張林超

(河南省中醫(yī)院泌尿外科，河南 鄭州 450002）

白花蛇舌草Hedyotis diffusaWilld 屬茜草科耳草屬植物,別名尖刀草、白花十字草、二葉葎等,始載于《廣西中藥志》,具有利尿除濕、消痛散結(jié)及清熱解毒之功效?，F(xiàn)代藥學(xué)研究［1］發(fā)現(xiàn),白花蛇舌草具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗感染及免疫調(diào)節(jié)等作用,其活性成分包括黃酮類(lèi)、蒽醌類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)、烷烴類(lèi)、甾體類(lèi)、萜類(lèi)及多糖類(lèi)。白花蛇舌草多糖為白花蛇舌草的活性成分之一,具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及抗氧化等多種生物活性［2］。白花蛇舌草多糖對(duì)肝癌、宮頸癌、非小細(xì)胞肺癌及胃癌等的增殖均有抑制作用,對(duì)腎癌的研究報(bào)道較少［3-5］。同時(shí),鑒于白花蛇舌草多糖具有較好的增強(qiáng)免疫能力［6］,而腎癌又被公認(rèn)為免疫原性腫瘤,對(duì)免疫治療較敏感［7］。因此,本研究通過(guò)皮下接種Renca 細(xì)胞建立腎癌荷瘤小鼠模型,主要探討白花蛇舌草多糖對(duì)腎癌荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)及免疫調(diào)節(jié)作用的影響,為其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞株 昆明種小鼠,雄性,SPF 級(jí),體質(zhì)量(20±2) g,購(gòu)于斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK (京) 2016-0002。小鼠腎癌Renca 細(xì)胞,購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物與試劑 白花蛇舌草多糖(純度＞80%),批號(hào)20180216,西安天瑞生物技術(shù)有限公司；黃芪多糖(純度＞85%),批號(hào)20181125,陜西昂盛生物科技有限公司；RPMI1640 培養(yǎng)液及胎牛血清,美國(guó)Hyclone 公司；刀豆蛋白A (ConA) 及噻唑藍(lán)(MTT) 檢測(cè)試劑盒,美國(guó)Sigma 公司；CD4、CD8 抗體,上海瑞齊生物技術(shù)有限公司；干擾素-γ (IFN-γ) 和白細(xì)胞介素-2 (IL-2) 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) 檢測(cè)試劑盒,上海迪奧生物技術(shù)公司。

1.3 儀器 MCO-20AIC 型CO2培養(yǎng)箱,日本三洋公司；Fh1004N 電子天平,上海民橋精密儀器公司；TDZ6B-WS離心機(jī),上海盧湘儀器公司；RT-6000 酶標(biāo)儀,深圳雷杜生物科學(xué)公司；FV1000 顯微鏡,日本Olympus 公司；Facscalibur 流式細(xì)胞儀,美國(guó)BD 公司。

2 方法

2.1 腎癌荷瘤小鼠模型建立 小鼠腎癌Renca 細(xì)胞用RPMI1640 (10%胎牛血清+100 U/mL 青霉素+100 U/mL 鏈霉素) 培養(yǎng)液,于5% CO2、37 ℃條件下在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),收獲細(xì)胞,加適量磷酸鹽緩沖液(PBS) 調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL。于小鼠右后肢外側(cè)皮下處接種250 μL,每日觀察小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況,7 d 后注射處見(jiàn)約5 mm 的腫瘤結(jié)節(jié)視為腎癌荷瘤小鼠模型建立成功。

2.2 分組及給藥 將荷瘤小鼠隨機(jī)分為荷瘤模型組、黃芪多糖組及白花蛇舌草多糖高、低劑量組,每組12 只；另隨機(jī)選取未造模小鼠12 只作為正常組。正常組及荷瘤模型組小鼠灌胃等體積的蒸餾水,黃芪多糖組及白花蛇舌草多糖高、低劑量組分別灌胃100 mg/kg 黃芪多糖和200、100 mg/kg白花蛇舌草多糖,1 次/d,持續(xù)給藥14 d。

2.3 瘤質(zhì)量、抑瘤率及免疫器官指數(shù)測(cè)定 末次給藥結(jié)束后24 h,頸椎脫臼法處死小鼠,剝離瘤體后,分別稱(chēng)瘤質(zhì)量及體質(zhì)量,經(jīng)75%乙醇消毒后,取免疫器官(脾臟及胸腺),稱(chēng)重。抑瘤率=［(荷瘤模型組平均瘤質(zhì)量-藥物處理組平均瘤質(zhì)量)/荷瘤模型組平均瘤質(zhì)量］×100%,免疫器官指數(shù)=免疫器官(脾臟或胸腺) 質(zhì)量/體質(zhì)量。

2.4 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及CTL 殺傷活性測(cè)定 將無(wú)菌分離的小鼠脾臟置于200 目尼龍網(wǎng)上,輕輕碾壓擠碎,制備單個(gè)脾細(xì)胞懸液,加入Tris-NH4Cl 溶液(0.01%) 使紅細(xì)胞溶解,PBS 漂洗后,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/mL。取100 μL脾細(xì)胞懸液置于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,加入終濃度5 μg/mL的ConA,常規(guī)條件培養(yǎng)72 h 后,采用MTT 法測(cè)570 nm 處光密度(OD)。小鼠脾細(xì)胞懸液(5×106/mL) 為效應(yīng)細(xì)胞,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期小鼠腎癌Renca 細(xì)胞(1×105/mL) 為靶細(xì)胞,等比例混合后常規(guī)條件培養(yǎng)24 h,采用MTT 法測(cè)490 nm 處OD,計(jì)算CTL 殺傷活性。CTL 殺傷活性=［1-(OD實(shí)驗(yàn)孔-OD效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔)/OD靶細(xì)胞對(duì)照孔］ ×100%

2.5 外周血T 淋巴CD4+和CD8+細(xì)胞亞群測(cè)定 小鼠在處死前摘眼球取血,取100 μL 放于EP 管中,分別加入抗CD4+及CD48+抗體各10 μL,冰水浴上避光放置30 min。加入100 μL 紅細(xì)胞裂解液,完全混勻,繼續(xù)避光放置10 min裂解紅細(xì)胞,離心(1 000 r/min) 5 min,棄掉上清液,沉淀用500 μL PBS 溶液重懸后,于流式細(xì)胞儀中檢測(cè)。

2.6 血清IFN-γ 和IL-2 水平測(cè)定 剩余小鼠眼球血加肝素鈉抗凝后,離心(3 000 r/min) 5 min,分裝上層血清于-20 ℃冰箱中備用。采用ELISA 法,按照對(duì)應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)中的操作步驟測(cè)定血清IFN-γ 和IL-2 水平。

2.7 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS18.0 軟件進(jìn)行處理,符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以() 表示,各組小鼠體質(zhì)量、瘤質(zhì)量、免疫器官指數(shù)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及CTL 殺傷活性、CD4+和CD8+細(xì)胞亞群比例,血清IFN-γ 和IL-2 水平對(duì)比采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 白花蛇舌草多糖對(duì)腎癌荷瘤小鼠體質(zhì)量及腫瘤生長(zhǎng)的影響 與正常組比較,荷瘤模型組小鼠體質(zhì)量下降(P＜0.05)；與荷瘤模型組比較,黃芪多糖及白花蛇舌草多糖高、低劑量組小鼠體質(zhì)量均有不同程度的增加,其中黃芪多糖及白花蛇舌草多糖高劑量組體質(zhì)量增加(P＜0.05)。此外,與荷瘤模型組比較,黃芪多糖及白花蛇舌草多糖高、低劑量組小鼠瘤質(zhì)量均下降(P＜0.05),各組的抑瘤率分別為35.61%、31.81%、21.97%。以上結(jié)果提示,白花蛇舌草多糖對(duì)腎癌荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)具有抑制作用。見(jiàn)表1。

表1 白花蛇舌草多糖對(duì)腎癌荷瘤小鼠體質(zhì)量及腫瘤生長(zhǎng)的影響（， n=12）

表1 白花蛇舌草多糖對(duì)腎癌荷瘤小鼠體質(zhì)量及腫瘤生長(zhǎng)的影響（， n=12）

注:與正常組比較,*P＜0.05；與荷瘤模型組比較,＃P＜0.05。

3.2 白花蛇舌草多糖對(duì)腎癌荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)的影響 與正常組比較,荷瘤模型組小鼠脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)均降低(P＜0.05)；與荷瘤模型組比較,黃芪多糖及白花蛇舌草多糖高、低劑量組小鼠脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)均增加(P＜0.05)。以上結(jié)果提示,白花蛇舌草多糖可以改善荷瘤小鼠免疫能力。見(jiàn)表2。

表2 白花蛇舌草多糖對(duì)腎癌荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)的影響（， n=12）

表2 白花蛇舌草多糖對(duì)腎癌荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)的影響（， n=12）

注:與正常組比較,*P＜0.05；與荷瘤模型組比較,＃P＜0.05。

3.3 白花蛇舌草多糖對(duì)腎癌荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及CTL殺傷活性的影響 與正常組比較,荷瘤模型組小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度及CTL 殺傷活性均降低(P＜0.05)；與荷瘤模型組比較,黃芪多糖及白花蛇舌草多糖高、低劑量組小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度及CTL 殺傷活性均升高(P＜0.05)。以上結(jié)果提示,白花蛇舌草多糖可以通過(guò)提高小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度及增強(qiáng)小鼠CTL 殺傷活性來(lái)促進(jìn)荷瘤小鼠免疫功能的提高。見(jiàn)表3。

表3 白花蛇舌草多糖對(duì)腎癌荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及CTL 殺傷活性的影響（， n=12）

表3 白花蛇舌草多糖對(duì)腎癌荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及CTL 殺傷活性的影響（， n=12）

注:與正常組比較,*P＜0.05；與荷瘤模型組比較,＃P＜0.05。

3.4 白花蛇舌草多糖對(duì)腎癌荷瘤小鼠外周血T 淋巴CD4+和CD8+細(xì)胞亞群的影響 與正常組比較,荷瘤模型組小鼠外周血T 淋巴CD4+細(xì)胞百分比及CD4+/CD8+比值降低,而CD8+細(xì)胞百分比增加(P＜0.05)；與荷瘤模型組比較,黃芪多糖及白花蛇舌草多糖高、低劑量組小鼠外周血T 淋巴CD4+細(xì)胞百分比及CD4+/CD8+比值增加,而CD8+細(xì)胞百分比降低(P＜0.05)。見(jiàn)表4、圖1。

表4 白花蛇舌草多糖對(duì)腎癌荷瘤小鼠外周血T 淋巴CD4+和CD8+細(xì)胞亞群的影響（， n=12）

表4 白花蛇舌草多糖對(duì)腎癌荷瘤小鼠外周血T 淋巴CD4+和CD8+細(xì)胞亞群的影響（， n=12）

注:與正常組比較,*P＜0.05；與荷瘤模型組比較,＃P＜0.05。

圖1 白花蛇舌草多糖對(duì)腎癌荷瘤小鼠外周血T 淋巴CD4+和CD8+細(xì)胞亞群的影響

3.5 白花蛇舌草多糖對(duì)腎癌荷瘤小鼠血清IFN-γ 和IL-2 水平的影響 與正常組比較,荷瘤模型組小鼠血清IFN-γ 和IL-2 水平均降低(P＜0.05)；與荷瘤模型組比較,黃芪多糖及白花蛇舌草多糖高、低劑量組小鼠血清IFN-γ 和IL-2水平均增加(P＜0.05)。以上結(jié)果提示,提高荷瘤小鼠血清IFN-γ 和IL-2 水平可能是白花蛇舌草多糖抑制腫瘤生長(zhǎng)的潛在機(jī)制。見(jiàn)表5。

4 討論

白花舌草多糖對(duì)多種腫瘤均有抑制作用。研究發(fā)現(xiàn),其可以抑制人肺腺癌A549 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［8］,該作用與下調(diào)組織金屬蛋白酶表達(dá)及阻斷EGFR/Akt/ERK 信號(hào)通路有關(guān)。Wu 等［9］證實(shí),白花舌草多糖對(duì)人喉鱗癌Hep2 細(xì)胞的增殖具有時(shí)間和劑量依賴(lài)性的抑制作用。體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),白花蛇舌草多糖對(duì)肝癌H22 和骨肉瘤S180 荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)均有抑制作用［10］。本研究通過(guò)皮下接種Renca細(xì)胞建立腎癌荷瘤小鼠模型,給予模型小鼠高、低劑量的白花蛇舌草多糖14 d 后,發(fā)現(xiàn)不同劑量的白花蛇舌草多糖均可以降低模型小鼠的瘤質(zhì)量,抑瘤率分別為31.81% 和21.97%,表明HDP 對(duì)腎癌荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)同樣具有抑制作用。

表5 白花蛇舌草多糖對(duì)腎癌荷瘤小鼠血清IFN-γ 和IL-2水平的影響（， n=12）

表5 白花蛇舌草多糖對(duì)腎癌荷瘤小鼠血清IFN-γ 和IL-2水平的影響（， n=12）

注:與正常組比較,*P＜0.05；與荷瘤模型組比較,＃P＜0.05。

免疫器官是機(jī)體內(nèi)發(fā)生免疫應(yīng)答的重要場(chǎng)所,免疫器官指數(shù)可以客觀的反映免疫器官的免疫水平和發(fā)育功能［11］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與荷瘤模型組比較,白花蛇舌草多糖高、低劑量組小鼠脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)均明顯增加。淋巴細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化是評(píng)價(jià)淋巴細(xì)胞功能強(qiáng)弱的重要指標(biāo),檢測(cè)小鼠淋巴細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化可以有效反映小鼠細(xì)胞免疫能力的高低［12］。細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞為CTL 細(xì)胞,測(cè)定CTL 殺傷活性是評(píng)價(jià)機(jī)體細(xì)胞免疫功能的重要手段,同時(shí)也是評(píng)價(jià)藥物對(duì)免疫系統(tǒng)影響的重要方法［13］。瞿俊勇等人研究發(fā)現(xiàn)［14］,白花蛇舌草多糖可以調(diào)節(jié)免疫抑制小鼠的免疫功能。本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn),與荷瘤模型組比較,白花蛇舌草多糖高、低劑量組小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度及CTL 殺傷活性均顯著升高。以上結(jié)果表明,白花蛇舌草多糖可以通過(guò)增加免疫器官重量、提高小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度及增強(qiáng)小鼠CTL 殺傷活性來(lái)促進(jìn)荷瘤小鼠免疫功能的提高。

在機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)過(guò)程中,T 細(xì)胞亞群發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［15］。在生理?xiàng)l件下,機(jī)體內(nèi)各T 淋巴細(xì)胞亞群之間相互作用,保持動(dòng)態(tài)的平衡以維持機(jī)體正常免疫功能；當(dāng)動(dòng)態(tài)平衡被打破,不同淋巴細(xì)胞亞群功能和數(shù)量發(fā)生異常時(shí),可引起免疫功能下降并導(dǎo)致病理性改變［16］。在成熟T 淋巴細(xì)胞表面,CD4、CD8 不能同時(shí)表達(dá),因而成熟的T淋巴細(xì)胞分為CD4+T 淋巴細(xì)胞亞群和CD8+T 淋巴細(xì)胞亞群。T 淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)對(duì)惡性腫瘤的診斷、治療及預(yù)后均有重要意義,其中CD4+T 淋巴細(xì)胞數(shù)目增加會(huì)提升免疫能力,CD8+T 淋巴細(xì)胞數(shù)目減少會(huì)抑制腫瘤生長(zhǎng),CD4+/CD8+比值降低被公認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞免疫功能處于抑制狀態(tài)的表現(xiàn)［17］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與荷瘤模型組比較,HDP 高、低劑量組小鼠外周血T 淋巴CD4+細(xì)胞百分比及CD4+/CD8+比值增加,而CD8+細(xì)胞百分比降低,表明白花蛇舌草多糖可以通過(guò)調(diào)節(jié)T 細(xì)胞亞群比例發(fā)揮抑制腎癌荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的作用。

IFN-γ 和IL-2 等細(xì)胞因子與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后存在著緊密聯(lián)系,在腫瘤免疫治療中發(fā)揮重要作用［18］。IFN-γ 也稱(chēng)調(diào)節(jié)免疫型干擾素,可通過(guò)免疫調(diào)節(jié)作用、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、影響腫瘤細(xì)胞周期、抗血管生成等發(fā)揮抗腫瘤作用［19］。研究發(fā)現(xiàn),在惡性腫瘤患者體內(nèi)IL-2 表達(dá)明顯降低,其含量高低與腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)；IL-2 含量的提高,可以促進(jìn)T 細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原的敏感性,增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫作用［20］。陳培豐等［21］發(fā)現(xiàn),龍葵提取物可以抑制Lewis 肺癌移植瘤的生長(zhǎng),該作用與升高荷瘤小鼠血清IFN-γ、IL-2 水平有關(guān)。本研究同樣發(fā)現(xiàn),與荷瘤模型組比較,白花蛇舌草多糖高、低劑量組小鼠血清IFN-γ 和IL-2 水平均顯著增加,表明提高荷瘤小鼠血清細(xì)胞因子水平可能是白花蛇舌草多糖抑制腎癌荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的潛在機(jī)制。

綜上所述,白花蛇舌草多糖對(duì)腎癌荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)具有抑制作用,該作用與免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。