周珮珮 ，周 霖＃，師瑩瑩，張 俊，左莉華，劉麗偉，李卓倫，張夢雅，李 嘉，孫 志，杜書章*

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 450052；2.河南省精準(zhǔn)臨床藥學(xué)重點實驗室，河南 鄭州 450052）

慢性盆腔炎是一種易發(fā)于女性生殖器官內(nèi)和周圍結(jié)締組織及盆腔腹膜的慢性婦科疾病,患者主要表現(xiàn)為下腹部墜痛、月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、白帶增多及腰骶部脹痛等［1-3］。該疾病具有病程較長、病情頑固、易復(fù)發(fā)發(fā)作、遷延難愈等顯著特點,嚴(yán)重影響患者的身心健康［4］。目前,臨床上主要依靠抗生素類藥物對慢性盆腔炎進(jìn)行治療,然而,患者在長時間使用這類藥物后,常易出現(xiàn)肝腎功能損傷、菌群失調(diào)以及耐藥等多種不良事件［5-6］。

中醫(yī)藥作為中華民族傳統(tǒng)文化的瑰寶,在治療各類疾病方面積累了豐富的經(jīng)驗,并以其“高效低毒” 的顯著特點,目前廣泛應(yīng)用于臨床治療過程中。中醫(yī)辨證認(rèn)為慢性盆腔炎主要是由氣滯血瘀、寒凝氣滯、脾虛瘀濁等諸因?qū)е?因此,具有行氣、活血、化瘀作用的藥物將對該疾病具有很好的標(biāo)本兼治功效［4］。婦可靖膠囊是由丹參、紅花、赤芍、當(dāng)歸等二十多種藥材配伍而成的中藥復(fù)方制劑,該藥中北敗醬、蒲公英、車前子清熱利濕,解毒排膿為君藥,川芎、赤芍、三七、紅花、丹參活血化瘀；延胡索疏肝理氣,止疼痛為臣藥；白術(shù)、茯苓益氣健脾,補(bǔ)氣生血,鱉甲、地骨皮滋補(bǔ)陰液,涼血除蒸,當(dāng)歸、熟地黃養(yǎng)血調(diào)經(jīng),白芍滋陰柔肝,共為佐藥。馬齒莧、柴胡為臣藥。諸藥合用,共奏清熱利濕,化瘀散結(jié),行氣止痛,調(diào)補(bǔ)氣血之功,對于淤毒內(nèi)結(jié)、氣滯血瘀所致的慢性盆腔炎具有很好的針對性治療作用。同時,中藥及其復(fù)方制劑具有多成分、多靶點、多途徑等協(xié)同作用效果,使得依靠傳統(tǒng)的“單成分、單靶點” 研究思路已經(jīng)很難對其進(jìn)行較為整體、系統(tǒng)的作用機(jī)制研究［7-8］。隨著各種組學(xué)理論、高通量篩選、分析技術(shù)的發(fā)展以及計算方法的不斷進(jìn)步,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以其系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)為理論基礎(chǔ)的研究策略與傳統(tǒng)中醫(yī)癥候的理念具有異曲同工之妙,體現(xiàn)了生物平衡的理念,特別適用于中藥的復(fù)雜作用機(jī)制研究［9］。

課題組擬借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究思路,從系統(tǒng)生物整體的角度去深入探討婦可靖膠囊治療慢性盆腔炎的潛在活性成分及作用機(jī)制,為進(jìn)一步的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制以及靶向新藥研發(fā)提供重要的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 主要網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫及軟件 TCMSP 數(shù)據(jù)庫(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)、Therapeutic Target Database數(shù)據(jù)庫(http://bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp)、OMIM 數(shù)據(jù)庫 (http://www.omim.org/)、DAVID (http://bioinfo.Capitalbio.com/mas3/)、Cytoscape 3.6.1 軟件。

1.2 活性成分及靶點篩選 通過檢索中藥藥理學(xué)分析平臺(TCMSP),并以婦可靖膠囊的20 余味藥材組成“北敗醬、車前子、蒲公英、香附(醋制)、赤芍、紅花、丹參、延胡索、三七、秦艽、地骨皮、鱉甲、海藻、黨參、白術(shù)(炒)、茯苓、熟地、當(dāng)歸、馬齒莧、柴胡” 等為關(guān)鍵詞檢索其藥物活性成分及相關(guān)靶點。中藥活性成分的口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB) 主要反映其化合物的吸收程度；類藥性(Drug Likeness,DL) 是化合物與已知藥物的類似性,OB 和DL 值是中藥能夠吸收入血并分布至靶器官發(fā)揮藥效作用的兩大關(guān)鍵指標(biāo)。本研究首先采用TCMSP 數(shù)據(jù)庫查詢每個藥物活性成分的OB 和DL 值,設(shè)定其化學(xué)成分須同時滿足OB≥35% 且DL≥0.25,初步篩選出候選成分,通過活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)degree 值進(jìn)一步篩選活性成分。

1.3 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 由于藥物成分對應(yīng)的靶點可能存在命名不規(guī)范或不統(tǒng)一的問題,因而首先通過UniProt 數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/uploadlists/) 轉(zhuǎn)換候選成分對應(yīng)的靶點基因名,再將化合物及對應(yīng)的靶基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1 軟件,構(gòu)建婦可靖膠囊的活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。其中,度值(degree) 反映所構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)中某一節(jié)點與其它節(jié)點的總連接數(shù)目；介數(shù)是指網(wǎng)絡(luò)中所有最短路徑中經(jīng)過某節(jié)點的路徑數(shù)目與最短路徑總數(shù)的比值,度值和介數(shù)是體現(xiàn)某節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中重要性的關(guān)鍵拓?fù)鋮?shù)。

1.4 慢性盆腔炎相關(guān)疾病靶點篩選 本研究通過藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(Therapeutic Target Database,TTD) (http://bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp) 和孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫 (Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)(https://www.omim.org/) 數(shù)據(jù)庫檢索慢性盆腔炎相關(guān)靶點,然后將篩選得到的藥物靶點信息和慢性盤腔炎疾病靶點信息進(jìn)行對比分析。

1.5 婦可靖治療慢性盆腔炎的關(guān)鍵靶點篩選 根據(jù)篩選得到的藥物成分靶點和疾病靶點信息,采用Cystoscope 3.6.1軟件構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein protein interaction,PPI),取其交集,運(yùn)用Network Analysis 對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析。在分析得到的拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)信息中,選擇連接度(degree) 大于2 倍以上中位數(shù)值的節(jié)點作為關(guān)鍵候選靶點并生成網(wǎng)絡(luò)。再分析該網(wǎng)絡(luò)并得到新的拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)信息,計算每個節(jié)點的“連接度” “接近中心性(Closeness Centrality,CC) ” “中介中心度(Betweenness Centrality,BC) ” “鄰域連通性(Neighborhood Connectivity,NC) ” 4 個拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征值并進(jìn)行二次篩選,最終選擇以上四者特征值均大于其相應(yīng)中位數(shù)的節(jié)點作為其關(guān)鍵靶點。

1.6 KEGG 信號通路及GO 生物過程富集分析 將得到的婦可靖治療慢性盆腔炎的關(guān)鍵潛在靶點在人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫DAVID 6.8 (http://david.ncifcrf.gov/) 進(jìn)行KEGG 通路注釋分析和GO 富集分析,以P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。由此,關(guān)鍵靶點(基因) 可直接映射到通路上,這些富集得到的通路即是藥物發(fā)揮治療疾病并起調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵途徑,通過該方法可得到婦可靖膠囊治療慢性盆腔炎的代謝通路及相關(guān)生物學(xué)過程等相關(guān)信息。

1.7 婦可靖膠囊“活性成分-靶點-通路” 網(wǎng)絡(luò)模型圖構(gòu)建 將婦可靖膠囊中的活性成分、對應(yīng)預(yù)測靶點和通路分析結(jié)果,分別構(gòu)建“活性成分-靶點”、“靶點-通路” 之間的相互關(guān)系,將其導(dǎo)入Cytoscape 軟件中構(gòu)建婦可靖膠囊相關(guān)“活性成分-靶點-通路” 網(wǎng)絡(luò)模型圖。

2 結(jié)果

2.1 主要活性成分信息與活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò) 本研究經(jīng)設(shè)定的OB 及DL 進(jìn)行篩選后,共得到91 個具有良好的口服吸收利用度和類藥性的藥物活性成分,見表1。通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫預(yù)測91 個藥物成分作用靶點,在TCMSP 數(shù)據(jù)庫里根據(jù)OB 和DL 值篩選并采用uniprot 數(shù)據(jù)庫改正藥物名稱為其規(guī)范名稱,刪除沒有規(guī)范名稱與重復(fù)后共得到154個潛在靶點,同時構(gòu)建婦可靖膠囊的主要活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖,如圖1 所示。分析網(wǎng)絡(luò)圖可知,其中21 個成分作用靶點頻率大于33,通過頻率發(fā)現(xiàn),婦可靖的活性成分與PTGS、MAPK、NOS 等炎癥靶點群相關(guān),如表2 所示。

表1 基于TCMSP 篩選的婦可靖膠囊潛在活性成分

續(xù)表1

表2 婦可靖膠囊91 種成分的潛在作用靶點（頻數(shù)≥33 次）

2.2 婦可靖膠囊治療慢性盆腔炎的關(guān)鍵靶點篩選 本研究基于多個數(shù)據(jù)庫及挖掘文獻(xiàn)數(shù)據(jù),共搜到慢性盆腔炎相關(guān)靶點203 個。將203 個疾病相關(guān)靶點與在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中得到的成分靶點進(jìn)行比對分析,共得到28 個婦可靖治療慢性盆腔炎的潛在作用靶點,見表3。

表3 婦可靖膠囊治療盆腔炎的潛在作用靶點

圖1 婦可靖膠囊主要活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

為了進(jìn)一步揭示治療盆腔炎炎癥作用靶點的潛在機(jī)制,采用Cytoscape 3.6.1 軟件構(gòu)建有效活性成分靶點的PPI 及疾病靶點的PPI,結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有5 260 個成分預(yù)測靶點及7 496個慢性盆腔炎疾病靶點具有蛋白-蛋白相互作用(其中包括4 118 個重疊靶點),表明78.29% 的成分靶點和54.94%的疾病靶點具有直接或間接的相互作用。取藥物成分及疾病靶點的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)交集靶點,然后分析每個點的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征值,得出其“連接度” 中位數(shù)值為33,因此,第一次選擇“degree≥66” 的節(jié)點作為候選靶點(2倍以上中位數(shù)),共得到1 025 個靶點。接著對候選靶點的信息再次進(jìn)行提取分析,并以“連接度” “接近中心性”“中介中心度” “鄰域連通性” 大于其相應(yīng)中位數(shù)為第二次篩選條件進(jìn)一步選擇合適的節(jié)點,即degree≥72,CC≥0.51,BC≥3.7×10-4,NC≥124.46,最終得到婦可靖治療慢性盆腔炎的關(guān)鍵靶點797 個,見圖2。

圖2 婦可靖膠囊治療慢性盆腔炎的關(guān)鍵靶點篩選

2.3 核心靶點的KEGG 信號通路及GO 生物過程富集分析

2.3.1 KEGG 通路富集分析 將篩選到的核心靶蛋白導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG 富集分析,條件設(shè)置為P＜0.05且FDR＜0.05 (錯誤發(fā)現(xiàn)率),剔除不相關(guān)通路后,共得到重要通路8 條,分別為腫瘤壞死因子信號通路、NOD 樣受體信號通路、Toll 樣受體信號通路、T 細(xì)胞受體信號通路、PI3K-Akt 信號通路、NF-κ B 信號通路、白細(xì)胞經(jīng)內(nèi)皮遷移及MAPK 信號通路等,結(jié)果見表4。由此可知,與婦可靖治療慢性盆腔炎相關(guān)性最大的通路是MAPK 信號通路,將相關(guān)靶點經(jīng)過通路富集分析后,映射在該通路上的靶點數(shù)最多,P值顯著。TNF 信號通路與慢性盆腔炎的發(fā)生關(guān)系密切,從代謝通路結(jié)果顯示可推斷婦可靖膠囊可能主要通過干預(yù)NOD 樣受體主介導(dǎo)下游MAPK 與NF-κB 蛋白靶點激活TNF 通路,調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎性因子,并降低其表達(dá)水平,抑制子宮內(nèi)膜炎癥細(xì)胞增生,起到治療炎癥疾病的作用。

表4 經(jīng)KEGG 富集分析后的主要通路

2.3.2 GO 生物過程富集分析 將篩選得到的核心靶蛋白導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO 生物學(xué)過程富集分析,即分別從生物過程、細(xì)胞組分及分子功能3 個層面對基因功能進(jìn)行注釋。GO 富集分析結(jié)果顯示,婦可靖治療慢性盆腔炎的靶基因主要富集在138 個生物學(xué)過程,56 種細(xì)胞組分和54種分子功能。按照重要性由高到低進(jìn)行排序,主要生物學(xué)過程富集結(jié)果見圖3,細(xì)胞組分及分子功能富集分別見圖4～5。由此可見,藥物治療疾病的生物過程主要涉及基因、蛋白及核糖體等小分子代謝過程的調(diào)節(jié),這些靶點在細(xì)胞組分中與胞核、胞質(zhì)以及胞膜等相關(guān)性最大,在分子功能中與ATP 等能量結(jié)合、DNA 等基因結(jié)合及蛋白質(zhì)結(jié)合等相關(guān)性最大。

圖3 GO 富集分析的生物過程

圖4 GO 富集分析的細(xì)胞組分

圖5 GO 富集分析的分子功能

2.4 婦可靖膠囊“成分-靶點-通路” 網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建 采用Cytoscape 軟件構(gòu)建婦可靖膠囊“活性成分-靶點-通路” 網(wǎng)絡(luò)模型,見圖6,其作用靶點分布于不同的代謝通路,相互協(xié)調(diào),相互關(guān)聯(lián),從多種途徑體現(xiàn)藥物治療盆腔炎的作用機(jī)制。

3 討論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對中藥復(fù)方進(jìn)行深入研究,通過“活性成分-靶點預(yù)測-疾病” 關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建、拓?fù)鋮?shù)的分析及生物信息的挖掘?qū)D可靖膠囊治療女性盆腔炎在整體分子水平上闡述作用機(jī)制,打破“一個藥物一個靶標(biāo)” 的傳統(tǒng)研究理念,為臨床上研究中藥多成分、多靶點、多通路提供重要的借鑒思路［10-11］。通過設(shè)置篩選條件后共得到婦可靖膠囊的主要活性成分91 種,作用靶點共154 個,通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅玫狡渲委熉耘枨谎椎年P(guān)鍵核心靶點797 個。KEGG 分析顯示藥物作用靶點主要富集于MAPK、TNF、NOD 樣受體,Toll 樣受體以及T 細(xì)胞受體信號通路等關(guān)鍵途徑,尤以NOD/ NF-κB/TNF 通路密切相關(guān)。NOD 樣受體是表達(dá)于固有免疫細(xì)胞表面的一種受體蛋白,其介導(dǎo)的炎癥信號通路在機(jī)體抗感染免疫應(yīng)答中具有重要作用。NOD 樣受體主要通過介導(dǎo)NF-κB 通路、MAPK 通路和自噬通路參與抗細(xì)菌免疫應(yīng)答,在胞外刺激物的誘導(dǎo)下,能調(diào)控相關(guān)促炎基因如IL-1β 和TNF-α 的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),導(dǎo)致其大量產(chǎn)生,引發(fā)一序列的炎癥損傷［12-13］；淋巴細(xì)胞是構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng)的主要細(xì)胞群,T 細(xì)胞可分化為具有不同生物學(xué)功能的細(xì)胞亞群以協(xié)助協(xié)助和動員其它免疫細(xì)胞一起清除體內(nèi)入侵的病原體。婦可靖膠囊可能主要通過干預(yù)NOD 樣受體主介導(dǎo)下游MAPK 與NF-κB 蛋白靶點激活TNF通路,調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1β、IL-6 等一系列炎性因子,抑制子宮內(nèi)膜炎癥細(xì)胞增生,起到治療慢性盆腔炎的作用。

圖6 婦可靖膠囊“成分-靶點-通路” 網(wǎng)絡(luò)圖

婦可靖膠囊潛在作用靶點前列腺素-內(nèi)環(huán)氧合酶(PTGS),是前列腺素合成的關(guān)鍵酶,同時為非甾體抗炎藥物作用靶點；MMP9 與血管內(nèi)皮生長因子的產(chǎn)生關(guān)系密切,MMP2 能夠裂解各種膠原蛋白及黏連蛋白,靶點基因體現(xiàn)了婦可靖膠囊“逐瘀清化” 的特點［14］；CCL2 屬于趨化因子,一類同時參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥過程的分泌蛋白家族。這體現(xiàn)了婦可靖膠囊治療盆腔炎“清熱解毒” 的藥物特點［15］。本研究結(jié)果顯示,KEGG 富集分析得出的婦可靖膠囊治療慢性盆腔炎通路與靶點與免疫炎癥高度相關(guān),這與化學(xué)成分研究結(jié)果相吻合。

慢性盆腔炎的發(fā)病機(jī)制與病理因素極其復(fù)雜,而傳統(tǒng)的“單成分-單靶點-單疾病” 模式并不適合中藥復(fù)方制劑研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于“藥物靶點網(wǎng)絡(luò)-疾病基因網(wǎng)絡(luò)-蛋白蛋白互作網(wǎng)絡(luò)” 從整體水平上探索并闡釋藥物治療疾病的復(fù)雜作用機(jī)制,可以更加直觀地理解婦可靖膠囊和慢性盆腔炎的相互作用。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理念,構(gòu)建“成分-靶點-疾病” 網(wǎng)絡(luò),初步分析婦可靖膠囊治療慢性盆腔炎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及可能的作用機(jī)制,為下一步更深入地分子機(jī)制驗證及研究奠定了扎實可靠的前期基礎(chǔ)。