèi)判斷為符合驗收標(biāo)準(zhǔn)。不同初始柱溫對加標(biāo)供試品溶液中五氯硝基苯基本無影響,當(dāng)初始柱溫設(shè)置為50 ℃時,對藥材加標(biāo)溶液中六氯苯的回收無影響；當(dāng)初始柱溫設(shè)置為70 ℃時,六氯苯無回收,見表5。

2.6.6.6 進(jìn)樣口溫度 將設(shè)備進(jìn)樣口溫度分別設(shè)置為240、260 ℃,其他參數(shù)不變,選擇五氯硝基苯和六氯苯作為代表農(nóng)藥,考察回收率,在85%～115%范圍內(nèi)判斷為符合驗收標(biāo)準(zhǔn)。不同進(jìn)樣口溫度對加標(biāo)供試品溶液中五氯硝基苯、六氯苯基本無影響,見表5。

3 討論

白芍總苷原料藥制備過程中使用到乙醇、正丁醇、乙酸乙酯,為了減少基質(zhì)干擾,會避免用該3 種溶劑對樣品進(jìn)行處理,參考文獻(xiàn)［11］ 中方法,最終用甲苯作為提取溶劑。

比較固相萃取凈化管、無水硫酸鎂+硅膠、無水硫酸鎂等不同填料對22 種有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留的凈化效果,發(fā)現(xiàn)單獨使用無水硫酸鎂無法很好凈化白芍藥材基質(zhì)對于農(nóng)藥的干擾,農(nóng)殘凈化管的凈化效果雖然與無水硫酸鎂+硅膠相當(dāng),但大部分的農(nóng)藥回收率低于無水硫酸鎂+硅膠做出來的回收率,這與農(nóng)殘凈化管中多種填料在一起,可能對目標(biāo)成分產(chǎn)生抑制作用有關(guān)。農(nóng)藥殘留分析過程中的前處理是整個分析的關(guān)鍵所在,目前用的較多的為凝膠滲透色譜法,該方法可除去供試品溶液基質(zhì)中的大分子干擾物,適用于更多種復(fù)雜基質(zhì),但成本較高,本方法采用靜態(tài)吸附去雜方法,成本低,操作簡易,且凈化效果好。

本研究比較了不同載氣體積流量、柱溫、進(jìn)樣口溫度對方法耐用性的影響,發(fā)現(xiàn)不同載氣體積流量及不同進(jìn)樣口溫度對五氯硝基苯及六氯苯的回收率無影響,降低初始柱溫對五氯硝基苯及六氯苯的回收率無影響,當(dāng)初始柱溫升高至70 ℃時,六氯苯無回收,初始柱溫不能設(shè)置過高。

本研究用甲苯進(jìn)行提取,硅膠及無水硫酸鎂填料對提取溶液進(jìn)行凈化,結(jié)合GC-MS 進(jìn)行檢測,建立了白芍總苷原料藥中22 種有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留同時檢測的分析方法。采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行一定的補(bǔ)償。該方法操作簡易、準(zhǔn)確可靠、靈敏度高,可用于白芍總苷原料藥中22 種農(nóng)藥殘留的同時測定,對于富含皂苷類成分的其他中藥及中藥提取物的農(nóng)殘檢測具有借鑒作用。