唐 萍，陳文培，陸紫琪，楊 威，林寶琴，桂蜀華*

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司，廣東省藥物非臨床評(píng)價(jià)研究企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510990）

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR) 是糖尿病最常見和最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一,是全球成年人致盲的主要原因［1］。在中國(guó),23%糖尿病患者并發(fā)DR［2］。隨著糖尿病發(fā)病率逐年增加,DR 發(fā)病形勢(shì)日益嚴(yán)峻,如果不采取緊急措施,2030 年全球DR 病人將高達(dá)191 00 萬(wàn)［3］。高血糖引起血流灌注減少和內(nèi)皮細(xì)胞損傷等血管功能障礙,導(dǎo)致視網(wǎng)膜局部缺血缺氧,繼而誘發(fā)新生血管形成［4-5］。氧化應(yīng)激是引起DR 的重要病理機(jī)制［6-7］。因此,抑制氧化應(yīng)激和保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)于防治DR 具有重要意義。

丹紅化瘀口服液由丹參、當(dāng)歸、川芎、桃仁、紅花、柴胡和枳殼組成,具有活血化瘀、行氣通絡(luò)的功效,可用于氣滯血瘀引起的視物模糊和視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞癥的吸收期。本課題組發(fā)現(xiàn)丹紅化瘀口服液有效防治自發(fā)性Ⅱ型糖尿病ZDF 大鼠DR［8］和鏈脲佐菌素(STZ) 誘導(dǎo)的大鼠DR［9］,且減輕高糖誘導(dǎo)的EA.hy926 細(xì)胞損傷［10］。本實(shí)驗(yàn)采用CoCl2誘導(dǎo)的EA.hy926 細(xì)胞缺氧損傷模型,從抗氧化角度研究丹紅化瘀口服液含藥血清對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用,進(jìn)一步探討其防治DR 的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 雄性SD 大鼠(SPF 級(jí)),體質(zhì)量(220±20) g,購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK (粵) 2013-0020。

1.2 細(xì)胞 EA.hy926 細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。

1.3 藥物和試劑 丹紅化瘀口服液(批號(hào)B5A002) 購(gòu)于廣州白云山和記黃埔中藥有限公司。DMEM 培養(yǎng)基(批號(hào)8114125)、胰蛋白酶(批號(hào)1369113) 購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司；胎牛血清(批號(hào)1407738) 購(gòu)于以色列Biological Industries 公司；青鏈霉素混合液 (100X,批號(hào)20140415)購(gòu)于北京Solarbio 公司；CoCl2·6H2O (批號(hào)G7021)、噻唑藍(lán)(MTT) (批號(hào)MKBP4399V) 購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司；Annexin V-FITC 凋亡試劑盒,包含Annexin V binding buffer 10X (批號(hào)E10075-1634)、Annexin V FITC (批號(hào)EOO887-1638)、Propidium Iodide staining soLution (批 號(hào)E14525-106),均購(gòu)于美國(guó)eBioscience 公司；硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)(Thiobarbituric Acid Reactive Substances,TBARS) (批號(hào)0458288)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px) 檢測(cè)試劑盒(批號(hào)0473965) 購(gòu)于美國(guó)Cayman公司；M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (貨號(hào)6210A)、SYBR?Premix Ex TaqTM定量PCR 試劑盒(貨號(hào)RR420A) 購(gòu)于日本TaKaRa 公司。

1.4 儀器 MCO-20AIC 型細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本三洋電機(jī)株式會(huì)社)；L535R 型臺(tái)式冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室開發(fā)有限公司)；BDS300 型倒置生物顯微鏡(重慶奧特光學(xué)儀器有限公司)；SW-CJ-2FD 型潔凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；Multiskan FC 型酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛公司)；2300-001M 型熒光酶標(biāo)儀(PerkineLmer 公司)；FACSCantoTM II 型流式細(xì)胞儀 (美國(guó)BD 公司)；7500 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(美國(guó)ABI 公司)。

2 方法

2.1 溶液配制

2.1.1 丹紅化瘀口服液含藥血清制備 大鼠丹紅化瘀口服液的給藥劑量為3.2 mL/kg,連續(xù)灌胃5 d,于末次給藥1 h后頸動(dòng)脈采血,3 000 r/min離心,分離血清,于56 ℃溫育30 min 滅活,經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌,-20 ℃保存?zhèn)溆?。試?yàn)時(shí)用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

2.1.2 CoCl2溶液制備 稱取0.237 9 g CoCl2·6H2O,溶于1 L DMEM 培養(yǎng)基中,混勻,0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌,配制母液濃度為1 000 μmol/L,4 ℃避光保存。試驗(yàn)時(shí)用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

2.2 缺氧模型的建立 EA.hy926 細(xì)胞用含10% 胎牛血清和1%青/鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基,培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制備細(xì)胞懸液,以5×103/孔接種于96 孔板,待細(xì)胞貼壁后,每孔分別加入終濃度10、50、100、200、400、600、800、1 000 μmol/L CoCl2溶液,培養(yǎng)12、24、48、72 h。MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力,篩選最佳造模濃度和時(shí)間。

2.3 丹紅化瘀口服液含藥血清對(duì)正常細(xì)胞活力的影響 細(xì)胞以5×103/孔接種于96 孔板。待細(xì)胞貼壁后,分別加入終濃度為1%、5%、10%、20%的空白血清或含藥血清,培養(yǎng)24、48、72 h。MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力,篩選最佳給藥濃度。

2.4 丹紅化瘀口服液含藥血清對(duì)缺氧誘導(dǎo)損傷細(xì)胞的活力的影響 細(xì)胞以5×103/孔接種于96 孔板,待細(xì)胞貼壁后,給藥組每孔加入終濃度為400 μmol/L 的CoCl2溶液,并分別加入終濃度為1%、5%、10% 的含藥血清,孵育48 h,MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力。

2.5 丹紅化瘀口服液含藥血清對(duì)缺氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響 按“2.4” 項(xiàng)下的方法進(jìn)行造模和給藥。棄培養(yǎng)基,PBS 洗滌細(xì)胞,用連接緩沖液重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106～5×106/mL。取100 μL 細(xì)胞懸液,加入5 μL 的Annexin V-FITC,室溫孵育10～15 min,連接緩沖液洗滌、重懸細(xì)胞,往細(xì)胞懸液中加入5 μL 的PI,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.6 丹紅化瘀口服液含藥血清對(duì)缺氧誘導(dǎo)損傷細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 按“2.4” 項(xiàng)下方法進(jìn)行造模和給藥。棄培養(yǎng)基,PBS 洗滌細(xì)胞,2.5% 戊二醛溶液固定,1% 鋨酸溶液再次固定,梯度乙醇脫水,再以丙酮、環(huán)氧樹脂812 處理,超薄切片,飽和醋酸雙氧鈾溶液染色,水洗,烘干,于透射顯微鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)并拍照。

2.7 丹紅化瘀口服液含藥血清對(duì)缺氧誘導(dǎo)損傷細(xì)胞上清MDA 水平和GSH-Px 活力的影響 按“2.4” 項(xiàng)下方法進(jìn)行造模和給藥,收集細(xì)胞上清液,按TBARS 試劑盒說明書操作,采用硫代巴比妥酸法測(cè)細(xì)胞上清液MDA 水平,酶標(biāo)儀設(shè)定波長(zhǎng)為530～540 nm,檢測(cè)各孔的OD。按GSH-Px 試劑盒說明書操作,采用二硫?qū)ο趸郊姿岱y(cè)定細(xì)胞上清液GSH-Px 活力,酶標(biāo)儀設(shè)定波長(zhǎng)為340 nm,檢測(cè)各孔的OD,每分鐘1 次,共5 min,計(jì)算結(jié)果。

2.8 丹紅化瘀口服液含藥血清對(duì)缺氧誘導(dǎo)損傷細(xì)胞mRNA表達(dá)的影響 按 “2.4” 項(xiàng)下的方法進(jìn)行造模和給藥。TRIzol 法提取RNA,加焦碳酸二乙酯(DEPC) 水溶解沉淀。超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 溶液濃度,OD260/OD280值在1.8～2.0 之間說明RNA 純度滿足要求。取總RNA 1.5 μg,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,收集逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR 反應(yīng)。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、GAPDH)、低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1,HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1 (vascular endothelial growth factor receptor 1,VEGFR1)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2 (vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inductible nitric oxide synthase,iNOS) 引物序列見表1,按RT-PCR 儀操作規(guī)范進(jìn)行PCR 試驗(yàn),反應(yīng)條件為95 ℃變性30 s,95 ℃退火3 s,60 ℃延伸34 s,共45 個(gè)循環(huán)?！鰿t=Ct目的基因-CtGAPDH,△△Ct=△Ct實(shí)驗(yàn)-△Ct對(duì)照,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以2-△△Ct表示。

表1 引物序列

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0 軟件,計(jì)量資料以() 表示,多組間比較用單因素方差分析。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 缺氧模型的建立 圖1 顯示,隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞的OD逐漸增加,提示細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。隨著CoCl2作用濃度增加,細(xì)胞的OD逐漸降低,當(dāng)CoCl2濃度為400 μmol/L,培養(yǎng)時(shí)間為48 h 時(shí),增殖抑制率約40%。因此,選擇CoCl2濃度為400 μmol/L,培養(yǎng)時(shí)間為48 h 作為缺氧模型建立的條件。

3.2 丹紅化瘀口服液含藥血清對(duì)細(xì)胞活力的影響 圖2A顯示,20%空白血清和丹紅化瘀口服液含藥血清處理24、48、72 h 均能提高正常細(xì)胞的活力,而1%～10%空白血清和DHK 含藥血清對(duì)正常細(xì)胞的活力均無(wú)影響,因此,選擇1%、5%、10%丹紅化瘀口服液含藥血清進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖2B 顯示,將1%、5%、10%丹紅化瘀口服液含藥血清分別與400 μmol/L CoCl2共孵育48 h 后,5%、10%含藥血清能劑量依賴性地促進(jìn)缺氧細(xì)胞的生長(zhǎng)(P＜0.01)。

圖1 CoCl2 對(duì)細(xì)胞活力的影響（n=6）

圖2 丹紅化瘀口服液含藥血清對(duì)正常細(xì)胞（A） 和缺氧細(xì)胞（B） 活力的影響（n=4）

3.3 丹紅化瘀口服液含藥血清對(duì)缺氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響圖3 顯示,與正常組相比,模型組細(xì)胞凋亡率增加(P＜0.01)。與模型組相比,5%、10% 丹紅化瘀口服液含藥血清劑量依賴性降低細(xì)胞凋亡率(P＜0.05,P＜0.01)。

3.4 丹紅化瘀口服液含藥血清對(duì)缺氧誘導(dǎo)損傷細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 圖4 顯示,正常組細(xì)胞胞質(zhì)均勻,細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常,少見空泡,核仁圓潤(rùn)明顯,染色質(zhì)分布均勻；模型組細(xì)胞收縮,形態(tài)扭曲,胞質(zhì)中大量線粒體腫脹甚至空泡樣改變,胞核固縮,核仁消失,染色質(zhì)凝聚；丹紅化瘀口服液含藥血清組細(xì)胞形態(tài)呈類圓形,結(jié)構(gòu)完整,胞質(zhì)中可見少量線粒體腫脹空泡樣改變,胞核形態(tài)正常,核仁清晰可見,少部分染色質(zhì)凝聚。

3.5 丹紅化瘀口服液含藥血清對(duì)缺氧誘導(dǎo)損傷細(xì)胞上清的MDA 水平和GSH-Px 水平的影響 圖5 顯示,與正常組相比,模型組細(xì)胞上清液MDA 水平升高,而GSH-Px 水平下降(P＜0.01)；與模型組比較,給予10%丹紅化瘀口服液含藥血清培養(yǎng)48 h 后,細(xì)胞MDA 水平下降約40%,GSHPx 水平升高約95% (P＜0.01)。

圖3 丹紅化瘀口服液含藥血清對(duì)缺氧誘導(dǎo)損傷細(xì)胞凋亡的影響（n=6）

圖4 各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)電子顯微鏡圖

圖5 丹紅化瘀口服液含藥血清對(duì)缺氧誘導(dǎo)損傷細(xì)胞MDA 水平（A） 和GSH-Px 水平（B） 的影響（n=6）

3.6 丹紅化瘀口服液含藥血清對(duì)缺氧誘導(dǎo)損傷細(xì)胞的mRNA 表達(dá)的影響 圖6 顯示,與正常組相比,模型組細(xì)胞HIF-1α、VEGF、VEGFR1、VEGFR2、iNOSmRNA 表達(dá)均增加(P＜0.01)。與模型組相比,5%、10%含藥血清呈劑量依賴性降低細(xì)胞HIF-1α、VEGF、VEGFR1、VEGFR2 及iNOS的mRNA 表達(dá)(P＜0.01)。

4 討論

CoCl2是一種常用于體外細(xì)胞缺氧造模的誘導(dǎo)劑,其機(jī)制主要與穩(wěn)定胞內(nèi)HIF-α 持續(xù)表達(dá)有關(guān)［11］。HIF-α 是缺氧狀態(tài)下最重要的轉(zhuǎn)錄因子,與HIF-β 形成異源二聚體HIF,識(shí)別并結(jié)合調(diào)控基因中的低氧反應(yīng)元件,激活靶基因如VEGF 等的轉(zhuǎn)錄［12］。本實(shí)驗(yàn)中用400 μmol/L CoCl2孵育EA.hy926 細(xì)胞48 h,使細(xì)胞活力明顯下降,細(xì)胞凋亡,細(xì)胞HIF-1α的mRNA 呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài),說明該模型成功建立。5%～10%含藥血清劑量依賴性地提高缺氧誘導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)活力,減少凋亡,說明丹紅化瘀口服液對(duì)缺氧所致?lián)p傷的細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。

圖6 丹紅化瘀口服液含藥血清對(duì)缺氧誘導(dǎo)損傷細(xì)胞的mRNA 表達(dá)的影響（n=3）

細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化被認(rèn)為在退行性眼病尤其是DR 中扮演著重要的角色［13］。MDA 是細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物,其濃度的高低可用于脂質(zhì)過氧化損傷程度的評(píng)估［14-15］。DR 病人血清中MDA 水平遠(yuǎn)高于其他沒有代謝性疾病的眼病患者［16］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下細(xì)胞上清液中MDA 水平顯著升高,含藥血清可以有效降低細(xì)胞的MDA 水平。這提示著丹紅化瘀口服液有降低脂質(zhì)過氧化而減輕缺氧損傷的作用。

抗氧化系統(tǒng)在氧化應(yīng)激過程中尤為重要。高血糖和缺氧狀態(tài)下,GSH-Px 等抗氧化酶大量消耗,使得視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞處于氧化應(yīng)激和硝基化應(yīng)激狀態(tài),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致早期DR 血流動(dòng)力學(xué)改變和微血管病變［17-18］。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下,細(xì)胞上清液中GSH-Px 水平顯著下降,而含藥血清可以有效地提高細(xì)胞上清液中GSHPx 水平。結(jié)果提示,丹紅化瘀口服液能增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力,從而對(duì)抗缺氧損傷。

VEGF 是DR 發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵因子,與其特異性受體結(jié)合后,既可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及移行來誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管形成,又可顯著增加視網(wǎng)膜血管的通透性,加速DR 的發(fā)展［8,19］。本實(shí)驗(yàn)中 缺氧誘導(dǎo) 的細(xì)胞中VEGF、VEGFR1 以及VEGFR2 mRNA 均明顯上升。含藥血清下調(diào)VEGF、VEGFR1 以及VEGFR2 mRNA 過表達(dá),提示丹紅化瘀口服液可以抑制VEGF、VEGFR1 以及VEGFR2 的高表達(dá),從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。

缺氧時(shí),細(xì)胞iNOS 表達(dá)異常高,誘導(dǎo)NO 大量合成［20］。過量的NO 會(huì)與超氧陰離子自由基反應(yīng),生成具有強(qiáng)氧化性的過氧化亞硝酸離子,進(jìn)而分解成有毒物質(zhì),加速細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化,促使內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［21］。含藥血清降低缺氧誘導(dǎo)細(xì)胞中iNOS的mRNA 高表達(dá),提示丹紅化瘀口服液可以抑制iNOS高表達(dá)來保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。

綜上所述,丹紅化瘀口服液含藥血清可抑制缺氧所致細(xì)胞增殖、凋亡和形態(tài)改變,升高細(xì)胞GSH-Px 水平,降低MDA 水平,下 調(diào)HIF-1α、VEGF、VEGFR1、VEGFR2、iNOSmRNA 過表達(dá),可見其可通過抗氧化作用來減輕缺氧所致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷。