馬 歡，高楠楠，陳俞如，肖 瑛，2，潘艷伶，3*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550004；2.貴州省常見慢性疾病發(fā)病機(jī)制及藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550025；3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550004）

伴隨肥胖人數(shù)的快速增多,2 型糖尿病 (type 2 diabetes mellitus,T2DM) 的發(fā)病率逐漸增加,預(yù)計(jì)到2040年患者將達(dá)到6.42 億［1］。T2DM 是由于胰島素分泌減少和(或) 胰島素敏感性降低所導(dǎo)致的葡萄糖耐量降低和高血糖為特征的一類常見內(nèi)分泌疾?。?］,隨著對T2DM 病理生理研究的不斷深入,大量的藥物已被應(yīng)用于治療糖尿病和阻止其進(jìn)展,然而,大部分藥物有一定不良反應(yīng),如乳酸性酸中毒、低血糖、水腫等［3］,因此,尋找更安全有效地預(yù)防和治療藥物是非常必要的。近年來中醫(yī)藥治療T2DM以其良好的療效、較低的不良反應(yīng)而備受關(guān)注［4］,糖通飲在臨床及前期實(shí)驗(yàn)中已被證實(shí)對T2DM 具有較好的治療作用［5-8］,但其分子作用機(jī)制并未完全清楚。本研究擬觀察糖通飲對T2DM 大鼠糖脂代謝、胰島素水平和氧化應(yīng)激等生化指標(biāo)的影響,并從分子水平研究該方對JNK 信號(hào)通路的影響,以探尋其分子作用機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 雄性大鼠50 只,體質(zhì)量(180±20)g,由解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK (軍) 2012-0011,飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房,自由攝水?dāng)z食,并保持墊料干燥,定時(shí)予以更換。飼養(yǎng)條件:溫度21～26 ℃,相對濕度40%～60%。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK (黔) 2015-005。

1.2 試劑與藥物 糖通飲(方藥組成為生地黃12 g、山藥15 g、山茱萸15 g、茯苓15 g、澤瀉9 g、丹皮10 g、黃芪15 g、丹參15 g、地骨皮15 g、草決明15 g),由貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供。鏈脲佐菌素(STZ,北京索萊寶科技有限公司,批號(hào)615K0321)；FFA、SOD、MDA 試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號(hào)分別為20180613、20180608、20180606)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒 (日 本 TaKaRa 公 司,批號(hào)分別 為 AI40771A、AI21033A)；兔SP 試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,批號(hào)K185910H)。

2 方法

2.1 造模、分組 50 只SPF 級(jí)SD 雄性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,按體質(zhì)量隨機(jī)取出10 只作為正常組,給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng),其余大鼠給予高脂飼料(普通飼料58%,精煉豬油20%,糖20%,膽固醇2%,由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房提供)喂養(yǎng)8 周,誘發(fā)胰島素抵抗,之后進(jìn)行1～3 次小劑量(20～30 mg/kg) 腹腔注射1%鏈脲佐菌素(STZ) 制備T2DM 模型；正常組腹腔注射相應(yīng)劑量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。STZ 注射72 h 后,尾靜脈采血測定餐后血糖,以餐后血糖≥16.7 mmol/L［9］,且尿量和飲水量明顯增多者為T2DM 模型制備成功。將40 只造模成功的大鼠按餐后血糖值隨機(jī)分為模型組及糖通飲低、中、高劑量組,每組10 只。

2.2 給藥 糖通飲中藥水煎濃縮成1 g/mL 煎劑,按照大鼠與成人等效劑量折算,低劑量組按10 g/kg (相當(dāng)于成人公斤體質(zhì)量用藥量的5 倍) 灌胃給藥,中劑量組按20 g/kg(相當(dāng)于成人千克體質(zhì)量藥量的10 倍) 灌胃給藥,高劑量組按30 g/kg (相當(dāng)于成人千克體質(zhì)量藥量的15 倍) 灌胃給藥,正常組及模型組給予等容量雙蒸水灌胃,以上各組均每天灌胃1 次,連續(xù)8 周。實(shí)驗(yàn)過程中,因灌胃、大鼠自身免疫力低下等原因死亡7 只,其中模型組、低劑量組和中劑量組各2 只,高劑量組1 只。

2.3 標(biāo)本采集 給藥8 周后,大鼠禁食不禁水12 h,尾靜脈采血測量空腹血糖,腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg,大鼠麻醉后快速開腹,腹主動(dòng)脈采血并迅速摘除胰腺組織,將血液靜置30 min 后3 000 r/min 離心10 min,分離血清,保存于-20 ℃冰箱中,以檢測FINS、TG、TC、FFA、SOD及MDA。將胰腺組織分別置于-80 ℃冰箱和4%多聚甲醛中,以檢測胰腺組織中JNK 信號(hào)通路相關(guān)因子JNK1、PDX-1 mRNA 及蛋白表達(dá)。

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、空腹血清胰島素(Fasting serum lisulin,FINS) FBG 水平采用葡萄糖氧化酶法檢測,FINS 水平采用ELISA 法測定,并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù) (HOMA-IR),公式為HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。

2.4.2 血清生化指標(biāo) 采用全自動(dòng)生化儀檢測TG、TC 水平,按照試劑盒操作步驟,用分光光度計(jì)比色檢測FFA 水平,黃嘌呤氧化酶法測定SOD 活力,硫代巴比妥酸顯色法測定MDA 水平。

2.4.3JNK1、PDX-1 mRNA 表達(dá) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法,引物由英濰捷基(上海) 貿(mào)易有限公司合成,見表1。2-ΔΔCt計(jì)算各組基因相對表達(dá)量,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 引物序列

2.4.4 JNK、PDX-1 蛋白表達(dá) 采用免疫組化法。切片常規(guī)脫蠟至水,抗原熱修復(fù),滴加JNK1 (1 ∶150)、PDX-1抗體(1 ∶150),4 ℃過夜,滴加二抗,滴加SABC 復(fù)合物,DAB 顯色,蘇木素復(fù)染,常規(guī)脫水,透明,封片,計(jì)算平均光密度值。光鏡下觀察JNK1、PDX-1 蛋白陽性表達(dá),以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)的淡黃色至棕黃色顆粒作為陽性細(xì)胞,顏色越深,表示蛋白表達(dá)量越高。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料以() 表示,組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 糖通飲對T2DM 大鼠空腹血糖的影響 給藥前及給藥8 周后,模型組大鼠空腹血糖與正常組相比均升高(P＜0.01)。給藥前,糖通飲各劑量組大鼠空腹血糖與模型組相比無明顯差異(P＞0.05)；給藥8 周后,糖通飲各劑量組大鼠空腹血糖與模型組相比降低(P＜0.01),并具有劑量依賴性,但各劑量組之間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見圖1。

圖1 糖通飲對T2DM 大鼠空腹血糖的影響

3.2 糖通飲對T2DM 大鼠空腹血清胰島素和胰島素抵抗指數(shù)的影響 模型組大鼠空腹血清胰島素與正常組相比無明顯差異(P＞0.05),糖通飲各劑量組與模型組相比亦然(P＞0.05)。模型組大鼠胰島素抵抗指數(shù)與正常組相比增加(P＜0.01),糖通飲各劑量組大鼠胰島素抵抗指數(shù)與模型組相比降低(P＜0.01),并具有劑量依賴性,但各劑量組之間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見圖2。

圖2 糖通飲對T2DM 大鼠血清胰島素和胰島素抵抗指數(shù)的影響

3.3 糖通飲對T2DM 大鼠脂代謝的影響 與正常組相比,模型組大鼠血清TG、TC、FFA 水平均升高(P＜0.01)；與模型組相比,糖通飲各劑量組血清TG、TC、FFA 水平降低(P＜0.05,P＜0.01),并具有劑量依賴性。見圖3。

圖3 糖通飲對T2DM 大鼠脂代謝的影響

3.4 糖通飲對T2DM 大鼠氧化應(yīng)激的影響 與正常組相比,模型組大鼠血清SOD 水平降低(P＜0.01),MDA 水平升高(P＜0.01)；與模型組相比,糖通飲各劑量組大鼠血清SOD 水平升高(P＜0.01),MDA 水平降低(P＜0.05,P＜0.01),并具有劑量依賴性。見圖4。

圖4 糖通飲對T2DM 大鼠血清SOD、MDA 水平的影響

3.5 糖通飲對T2DM 大鼠胰腺組織JNK1、PDX-1 mRNA表達(dá)的影響 與正常組相比,模型組大鼠胰腺組織JNK1 mRNA 表達(dá)升高(P＜0.01),PDX-1 mRNA 表達(dá)降低(P＜0.01)；與模型組相比,糖通飲各劑量組大鼠胰腺JNK1 mRNA 表達(dá)降低(P＜0.05),PDX-1 mRNA 表達(dá)升高(P＜0.05,P＜0.01),并具有劑量依賴性。見圖5。

圖5 糖通飲對T2DM 大鼠胰腺組織JNK、 PDX-1 mRNA表達(dá)的影響

3.6 糖通飲對T2DM 大鼠胰腺組織JNK1、PDX-1 蛋白的影響 JNK1 主要定位于胰島的細(xì)胞漿,模型組胰島部染色較深,正常組和糖通飲各劑量組染色較淺；PDX-1 主要定位于胰島的細(xì)胞核,模型組胰島組織陽性細(xì)胞數(shù)較少,正常組和糖通飲各劑量組陽性細(xì)胞數(shù)較多。與正常組相比,模型組大鼠胰腺組織JNK1 蛋白陽性細(xì)胞表達(dá)升高(P＜0.01)；與模型組相比,糖通飲各劑量組陽性細(xì)胞表達(dá)降低(P＜0.01),并呈劑量依賴性；與正常組相比,模型組PDX-1 蛋白陽性細(xì)胞數(shù)降低(P＜0.01)；與模型組相比,糖通飲各劑量組PDX-1 蛋白陽性細(xì)胞數(shù)增加(P＜0.01),并呈劑量依賴性。見圖6。

圖6 糖通飲對T2DM 大鼠胰腺組織JNK1 和PDX-1蛋白表達(dá)的影響（×400）

4 討論

全國名老中醫(yī)凌湘力教授針對T2DM 氣陰兩虛為本、瘀血阻絡(luò)為標(biāo)的基本病機(jī)特點(diǎn)創(chuàng)制了經(jīng)驗(yàn)方“糖通飲”,該方在六味地黃丸的基礎(chǔ)上改熟地黃為生地黃,并配伍黃芪、丹參、地骨皮、草決明而成,具有益氣養(yǎng)陰、活血化瘀之功［9-12］。據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí),黃芪中的苷類、黃酮類成分和多糖類成分有很好的降糖和增強(qiáng)胰島素敏感性的作用［9,11］；丹參可減少氧化應(yīng)激損傷、降脂降壓；地骨皮、草決明可促進(jìn)胰島β 細(xì)胞分泌胰島素,具有降糖降脂的作用。此方在臨床治療T2DM 的運(yùn)用中也取得頗為滿意的效果［12］。在本實(shí)驗(yàn)中再次證明中藥方劑糖通飲可劑量依賴性地降低T2DM 大鼠的血糖。

糖、脂代謝紊亂是T2DM 發(fā)生和發(fā)展的重要標(biāo)志,而胰島素抵抗是引起糖、脂代謝紊亂的關(guān)鍵環(huán)節(jié),持續(xù)高血脂水平所產(chǎn)生的脂毒性可導(dǎo)致高活性反應(yīng)分子性氧簇和活性氮簇生成增多,因此啟動(dòng)氧化應(yīng)激機(jī)制,損傷胰島β 細(xì)胞,加重胰島素抵抗,繼而影響糖代謝［13］。FFA 增多可促進(jìn)胰島素受體底物1 的絲氨酸發(fā)生磷酸化,進(jìn)而抑制胰島素信號(hào)通路的活化,從而導(dǎo)致胰島素抵抗［14］。TG 和TC 的升高,可引起胰島β 細(xì)胞內(nèi)脂類過量堆積,使胰島β 細(xì)胞功能受損,進(jìn)而加劇胰島素抵抗程度［15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,T2DM 模型組大鼠血清FFA、TG 和TC 水平均明顯升高,證明存在脂質(zhì)代謝紊亂,應(yīng)用糖通飲后,可劑量依賴性地降低2 型糖尿病大鼠血清FFA、TG 和TC 水平,改善大鼠的高脂狀態(tài)。

氧化應(yīng)激可以促進(jìn)胰島素抵抗的發(fā)生和進(jìn)一步加劇脂代謝紊亂。氧化應(yīng)激與脂代謝之間存在密切聯(lián)系,脂代謝水平升高會(huì)增加耗氧量,進(jìn)而產(chǎn)生大量的ROS,過量的ROS 又會(huì)導(dǎo)致脂肪、蛋白質(zhì)等大分子變性,從而造成胰腺組織受損,反過來影響脂代謝,發(fā)生脂代謝紊亂［16］。SOD為體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成部分,而MDA 水平的高低直接反映了機(jī)體氧化應(yīng)激水平的嚴(yán)重程度。氧化應(yīng)激反應(yīng)引起體內(nèi)SOD 活性降低,導(dǎo)致機(jī)體氧自由基大量產(chǎn)生,對本身缺乏抗氧化酶的胰島β 細(xì)胞更易造成氧損傷,引起胰島β 細(xì)胞功能受損,胰島素分泌減少［17］。本研究發(fā)現(xiàn),T2DM 模型組大鼠血清SOD 水平明顯,血清MDA 明顯升高,說明糖尿病時(shí)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)。糖通飲可劑量依賴性地升高T2DM 大鼠血清SOD,降低血清MDA,提示糖通飲具有抗氧化作用,這可能是其改善T2DM 大鼠胰島素抵抗及糖、脂代謝紊亂的作用機(jī)制。

胰島素抵抗是指在胰島素靶組織(骨骼肌組織、脂肪組織、肝組織等) 中胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取和利用的能力下降,進(jìn)一步引起糖代謝紊亂［18］。在T2DM 患者中,胰島素抵抗的發(fā)生率超過80%,是T2DM 早期的主要特征,因此,改善胰島素抵抗是治療T2DM 的有效途徑。HOMA-IR是研究和評價(jià)胰島素抵抗的重要指標(biāo)［19］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組大鼠HOMA-IR 值與正常組大鼠相比明顯升高,而其血清胰島素濃度與正常組大鼠無明顯差異,表明模型組大鼠存在胰島素抵抗,胰島素抵抗的原因是由于胰島素與其受體的親和力降低,而非胰島素的數(shù)量減少所致。糖通飲可明顯降低T2DM 大鼠HOMA-IR 值,對血清胰島素?zé)o明顯影響,提示糖通飲可能通過增加胰島素與受體的親和力,從而改善胰島素抵抗。此外,糖通飲無明顯促進(jìn)胰島素分泌的作用,對胰島組織具有一定保護(hù)作用。

c-Jun 氨基末端激酶 (c-Jun N-terminal kinase,JNK)由一組絲氨酸/蘇氨酸激酶組成,屬于絲裂原活化蛋白激酶家族中重要的一員,對氧化應(yīng)激較為敏感,激活JNK 信號(hào)通路是氧化應(yīng)激引起胰島β 細(xì)胞損傷的主要機(jī)制［20］。激活胰島β 細(xì)胞中JNK 可抑制胰腺十二指腸同源盒(PDX-1)轉(zhuǎn)錄因子和胰島素靶基因的轉(zhuǎn)錄,減少血糖升高時(shí)胰島素的分泌,產(chǎn)生胰島素抵抗［21］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示T2DM 模型組大鼠胰腺組織JNK的mRNA 和蛋白表達(dá)明顯增加,PDX-1 的mRNA 和蛋白表達(dá)明顯降低,糖通飲干預(yù)后JNK1 的mRNA 和蛋白表達(dá)量顯著下降,PDX-1 的mRNA 和蛋白的表達(dá)量顯著升高,表明糖通飲可抑制JNK 信號(hào)通路的過度激活,從而降低氧化應(yīng)激水平和改善胰島素抵抗,進(jìn)而改善T2DM 大鼠糖脂代謝。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示糖通飲對上述各項(xiàng)指標(biāo)的影響具有劑量依賴性,大劑量組的治療效果優(yōu)于中、低劑量組,此結(jié)果為優(yōu)化糖通飲的臨床用藥劑量提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。