王小平 ，杜少兵，白吉慶，王鵬飛，王 金，胡錦萍，高 速，李 娜

(1.陜西中醫(yī)藥大學藥學院，陜西咸陽 712046；2.陜西中藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西咸陽 712046）

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根和根莖,臨床常用于胸痹心痛,心煩不眠,熱痹疼痛,月經(jīng)不調(diào),痛經(jīng)經(jīng)閉等［1］。紅花為菊科植物紅花Carthamus tinctoriusL.的干燥花。臨床常用于經(jīng)閉,痛經(jīng),胸痹心痛,跌撲損傷等［2］。丹參-紅花是近現(xiàn)代臨床常用的活血化瘀藥對,從中醫(yī)方劑數(shù)據(jù)庫和復方專利中檢索出同時含有丹參-紅花的方劑共2 646 首［3］；2015 年版《中國藥典》 一部成方制劑和《國家中成藥標準匯編》 中同時含丹參-紅花的方劑共30 首［4］。本研究以丹參-紅花為研究對象,采用cocktail 探針藥物法,以探針藥物的代謝消除百分率為指標［5］,評價丹參-紅花臨床配伍常用比例(1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1) 對大鼠細胞色素P450 (Cytochrome P-450,CYP450)酶活性的影響,同時采用實時熒光定量PCR (RT-PCR) 測定CYP450 酶中3 種亞型mRNA 的表達水平,為丹參-紅花最佳配伍比例的篩選提供數(shù)據(jù)支撐,并為探討其協(xié)同增效的機理奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器 戴安UltiMate 3000 全自動HPLC 儀［配置四元梯度泵、自動進樣器、二極管陣列檢測器、變色龍6.8 色譜工作站,賽默飛世爾(上海) 儀器有限公司］；Avanti JXN-26 高速冷凍離心機 (貝克曼庫爾特中國分公司)；ME204 雙量程電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Direct-Q 3UV 純化水機(美國Millipore 公司)；PHSJ-3F 型PH 計(上海精密儀器儀表有限公司)；多管漩渦混合器(杭州瑞誠儀器有限公司)；氮吹儀(上海喬躍儀器有限公司)；全自動分析心電圖機(深圳市科曼醫(yī)療設備有限公司)；ExicyclerTM96 熒光定量PCR 儀(韓國Bioneer 公司)；NanoDrop 2000 超微量紫外-可見分光光度計(美國Thermo公司)。

1.2 試劑 非那西丁(批號20151204,純度99.2%) 購于北京索萊寶科技有限公司；氯唑沙宗 (批號100364-201302,純度99.8%)、鬼臼毒素 (批號111645-200301,純度98.9%) 均購于中國食品藥品檢定研究院；咪達唑侖(批號171250- 200401；純度99.8%)；鹽酸異丙腎上腺素注射液(批號41150102) 購于上海禾豐制藥有限公司；RNA提取試劑盒(批號93956420,美國羅氏生物制藥有限公司)；Super M-MLV 反轉錄酶(批號PR6502,北京百泰克生物技術有限公司)；2×Power Taq PCR Master Mix 試劑(批號PR1702,北京百泰克生物技術有限公司)；SYBR Green 試劑(批號SY1020,北京索萊寶科技有限公司)；HyClone PBS 緩沖液(批號AAF203865,美國賽默飛世爾科技上海有限公司)；RNase inhibitor (批號RP5602,北京百泰克生物技術有限公司)；引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；還原型輔酶Ⅱ(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH) 四鈉(批號041939) 購于羅氏公司；考馬斯亮藍(批號20160415) 購于南京建成生物工程研究所；烏來糖(批號20140421) 購于上海山浦化工有限公司。TRIS-base、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、蔗糖、無水氯化鈣均為分析純,購自天津市天力化學試劑有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純(德國Merk 公司)；水為超純水；其余試劑均為分析純。

1.3 藥物 丹參、紅花均購于河北安國藥材市場,經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學藥學院白吉慶副教授鑒定,丹參為唇形科鼠尾草屬丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根及根莖,紅花為菊科紅花屬植物紅花Carthamus tinctoriusL.的干燥花。參照2015 版《中國藥典》 一部丹參、紅花藥材標準項下的內(nèi)容進行檢查,均符合標準。

1.4 動物 100 只SD 大鼠,SPF 級,體質量(200±10)g,由西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心提供,動物生產(chǎn)許可證號SCXK (陜) 2015-002。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 中藥提取液制備 按一定比例(3 ∶1、2 ∶1、1 ∶1)稱取丹參、紅花適量,加10 倍量水浸泡30 min,提取1 h,過濾,第2、3 次各加8 倍量水,每次提取1 h,濾過,濾液合并,分別減壓濃縮至1、0.75、0.5 g 生藥/mL,備用。

2.1.2 探針溶液、內(nèi)標溶液制備 分別精密稱取非那西丁和氯唑沙宗對照品適量,精密量取咪達唑侖注射液適量,加甲醇溶解,制成混合探針藥物溶液(非那西丁13.74、27.48、54.96、109.92、219.84 mg/L,氯唑沙宗7.42、14.84、29.67、59.35、118.70 mg/L,咪達唑侖 3.26、6.52、13.03、26.06、52.12 mg/L),4 ℃保存?zhèn)溆?。精密稱取鬼臼毒素對照品,甲醇制成12.28 mg/L 內(nèi)標溶液,備用。

2.2 動物造模 選擇心電圖正常的健康大鼠,試驗前測定并記錄Ⅱ導聯(lián)心電圖(紙速50 mm/s,1 mV=20 mm),腹腔注射5 mg/kg 鹽酸異丙腎上腺素制備動物模型［6-10］,連續(xù)給藥3 d,于最后1 次給藥30 min 后,用20%烏拉坦麻醉大鼠(1 g/kg) 并記錄心電圖。將造模前后的心電圖進行比較,具備下列條件之一者說明造模成功:①ST 段向上或向下偏移超過0.1 mV；②T 波高聳且超過同導聯(lián)R 波的1/2；③T 波高聳且伴有ST 段移位。

2.3 Cocktail 探針法評估丹參-紅花藥對對大鼠CYP450 酶活力的影響

2.3.1 分組與給藥 大鼠隨機分為空白對照組、模型組、丹參-紅花(3 ∶1) 組、丹參-紅花(2 ∶1) 組、丹參-紅花(1 ∶1) 組,每組10 只,每天灌胃1 次,灌胃體積2 mL,對照組和模型組給予蒸餾水,其余各組給予“2.1.1” 項下提取液,持續(xù)給藥15 d。

2.3.2 肝微粒體制備 末次給藥后,用20%烏拉坦麻醉大鼠(1 g/kg),快速打開腹腔,從門靜脈注射預先制冷的生理鹽水至肝臟呈土黃色,取出肝臟,用預先制冷的緩沖液清洗干凈,用濾紙吸干表面液體,剪碎肝臟組織,準確稱取3 g,加入80.5 g/L 蔗糖溶液12 mL,勻漿。勻漿液在4 ℃、10 000 r/min 離心20 min,取上清,置于離心管中,加入10 倍量9 g/L CaCl2,混合均勻,冰浴放置,5 min后,15 000 r/min 離心15 min,棄去上清液,即得微粒體。微粒體用Tris-HCL 緩沖液洗滌,15 000 r/min 離心15 min,取沉淀用18.17 g/L Tris-HCL 緩沖液重懸,使得每1 mL 含1.1mg 肝微粒體,取出部分稀釋,用于測定蛋白含有量,其余貯藏于-70 ℃用于體外孵育實驗。

2.3.3 體外溫孵 取上述肝微粒體的重懸液,每份100 μL,分別加入20 μL 混合探針藥物溶液(非那西丁109.92 mg/L、氯唑沙宗59.35 mg/L、咪達唑侖20.06 mg/L)和30 μL PBS 緩沖液,37 ℃水浴預孵育5 min,加入NADPH 啟動反應,使體系總體積為200 μL (肝微粒體終質量濃度0.6 mg/mL,NADPH 終質量濃度256.26 mg/L),37 ℃水浴孵育30 min,立即放入冰水浴中,加入4 ℃甲醇-乙腈(1 ∶1) 混合溶液600 μL 終止反應,再加20 μL 內(nèi)標溶液渦旋混勻1 min,12 000 r/min 離心10 min,取上清液,室溫下氮氣吹干。

2.3.4 探針底物測定 測定前用200 μL 流動相復溶“2.3.3” 項下殘渣,渦旋混勻1 min,0.22 μm 濾膜過濾,進樣15 μL,HPLC 分析非那西丁、氯唑沙宗及咪達唑侖。按下式計算各探針底物的代謝消除率,以評價CYP1A2、CYP2E1和CYP3A2的活性。

2.3.5 探針底物測定的HPLC 條件 ZORBAX StableBond 80? C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相甲醇(A) -水(B),梯度洗脫(0～5 min,30%～35% A；5～10 min,35%～38% A；10～15 min,38%～46% A；15～30 min,46%～54%A；30～45 min,54%～65%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長235 nm；進樣量15 μL。

2.3.6 探針底物HPLC 測定的方法學考察

2.3.6.1 專屬性考察 取空白肝微粒體孵育體系,含探針藥物和內(nèi)標物的肝微粒體孵育體系和給藥組肝微粒體的孵育體系,注入HPLC 儀,結果見圖1。由圖1 可知,3 種探針藥物與內(nèi)標物峰形對稱性好,基線平直,探針藥物、內(nèi)標物分離完全,無雜質峰干擾,且空白肝微粒體孵育體系對3 種探針藥物的測定無干擾。

圖1 大鼠肝微粒體中3 種探針藥物的HPLC 色譜圖

2.3.6.2 線性關系考察 取空白組的肝微粒體,精密加入適量各系列質量濃度的混合探針藥物溶液,每批3 份,按“2.3.3” 項下方法體外溫孵,按“2.3.4” 項下方法復溶后測定。以各探針藥物和內(nèi)標物的峰面積比值(Y) 為縱坐標,各探針藥物的質量濃度(X) 為橫坐標進行線性回歸,再以探針藥物峰響應信號與噪音信號比為10 時的探針藥物濃度為定量限,結果見表1。

2.3.6.3 精密度試驗 取空白組的肝微粒體,精密加入適量高(混標中非那西丁219.84 mg/L)、中(混標中非那西丁54.96 mg/L)、低(混標中非那西丁13.74 mg/L) 質量濃度的混合探針藥物溶液,各3 份,按“2.3.3” 項下方法體外溫孵,按“2.3.4” 項下方法復溶制得高、中、低質量控制(QC) 樣品,每個樣品1 d 內(nèi)重復測定5 次,計算日內(nèi)精密度；連續(xù)測定5 d,計算日間精密度。結果,非那西丁、氯唑沙宗和咪達唑侖日內(nèi)、日間峰面積RSD 分別為1.85%～6.58%、1.74%～3.5%、1.67%～2.7%。

表1 3 種探針藥物線性關系

2.3.6.4 穩(wěn)定性試驗 按“2.3.6.3” 項下方法制備高、中、低質量控制(QC) 樣品,每個時間點平行3 份,氮氣吹干后于4 ℃分別放置0、4、8、12、24 h,-20 ℃分別放置0、6、12、18、24、30 d,測定前按“2.3.4” 項下方法復溶,進行液相分析。結果,4 ℃下3 種探針藥物峰面積RSD 均小于0.9%,-20 ℃下均小于4.9%,表明非那西丁、氯唑沙宗和咪達唑侖在4 ℃時24 h 內(nèi)穩(wěn)定,-20 ℃時30 d內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.6.5 準確度試驗 按“2.3.6.3” 項下方法制備高、中、低質量控制(QC) 樣品,根據(jù)測定值與加入量的比值計算準確度。結果,非那西丁、氯唑沙宗、咪達唑侖的準確度分別在96.1%～100.2%、96.9%～103.2%、96.8%～99.9%之間,RSD 在1.0%～9.9%之間。

2.3.7 統(tǒng)計學分析 用SPSS 13.0 軟件進行分析,數(shù)據(jù)以() 表示。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2.3.8 結果 各給藥組非那西丁加入1.08 mg,氯唑沙宗加入1.19 mg,咪達唑侖加入0.52 mg,不同比例丹參-紅花對3 種探針藥物的代謝消除率見表2。由此可知,不同比例丹參-紅花藥對CYP1A2、CYP2E1和CYP3A2的活性均表現(xiàn)顯著的抑制作用(P＜0.05)。

表2 不同給藥組心肌缺血大鼠肝微粒體中3 種探針藥物的消除率（， n=10）

表2 不同給藥組心肌缺血大鼠肝微粒體中3 種探針藥物的消除率（， n=10）

注:與模型組比較*P ＜0.05,**P ＜0.01。

2.4 RT-PCR 法測定丹參-紅花藥對對大鼠CYP450 酶mRNA 表達的影響

2.4.1 分組與給藥 SD 大鼠隨機分為空白對照組、模型組、丹參-紅花(3 ∶1) 組、丹參-紅花(2 ∶1) 組、丹參-紅花(1 ∶1) 組,每組10 只,灌胃體積2 mL,每天給藥1次,對照組和模型組給予蒸餾水,其余各組給予“2.1.1”項下提取液,持續(xù)15 d。末次給藥后,20%烏拉坦(1 g/kg)麻醉大鼠,迅速取出肝臟組織,-80 ℃保存。

2.4.2 RNA 提取與濃度測定 按RNA 提取試劑盒說明書提取肝臟總RNA,并于260、280 nm 波長處測定吸光度OD260、OD280,兩者比值介于1.8～2.0 之間時,提取的RNA 純度視為合格。

2.4.3 引物設計及特異性驗證考察 基因β-actin、CYP1A2、CYP2E1和CYP3A2的引物由生工生物工程(上海) 有限公司合成,引物序列信息和擴增產(chǎn)物長度見表3。

表3 大鼠CYP450 酶引物序列

隨機選擇樣本進行RT-PCR 反應,結果β-actin、CYP1A2、CYP2E1和CYP3A2基因RT-PCR 擴增產(chǎn)物的融解曲線都為單一的特異峰,說明RT-PCR 中的熒光均為目的基因cDNA 擴增雙鏈DNA 發(fā)出的熒光,即引物特異性好,可進行后續(xù)的定量測定。見圖2～4。

圖2 CYP1A2 基因RT-PCR 擴增產(chǎn)物的融解曲線

圖3 CYP2E1 基因RT-PCR 擴增產(chǎn)物的融解曲線

圖4 CYP3A2 基因RT-PCR 擴增產(chǎn)物的融解曲線

2.4.4 RT-PCR 測定 將大鼠肝組織提取的總RNA 反轉錄合成cDNA,按下述體系進行RT-PCR 反應:cDNA 模板1 μL,10 μmol/L 正、反向引物各0.50 μL,SYBR GREEN(稀釋至20×) 0.3 μL,2×Power Taq PCR MasterMix 10 μL,用超純水H2O 補足至20 μL。RT-PCR 反應程序為94 ℃預變性5 min,94 ℃變性10 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,循環(huán)40 次。用RT-PCR 儀自帶軟件進行熒光定量分析,得出Ct,2-ΔΔCt法計算mRNA 的表達量。結果見表4。

表4 大鼠肝臟CYP450 酶3 種亞型mRNA 表達（，n=10）

表4 大鼠肝臟CYP450 酶3 種亞型mRNA 表達（，n=10）

注:與空白組比較,＃＃P ＜0.01；與模型組比較,* P ＜0.05,**P＜0.01。

由表4 可以看出,與空白組比較,模型大鼠肝臟組織中P450 酶3 種亞型的mRNA 的表達增加(P＜0.01)；與模型組比較,丹參-紅花不同比例均能夠抑制模型大鼠肝組織中P450 酶3 種亞型mRNA 表達,其抑制程度與丹參的劑量呈依賴性。其中,丹參-紅花(3 ∶1、2 ∶1) 組能顯著抑制模型大鼠CYP1A2、CYP2E1和CYP3A2mRNA 表達,丹參-紅花(1 ∶1) 組能顯著抑制模型大鼠CYP1A2mRNA 表達(P＜0.05),同時對CYP2E1和CYP3A2也具有抑制作用,但與模型組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

3 討論

丹參、紅花配伍比單獨使用丹參、紅花具有更好的藥理作用［5,11］。肝微粒體CYP450 是口服藥物進入體內(nèi)代謝的主要途徑,CYP1、CYP2和CYP3是參與藥物代謝的主要家族［13］。研究表明,不同病理生理因素可調(diào)節(jié)CYP450 同工酶的活性［14-16］。因此,本實驗采用急性心肌缺血模型大鼠研究丹參-紅花配伍對心肌缺血大鼠CYP450 酶活力及其mRNA 表達的影響,結果與文獻報道一致［12］。

目前已知的CYP1A2特異性代謝的藥物有非那西丁、咖啡因等［17-18］,咖啡因不易獲得,非那西丁價廉易得；CYP2E1特異性代謝的藥物有氯唑沙宗、對位硝基酚和N-亞硝基雙甲胺［19-20］,氯唑沙宗90%經(jīng)CYP2E1代謝生成6-羥基氯唑沙宗；咪達唑侖是人體CYP3A4特異性代謝藥物,CYP3A4是人體特有的,人體CYP3A4與大鼠體內(nèi)的CYP3A2相當［17,21］。因此,本研究選用非那西丁、氯唑沙宗和咪達唑侖為探針底物。

在含丹參、紅花的中藥復方中,兩者比例1 ∶1者占20.8%,2 ∶1 者占45.8%,3 ∶1 者占31.2%［22-23］,因此,本研究選用1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1。結果表明,3 ∶1 時對酶的抑制作用更顯著,這與藥效學研究結果［22］和臨床使用比例相吻合,推測該藥對協(xié)同增效機理可能與上述酶的活性有關。

當?shù)ⅰ⒓t花配伍比例為3 ∶1、2 ∶1 時,由于對CYP1A2、CYP2E1、CYP3A2活性有顯著的抑制作用,導致上述3 種酶對其特異性代謝藥物的代謝減慢。因此,在臨床上CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4的特異性代謝藥物與丹參、紅花(3 ∶1、2 ∶1) 聯(lián)合用藥時,建議應適當調(diào)整三者使用劑量。