趙芷含，龐 博，高 慧*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧 大連 116600；2.遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院，遼寧 營口 115009）

五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實,歸肺、心、腎經(jīng)。具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心的功效［1］。傳統(tǒng)理論有五味子“入嗽藥生用,入補藥熟用”［2］的說法。酒五味子和醋五味子是其常見的炮制品種,課題組前期已經(jīng)通過補腎陽、補腎陰等系列藥效學實驗證明了酒五味子的補益作用［3-4］。五味子及其不同炮制品抗衰老作用進行比較研究,從延緩衰老方面進一步證明酒五味子“入補藥熟用” 的傳統(tǒng)理論,為五味子臨床上的 “生熟異用” 提供現(xiàn)代藥理學依據(jù)。

隨著年齡的不斷增長,機體內(nèi)各抗氧化防御系統(tǒng)機能均有一定程度的減退,從而引起各組織和器官的氧化損傷,進一步導致組織及器官甚至機體的衰老［5］。因此,本實驗采用D-半乳糖建立實驗動物衰老模型,對衰老引起的機體內(nèi)各抗氧化防御系統(tǒng)及五味子抗衰老作用進行研究。

1 材料

1.1 儀器 數(shù)控超聲波清洗機(KQ-250DB 型,昆山市超聲儀器有限公司)；移液器 (美國Thermo 公司)；DW-86W100 臥式超低溫保存箱(青島海爾電器有限公司)；MultiskanMK3 酶標儀(美國Thermo 公司)；BX51、BX60光學顯微鏡 (日本Olympus 公司)；電熱恒溫水浴(DZKW-D-2 型,北京永光明醫(yī)療儀器有限公司)。

1.2 藥物與試劑 五味子飲片購自遼寧省大梨樹五味子GAP 基地,經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學王冰教授鑒定為北五味子的干燥成熟果實。D-半乳糖(北京索來寶科技有限公司公司,批號20231116)；超氧化物歧化酶試劑盒(superoxide dismutase,SOD) (批號BPE20348/T)、丙二醛試劑盒(malondialdehyde,MDA) (批號BPE20347/T)、還原型谷胱甘肽試劑盒 (reduced glutathione,GSH) (批號BPE20064/S)、總抗氧化能力試劑盒(total antioxidant capacity,T-AOC) (批號BPE20716)、乙酰膽堿酯酶試劑盒(acetylcholinesterase,AchE) (批號BPE20351/T)、D-乳酸試劑盒(D-lactace,D-LA) (批號BPE20072/T)、乳酸脫氫酶試劑 盒 (lactate dehydrogenase,LDH) (批 號BPE20034/T)、過氧化氫酶試劑盒(catalase,CAT) (批號BPE20880/S) 均購于上海郎頓生物科技有限公司。

1.3 動物 SPF 級昆明種小鼠120 只,雌雄各半,體質(zhì)量(20±2) g,由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供,動物生產(chǎn)許可證號SCXK (遼) 2015-0001。小鼠分籠飼養(yǎng),12 h/12 h晝夜循環(huán),自由飲水、進食,適應性飼養(yǎng)1 周。

2 方法

2.1 樣品溶液的制備

2.1.1D-半乳糖、維生素E 溶液制備 用生理鹽水將D-半乳糖配成50 mg/mL 溶液,玉米油將維生素E 配制成20 mg/mL藥液,貯存于4 ℃冰箱備用。

2.1.2 五味子及炮制品水煎液制備 按照前期確定的炮制工藝制備酒五味子、醋五味子［6］。取一定量的生五味子、酒五味子、醋五味子,分別加10 倍量水,加熱回流提取3次,每次1 h,合并濾液,濃縮,得到質(zhì)量濃度分別為90、180、360 mg/mL 的水煎液。

2.2 造模和給藥 將小鼠隨機分為12 組,每組10 只,即空白對照組、模型組、陽性對照組、生五味子(低、中、高) 劑量組、酒五味子(低、中、高) 劑量組、醋五味子(低、中、高) 劑量組。

模型組及各給藥組小鼠每天腹腔注射D-半乳糖0.5 g/kg (0.1 mL/10 g 體質(zhì)量),空白對照組注射等量生理鹽水,連續(xù)42 d。從造模開始后的第11 天開始給藥,陽性對照組灌胃維生素E 溶液,生、酒、醋五味子組分別灌胃不同劑量的五味子水煎液(0.1 mL/10 g 體質(zhì)量)?？瞻讓φ战M和模型組灌胃等容量的生理鹽水,連續(xù)給藥32 d。每3 d 稱定質(zhì)量1 次,給藥劑量根據(jù)體質(zhì)量變化而調(diào)整。

2.3 檢測指標 最后1 d 給藥2 h 后(禁食不禁水12 h),進行小鼠體質(zhì)量、抓力測試。摘眼球取血,離心,取上清,測定血清中CAT、SOD、GSH、MDA 水平。摘眼球取血處死后常規(guī)解剖,取出肝臟、脾臟進行稱重,計算臟器系數(shù)(臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量),斷頭,迅速取出全腦,稱重,分離左右腦,左腦于10%甲醛溶液中固定,石蠟包埋,切片,HE 染色,光鏡下觀察各腦組織的形態(tài)變化；右腦以1 ∶9 比例加入冷凍滅菌的生理鹽水中,用勻漿機反復勻漿制成10%腦組織勻漿,于冷凍式離心機中12 000 r/min 離心(4 ℃) 10 min,取上清液,測定腦勻漿中AchE、SOD、MDA、LDH、LA 水平。

2.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0 進行分析,數(shù)據(jù)以() 表示,組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 五味子及不同炮制品水煎液對小鼠體質(zhì)量的影響 在小鼠造模期間,體質(zhì)量的增長變化是反應其健康狀況及生長發(fā)育的重要指標［7］。各組小鼠初始體質(zhì)量無差異(P＞0.05),從第8 天開始,模型組小鼠體質(zhì)量增加幅度開始下降,其余各組小鼠體質(zhì)量均有不同幅度的增加,且模型組小鼠體質(zhì)量低于其余各組,隨著時間的增加,差異呈增大趨勢；模型組小鼠開始表現(xiàn)出毛色暗淡,毛發(fā)脫落,反應遲鈍,精神萎靡,行動遲緩等明顯的衰老特征。見表1。

表1 五味子及不同炮制品水溶液對D-半乳糖致衰老小鼠體質(zhì)量的影響（， n=8）

表1 五味子及不同炮制品水溶液對D-半乳糖致衰老小鼠體質(zhì)量的影響（， n=8）

注:與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01；與同劑量生品組比較,△P＜0.05,△△P＜0.01。

3.2 五味子及不同炮制品水煎液對小鼠抓力及臟器指數(shù)的影響 小鼠的抓力系數(shù)是反應衰老程度的重要指標之一(抓力系數(shù)=抓力/體質(zhì)量)。末次給藥后2 h 使用抓力器進行抓力測試,由表2 可知,與空白對照組比較,模型組小鼠的抓力系數(shù)及脾臟指數(shù)降低(P＜0.01),肝臟指數(shù)升高(P＜0.01)；與模型組比較,其余各組的抓力系數(shù)及脾臟指數(shù)均上升(P＜0.05,P＜0.01),肝臟指數(shù)均顯著下降(P＜0.05,P＜0.01)。

表2 五味子及不同炮制品水溶液對抓力系數(shù)及臟器指數(shù)的影響（， n=8）

表2 五味子及不同炮制品水溶液對抓力系數(shù)及臟器指數(shù)的影響（， n=8）

注:與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

3.3 五味子及不同炮制品對衰老小鼠血清CAT、SOD、GSH、T-AOC 水平的影響 如表3 所示,與模型組比較,空白和陽性對照組,生五味子中劑量組、酒五味子中劑量組、醋五味子中劑量組小鼠CAT 水平升高(P＜0.05,P＜0.01)；除生五味子低劑量組外,其余各組SOD 水平均高于模型組(P＜0.05,P＜0.01)；除生五味子低、高劑量,醋五味子高劑量組外,其余各組GSH 水平高于模型組(P＜0.05,P＜0.01)；各組T-AOC 水平高于模型組(P＜0.05,P＜0.01)。模型組與生、酒及醋品各劑量比較,中劑量CAT、GSH、SOD、T-AOC 水平最高。制品組與同劑量生品組比較,制品中劑量組高于生品中劑量組,其中酒五味子中劑量組優(yōu)于醋五味子；制品中劑量組SOD 水平雖高于生五味子中劑量組,但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表3 五味子及不同炮制品對血清中各指標的影響（， n=8）

表3 五味子及不同炮制品對血清中各指標的影響（， n=8）

注:與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01；與同劑量生品組比較,△P＜0.05。

3.4 五味子及不同炮制品對衰老小鼠腦組織AchE、SOD、MDA、LDH、D-LA 水平的影響 如表4 所示,與模型組比較,除生五味子低、高劑量,醋五味子低劑量組外,其余各組AchE 水平降低(P＜0.05,P＜0.01)；除生五味子低、高劑量組外,其余各組SOD 水平高于模型組(P＜0.05,P＜0.01)；除生五味子低、高劑量,醋五味子高劑量組外,其余各組MDA 水平低于模型組(P＜0.05,P＜0.01)；各組LDH 水平均低于模型組(P＜0.05,P＜0.01)；除生五味子高劑量組外,其余各組D-LA 水平均高于模型組(P＜0.05,P＜0.01)。模型組與生、酒及醋品各劑量比較,中劑量AchE、MDA、LDH 水平最低,SOD、D-LA 水平最高。制品組與同劑量生品組比較,制品中劑量組的AchE、MDA、LDH 水平低于生品中劑量組,SOD、D-LA 水平高于生品中劑量組,其中酒五味子中劑量組優(yōu)于醋五味子。

3.5 五味子及不同炮制品對衰老小鼠腦組織病理形態(tài)的影響 如圖1 所示,在光學顯微鏡下,空白對照組腦皮質(zhì)厚薄適度,各層細胞分布規(guī)律,神經(jīng)元分布均勻,細胞結(jié)構(gòu)清晰,核大而圓且位于中央,可見1～2 個核仁；模型組腦組織大量神經(jīng)元變性壞死,腦皮質(zhì)明顯變薄,神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,細胞體積縮小,三角形或多角形,染色加深,嗜伊紅增強,染為藍紫色,細胞核偏位或結(jié)構(gòu)不清,核仁不見；各給藥組腦皮質(zhì)輕度變薄,神經(jīng)元數(shù)量略減少,細胞體積縮小,三角形或多角形,染色加深,嗜伊紅增強,染為藍紫色,細胞核偏位或結(jié)構(gòu)不清。

表4 五味子及不同炮制品對腦組織各指標的影響（， n=8）

表4 五味子及不同炮制品對腦組織各指標的影響（， n=8）

注:與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01；與同劑量生品組比較,△P＜0.05,△△P＜0.01。

圖1 五味子及不同炮制品對小鼠腦組織病理形態(tài)學的影響（HE 染色，×400）

4 討論

衰老是一種不可逆的功能減退性的生理過程,是自然界必須遵循的自然規(guī)律,但衰老誘導的多種年齡相關(guān)退行性疾病,會嚴重影響人們的生活質(zhì)量,因此找到一種質(zhì)優(yōu)價廉的抗衰老藥物勢在必行。

D-半乳糖致衰老模型是目前國內(nèi)最常用的一種制備動物亞急性衰老的模型［8-9］。小鼠連續(xù)長期腹腔注射D半乳糖會導致體內(nèi)多種生化指標發(fā)生改變。氧化應激在腦老化及各種衰老相關(guān)的退行性疾病機制中發(fā)揮重要作用。動物體內(nèi)不斷地進行著新陳代謝,從而產(chǎn)生活性氧副產(chǎn)物(ROS),ROS 的積聚導致一些細胞大分子發(fā)生氧化損傷,從而加劇老化。SOD 和CAT 在活性氧的代謝過程中發(fā)揮著重要作用；機體內(nèi)的MDA 能引起細胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞,其含量可間接反應體內(nèi)自由基對機體的氧化損傷程度［10］；AchE 能使腦組織中在調(diào)節(jié)學習記憶功能中起重要作用的Ach 含量降低；GSH 能有效緩解機體內(nèi)的氧化損傷,是重要的抗氧化劑和自由基清除劑。機體的免疫功能也與衰老密切相關(guān)。脾臟和肝臟是機體重要的免疫器官,免疫系統(tǒng)在衰老過程中經(jīng)歷結(jié)構(gòu)和功能的變化,各免疫器官功能減弱是衰老的特征之一,因此脾臟和肝臟指數(shù)的高低在一定程度上能反映機體免疫功能狀況及衰老程度。

D-半乳糖是一種氧化劑,可以誘導各器官的衰老。陳慧等［11］考察了D-半乳糖致小鼠衰老的最佳劑量,因此選擇500 mg/kg 作為本實驗造模藥給藥劑量。本實驗中,我們觀察到五味子及不同炮制品水煎液可以通過抑制ROS 的積聚和脂質(zhì)過氧化反應,使復雜的抗氧化系統(tǒng)抵抗氧化應激,通過調(diào)節(jié)SOD、GSH、MDA 及CAT 等指標,從而使體內(nèi)完成了自我進化,達到了抗衰老的目的。

本實驗首次進行了酒五味子的抗衰老作用研究,首次全面系統(tǒng)的采用五味子及兩種不同炮制品水煎液對D-半乳糖致衰老小鼠進行抗衰老作用研究。關(guān)于造模方式,是在查閱文獻的基礎(chǔ)上篩選出的現(xiàn)有使用最多且造模成功率最高的一種方法,并在預實驗中進行驗證。綜上所述,五味子及不同炮制品水煎液對D-半乳糖致衰老小鼠具有抗衰老作用,并且酒五味子作用更為顯著,為酒五味子“入補藥熟用” 提供了有力的現(xiàn)代藥理學依據(jù)。