劉永生 王金菊

(河南省中醫(yī)院， 河南 鄭州450002）

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC) 是一種常見的慢性腸道非特異性炎癥,好發(fā)于左半結(jié)腸及直腸,可累及整個結(jié)腸,病變主要局限在黏膜和黏膜下層［1］,以腹瀉、腹痛、黏液膿血便為主要臨床癥狀。該病給藥難度大、可反復發(fā)作,病程可多達幾十年甚至伴隨終生,是世界衛(wèi)生組織公認的難治性疾病［2］。此外,研究表明,該病可增加結(jié)腸癌的發(fā)病風險,降低了患者的生活質(zhì)量［3-4］。由于該病的發(fā)病機制尚未完全明確,目前普遍認為炎癥因子過度表達與免疫功能低下可能是其發(fā)病的主要原因,并與遺傳、環(huán)境和微生物感染等其他因素共同作用有關,臨床給藥仍以水楊酸類、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等化學藥為主,但化學藥長期使用的毒副作用較大,且患者的病情遷延不愈,導致出現(xiàn)較多停藥現(xiàn)象。五味子甲素是從五味子果實中分離出來的具有生物活性的木脂素,研究表明五味子甲素具有抗炎、抗自由基［5］、保肝及抑制胃腸平滑肌痙攣［6］等作用。本研究探討五味子甲素對大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的保護作用,并且進一步探討其作用機制,以期為進一步臨床開發(fā)應用提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 50 只SPF 級SD 大鼠,雌雄各半,體質(zhì)量(200±20) g,由河南省實驗動物中心提供,使用許可證號SYXK (豫) 2018-0014。大鼠給予標準顆粒飼料,自由飲用純凈水。恒溫動物室的溫度為(25±2)℃,相對濕度為(50±10)%,每小時通風換氣8 次,光照隨晝夜浮動。實驗開始前所有大鼠均適應性飼養(yǎng)1 周。

1.2 藥物與試劑 五味子甲素,批號61281-38-7,純度為98.8%,購自南京道斯夫生物科技有限公司；美沙拉嗪(批號201803),購自牡丹江恒遠藥業(yè)股份有限公司,國藥準字H20066027,純度為99.3%；三硝基苯磺酸,購自美國Sigma 公司；無水乙醇,購自上海凌峰化學試劑有限公司；干擾素-6 (interleukin-6,IL-6) 和干擾素-10 (interleukin-10,IL-10) 試劑盒,購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司；轉(zhuǎn)化生長因子β1 (transforming growth factor-β1,TGF-β1),購自北京百諾威生物科技有限公司；腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF) -α 試劑盒,購自北京欣博盛生物科技有限公司；Toll 樣受體4 (toll like receptor 4,TLR4)、核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor,NF) -κB p65、p-NFκB p65、NF-κB 抑制蛋白-α (inhibitor of NF-κB-α,IκBα)、p-IκB-α 抗體,購自美國Cell Signaling Technology 公司；RIPA 裂解液、β-肌動蛋白(β-actin) 抗體、HRP-羊抗大鼠IgG 二抗和ECL Prime 蛋白印跡試劑,購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 儀器 T323S 型電子天平,購自德國Sartorius 公司；EXL808 全自動酶標儀,購自美國Bio-Tek 公司；MSD97K49型微量離心機,購自美國Beckman 公司；DNM-9602G 自動酶標儀,購自美國Bio-Tek 公司；蛋白電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)膜儀、化學發(fā)光掃描儀,均購自美國Bio-Rad 公司。

2 方法

2.1 造模、分組和給藥 隨機選取8 只SD 大鼠作為正常對照組,自由飲用純凈水；其余42 只SD 大鼠采用三硝基苯磺酸/乙醇法造模。所有大鼠禁食不禁水24 h,采用10%水合氯醛(0.25 mL/100 g) 進行腹腔麻醉,將5%三硝基苯磺酸+50% 乙醇吸入注射器后連接一次性靜脈輸液針(2 mm) 并剪去針頭,插入肛門上段約8 cm,以0.02 mL/kg的劑量緩慢注入5%三硝基苯磺酸+50%乙醇,輕揉大鼠腹部l min。正常對照組大鼠除了用生理鹽水替代5%三硝基苯磺酸+50%乙醇溶液進行灌腸外,其他操作同造模大鼠。

造模后除正常對照組外,其他大鼠均出現(xiàn)腹瀉、黏液膿血便、進食減少等現(xiàn)象,造模后第4 天隨機選擇2 只大鼠脫臼處死,尸檢顯示結(jié)腸膜出現(xiàn)充血、水腫并伴有潰瘍形成,則提示建模成功。

將造模大鼠隨機分為模型對照組、美沙拉嗪組及五味子甲素高劑量組、中劑量和低劑量組,每組均為8 只。造模后第5 天各組開始給藥,五味子甲素高劑量組、中劑量組和低劑量組大鼠分別灌胃給予五味子甲素80、40、20 mg/kg,美沙拉嗪組大鼠灌胃給予美沙拉嗪0.4 g/kg,模型對照組和正常對照組大鼠分別灌胃給予同體積的生理鹽水。各組給藥時間均為2 周。

2.2 疾病活動指數(shù)的測定 實驗開始時每天觀察動物的體質(zhì)量、腹瀉和大便性狀等。按照Cooper 等［7］評分標準評估各組在給藥前、給藥1 周和給藥2 周時大鼠疾病活動指數(shù)(disease activity index,DAI) 的變化,DAI=(體質(zhì)量降低評分+大便形狀評分+血便評分)/3。具體評分標準見表1。

表1 DAI 評分標準

2.3 血清促炎和抑炎因子水平的測定 各組大鼠于給藥前、給藥1 周和2 周時尾靜脈取血各約0.5 mL,室溫下靜置30 min,待血液完全凝固后低溫離心后分離得血清,采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA) 法測定血清IL-6、IL-10、TGFβ1 和TNF-α 水平,操作時嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2.4 腸道黏膜通透性實驗 各組大鼠給藥2 周末給藥后禁食不禁水24 h,分別灌胃給予2 mL 乳果糖(lactose,L)和甘露醇(mannitol,M) 混合液(其中含5%乳果糖和2%甘露醇),將各組大鼠置于代謝籠,收集24 h 內(nèi)尿液,離心,取10 mL 尿液加2 mL 硫柳汞防腐,于-70 ℃貯存待測。采用高壓液相色譜分析法測定乳果糖和甘露醇水平,計算L/M 以評估各組大鼠腸道黏膜通透性。

2.5 結(jié)腸組織病理學評分 腸道黏膜通透性實驗結(jié)束后各組大鼠腔注射10%水合氯醛(0.25 mL/100 g) 進行麻醉,麻醉后分離結(jié)腸,留取距肛門2 cm 至回盲部結(jié)腸標本,用生理鹽水沖洗結(jié)腸,取1 cm 用于組織病理學檢測,其余組織于-80 ℃保存待用。用磷酸鹽緩沖液將結(jié)腸組織沖洗干凈后置于多聚甲醛溶液(40 g/L) 固定,常規(guī)石蠟包埋,切片,蘇木素-伊紅(HE) 染色,采用光學顯微鏡觀察結(jié)腸組織切片,以Dieleman 的標準［8］進行組織病理學評分,正常黏膜,評分為0；基底隱窩缺損＜1/3,評分為1；基底隱窩缺損≥2/3,評分為2；隱窩缺失,僅余表面上皮,伴炎細胞浸潤,評分為3；黏膜糜爛、潰瘍伴大量炎細胞浸潤,評分為4～5。

2.6 蛋白免疫印跡實驗 取各組結(jié)腸組織適量充分研磨,加入RIPA 裂解液,冰上裂解30 min,離心(14 000×g)15 min,收集上清,二喹啉甲酸(BCA) 法測定細胞總蛋白濃度,并將濃度調(diào)整至一致。各孔取40 μg 蛋白上樣,于15%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(10% 分離膠和5%濃縮膠) 電泳進行蛋白分離 (電壓 100 V,2～

2.5 min),采用電轉(zhuǎn)法(300 mA 電流60～90 min) 將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF) 膜,5%脫脂奶粉封閉1 h。用TBST 洗膜,加入一抗孵育4 ℃反應過夜。次日先以TBST 洗膜,加入二抗孵育,室溫反應1 h,再用TBST 洗膜,增強化學發(fā)光法顯色,全自動凝膠成像儀采集圖片。采用Image J 圖像分析管理系統(tǒng)對蛋白條帶灰度值進行分析,以TRL4、p-IκBα、IκBα、p-NF-κB p65、NF-κB p65 與內(nèi)參β-actin 條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

2.7 統(tǒng)計學分析 使用SPSS22.0 軟件進行分析,計量數(shù)據(jù)均通過正態(tài)性檢驗,以() 描述；多組間的比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗；重復觀測資料則行重復測量方差分析,兩兩組間比較采用LSD-t檢驗,兩兩時間比較采用差值t檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠給藥前后DAI 評分的比較 給藥前除正常對照組外,其他各組大鼠DAI 評分無差異(P＞0.05),并且均較正常對照組升高(P＜0.01)。給藥1 周和2 周時五味子甲素高劑量組大鼠DAI 評分較中劑量組和小劑量組降低(P＜0.05)；五味子甲素中劑量組大鼠DAI 評分較低劑量組降低(P＜0.05),模型對照組和五味子甲素低劑量組大鼠DAI 評分無差異(P＞0.05)；給藥1 周和2 周時美沙拉嗪組大鼠DAI 評分較模型對照組降低(P＜0.05)。見表2。

3.2 各組大鼠給藥前后血清炎癥因子水平的比較 給藥前除正常對照組外,其他各組大鼠血清TGF-β1、IL-6、IL-10和TNF-α 水平無差異(P＞0.05)；模型對照組大鼠血清IL-6 和TNF-α 水平較正常對照組升高,TGF-β1 和IL-10 水平較正常對照組降低(P＜0.01)。給藥1 周和2 周時五味子甲素高劑量組大鼠血清IL-6 和TNF-α 水平較中劑量組和小劑量組降低,TGF-β1 和IL-10 水平較中劑量組和小劑量組升高(P＜0.05)；五味子甲素中劑量組大鼠血清IL-6 和TNF-α 水平較低劑量組降低,TGF-β1 和IL-10 水平較低劑量組升高(P＜0.05)；而模型對照組和五味子甲素低劑量組大鼠TGF-β1、IL-6、IL-10 和TNF-α 水平 無差 異 (P＞0.05)。給藥1 周和2 周時美沙拉嗪組大鼠血清IL-6 和TNF-α 水平較模型對照組降低,TGF-β1 和IL-10 水平較模型對照組升高(P＜0.05)。見表3～4。

表2 各組大鼠給藥前后DAI 評分（分，， n=8）

表2 各組大鼠給藥前后DAI 評分（分，， n=8）

注:與正常對照組比較,aP＜0.01；與模型對照組比較,bP＜0.05；與五味子甲素低劑量組比較,cP＜0.05；與五味子甲素中劑量組比較,dP＜0.05。

表3 各組大鼠給藥前后血清TGF-β1 和IL-6 水平（pg/mL，， n=8）

表3 各組大鼠給藥前后血清TGF-β1 和IL-6 水平（pg/mL，， n=8）

注:與正常對照組比較,aP＜0.01；與模型對照組比較,bP＜0.05；與五味子甲素低劑量組比較,cP＜0.05；與五味子甲素中劑量組比較,dP＜0.05。

表4 各組大鼠給藥前后血清IL-10 和TNF-α 水平（pg/mL，， n=8）

表4 各組大鼠給藥前后血清IL-10 和TNF-α 水平（pg/mL，， n=8）

注:與正常對照組比較,aP＜0.01；與模型對照組比較,bP＜0.05；與五味子甲素低劑量組比較,cP＜0.05；與五味子甲素中劑量組比較,dP＜0.05。

3.3 各組大鼠腸道通透性的比較 給藥2 周時模型對照組大鼠尿液中乳果糖、L/M 比值較正常對照組升高,甘露醇較正常對照組降低(P＜0.01)；五味子甲素高劑量組大鼠尿液中乳果糖、L/M 比值均較中劑量組和小劑量組降低,甘露醇較中劑量組和小劑量組升高(P＜0.05)；五味子甲素中劑量組大鼠尿液中乳果糖、L/M 比值較低劑量組降低,甘露醇較低劑量組升(P＜0.05)；模型對照組和五味子甲素低劑量組大鼠尿液中乳果糖、甘露醇、L/M 比值無差異(P＞0.05)；美沙拉嗪組大鼠尿液中乳果糖、L/M 比值較模型對照組降低,甘露醇較模型對照組升高 (P＜0.05)。見表5。

表5 各組大鼠給藥2 周時腸道通透性和結(jié)腸組織病理學評分（， n=8）

表5 各組大鼠給藥2 周時腸道通透性和結(jié)腸組織病理學評分（， n=8）

注:與正常對照組比較,aP＜0.01；與模型對照組比較,bP＜0.05；與五味子甲素低劑量組比較,cP＜0.05；與五味子甲素中劑量組比較,dP＜0.05。

3.4 各組大鼠給藥2 周時結(jié)腸組織病理學評分的比較 給藥2 周時模型對照組大鼠結(jié)腸病理學評分較正常對照組升(P＜0.01)；五味子甲素高劑量組大鼠結(jié)腸組織病理學評分均較中劑量組和小劑量組降低(P＜0.05)；五味子甲素中劑量組大鼠結(jié)腸組織病理學評分較低劑量組降低 (P＜0.05)；模型對照組和五味子甲素低劑量組大鼠結(jié)腸組織病理學評分無差異(P＞0.05)；美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸組織病理學評分較模型對照組降低(P＜0.05)。見表5。

3.5 各組大鼠給藥2 周時結(jié)腸組織TLR4、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白 給藥2 周時模型對照組大鼠結(jié)腸組織TLR4、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白均正常對照組升高(P＜0.01)；五味子甲素高劑量組大鼠結(jié)腸組織TLR4、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白均較中劑量組和低劑量組降低(P＜0.05)；五味子甲素中劑量組大鼠結(jié)腸組織TLR4、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白均較 低劑量組降低 (P＜0.05)；模型對照組和五味子甲素低劑量組大鼠結(jié)腸組織TLR4、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白無差異(P＞0.05)；美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸組織TLR4、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白較模型對照組降低(P＜0.05)。見表6。

表6 各組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκB-α 和p-IκB-α 蛋白表達（， n=8）

表6 各組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκB-α 和p-IκB-α 蛋白表達（， n=8）

注:與正常對照組比較,aP＜0.01；與模型對照組比較,bP＜0.05；與五味子甲素低劑量組比較,cP＜0.05；與五味子甲素中劑量組比較,dP＜0.05。

4 討論

傳統(tǒng)中醫(yī)藥講究論本而治,五味子甲素為五味子果實主要活性物質(zhì)之一。已有研究［9］顯示,五味子甲素對三硝基苯磺酸誘導的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎有給藥作用,作用機制可能與其抑制炎癥因子NO、IL-6 及TNF-α 的產(chǎn)生有關。

本研究采用五味子甲素對大鼠實驗性結(jié)腸炎的保護作用及機制進行進一步研究,結(jié)果顯示,五味子甲素給藥1周和2 周時可劑量依賴性降低大鼠DAI 評分,且給藥2 周時可劑量依賴性降低結(jié)腸組織病理學評分,說明五味子甲素對大鼠實驗性結(jié)腸炎具有保護作用。

腸道黏膜在多種危險因素刺激下上皮屏障破壞,會導致腸組織的慢性炎癥性反應而發(fā)生潰瘍性結(jié)腸炎［10］。IL-6具有廣泛生物活性的促炎細胞因子［11］。TGF-β 是生長因子超家族中具有免疫負調(diào)控功能的一大類細胞因子家族［12］。IL-10 維持腸道正常黏膜免疫平衡。TNF-α 參與潰瘍性結(jié)腸炎的炎癥反應和免疫應答。本研究結(jié)果顯示,五味子甲素給藥1 周和2 周時可劑量依賴性降低大鼠血清IL-6 和TNFα 水平,升高大鼠血清TGF-β1 和IL-10 水平,說明五味子甲素對大鼠實驗性結(jié)腸炎的保護作用可能與其降低促炎細胞因子IL-6 和TNF-α,升高抑炎細胞因子TGF-β1 和IL-10有關。

目前研究顯示,潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機制可能與腸道黏膜屏障功能減弱有關［13-14］。L/M 值可間接且全面、準確地反映腸黏膜的通透性變化,L/M 值增大,說明潰瘍性結(jié)腸炎腸通透性增高,腸屏障功能損害［15］。本研究結(jié)果顯示,五味子甲素給藥2 周時可劑量依賴性大鼠尿液中L/M比值,說明五味子甲素可降低大鼠腸道黏膜通透性,這可能是其發(fā)揮潰瘍性結(jié)腸炎保護作用的機制。

NF-κB 是各種致病因子釋放和表達的關鍵［16-17］,后續(xù)產(chǎn)生級聯(lián)炎癥反應,使炎癥過程得以放大和持續(xù),從而損傷腸黏膜,最終導致潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生［18］。目前已知NF-κB 的活化是潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生發(fā)展的關鍵因素之一［19］。本研究結(jié)果顯示,五味子甲素給藥2 周時可劑量依賴性降低潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中蛋白表達水平,說明五味子甲素對大鼠潰瘍組織TLR4/NF-κB 信號通路具有抑制作用,這可能是其發(fā)揮潰瘍性結(jié)腸炎保護作用的機制。

五味子甲素對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠具有保護作用,可能與調(diào)控血清促炎和抑炎細胞水平,降低腸道黏膜通透性及抑制結(jié)腸組織中TLR4/NF-κB 信號通路有關。