白 宇，楊麗霞，賀 云，楊 倩，孟祥云，王永勝

(1.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州73000；2.陜西省榆林市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 榆林 719000；3.甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州 730050；4.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

糖尿病腎病 (diabetic nephropathy,DN) 是糖尿病(diabetes mellitus,DM) 常見的嚴重的慢性微血管并發(fā)癥之一,是導致終末期腎病的主要原因,死亡率較高［1］。DN的發(fā)病機制目前尚未闡明,現(xiàn)代醫(yī)學認為其機制主要與糖脂代謝紊亂、血流動力學改變、細胞因子、炎性反應、氧化應激、遺傳等因素有關,其主要病理改變?yōu)槟I臟中腎小球足細胞數(shù)量減少、腎小球基底膜增厚、腎小球系膜增生,最后發(fā)展為腎小球硬化和腎間質纖維化。目前DN 的臨床療效較差,因此發(fā)掘治療DN 安全、有效的中藥單體或復方備受腎病學界的關注。

高血糖刺激多種免疫炎癥信號通路的激活及其相關炎癥因子的分泌失調是導致DN 發(fā)生、發(fā)展的主要原因［2］,其中TTLR4/NF-κB 通路是介導免疫炎癥反應的關鍵信號通路［3］。大量的臨床和實驗研究發(fā)現(xiàn)當歸及其相關復方可通過調節(jié)糖尿病腎病腎組織的免疫反應,發(fā)揮保護及治療DN的作用,進一步研究發(fā)現(xiàn)當歸中具有藥理活性的成分包括揮發(fā)油、多糖、黃酮以及有機酸等。其中當歸多糖對多種疾病表現(xiàn)出較好的治療效果,具有抗腫瘤、抗氧化和調節(jié)免疫等作用［4］,但其對DN 的治療作用尚未見報道,因此本研究將當歸多糖應用于對糖尿病腎病大鼠的治療,觀察其治療效果并基于腎組織TLR4/NF-κB 通路及單核細胞趨化因子(monocyte chemotactic factor,MCP-1)、腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-1 (interleukin-1,IL-1) 的表達,探討當歸多糖對糖尿病腎病的作用機制。

1 材料

1.1 動物 SD 大鼠60 只,10 周齡,雌雄各半,SPF 級,體質量(200±10) g,購于甘肅中醫(yī)藥大學［動物生產(chǎn)許可證號SCXK(甘) 2015-0002］,飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF 級實驗室,溫度22～24 ℃,相對濕度50%～70%,適應性喂養(yǎng)1 周后開始實驗。

1.2 藥物及試劑 當歸多糖(批號CY170321,純度≥98%) 購自陜西慈緣生物技術有限公司,用無菌PBS 配制成200 mg/mL 溶液,并過濾除菌,得到貯存液。厄貝沙坦片(批號4A294) 購自杭州賽諾菲制藥有限公司,用無菌PBS 配制成6.75 mg/mL 溶液,并過濾除菌,得到貯存液。鏈脲霉素(批號B57377) 購自美國Sigma 公司。鼠抗人TLR4 單克隆抗體、兔抗人NF-κB (P-p65) 多克隆抗體、兔抗人 MYD88 多克隆抗體 (批號分別為8217052、4041556、821705157) 購自美國GeneTex 公司；逆轉錄試劑盒、Q-PCR 試劑盒(批號分別為A140704A、AA1102-1)購自日本TaKaRa 公司；尿微量蛋白測定試劑盒(批號A045-2) 購自南京建成生物工程研究所有限公司。引物均由日本TaKaRa 公司合成,見表1。

表1 引物序列

1.3 儀器 高速低溫離心機(湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司)；超低溫冰箱(中科美菱低溫科技有限責任公司)；Western blot 轉膜儀、電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；化學發(fā)光成像儀(北京賽智科技有限公司)；正置光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；自動凝膠成像系統(tǒng)(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)；血糖儀(德國羅氏公司)；實時定量Agilent PCR 儀(美國安捷龍公司)；酶標儀(美國Bio-Rad 公司)；轉輪切片機(美國Stoelting 公司)。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 參考文獻［5］ 方法,大鼠適應性飼養(yǎng)1 周后,按照隨機數(shù)表法隨機抽取10 只給予普通飼料喂養(yǎng),其余50 只大鼠給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)4 周,復制模型前禁食不禁水12 h,腹腔注射鏈脲佐菌素 (STZ)35 mg/kg,72 h 后取尾靜脈血測定血糖,若空腹血糖＞16.7 mmol/L,確認為糖尿病模型,未成功模型追加1 次STZ (17.5 mg/kg)。繼續(xù)喂養(yǎng)4 周,用代謝籠收集24 h尿,24 h尿蛋白＞30 mg 的大鼠即為糖尿病腎病大鼠,取造模成功的40 只大鼠隨機分為5 組,模型組、陽性對照組(厄貝沙坦) 及當歸多糖低、中、高劑量組(將當歸多糖儲存液分別稀釋至50、100、200 mg/mL,使低、中、高劑量組灌藥容量均為2 mL/kg),每組8 只,雌雄各半,每天灌胃給藥。從普通喂養(yǎng)的大鼠中挑選8 只作為正常組,正常組和模型組灌服等容量蒸餾水,灌胃4 周,每日1 次。

2.2 樣本采集 各組大鼠在給藥4 周后禁食不禁水,代謝籠中收集24 h 尿液,-20 ℃保存待測,腹主動脈采血,分離血清,-20 ℃保存。采血后處死大鼠,分離腎臟,縱向切開成若干份,根據(jù)不同檢測方法,分別置于4% 多聚甲醛和液氮中儲存,待測。

2.3 一般情況與血糖、24 小時尿蛋白的檢測 觀察大鼠一般狀況、飲水量、攝食量。其中在STZ 注射前后、灌藥4 周末采尾靜脈取血檢測血糖,檢測代謝籠收集的24 h 尿液中蛋白。

2.4 腎組織形態(tài)學特征 腎組織在4% 多聚甲醛中固定1 周,進行梯度酒精和二甲苯脫水。浸蠟包埋,待干燥后,切成4 μm 厚切片,貼片后,逆上述脫水步驟,進行水化,蘇木素室溫染色5 min,水洗,鹽酸酒精分色,水洗,伊紅染色30 s,按上述脫水步驟進行脫水透明,封片后顯微鏡下觀察。

2.5 RT-PCR 實驗 從液氮中取出保存的腎組織,在勻漿器中迅速研碎后加入適量TRIzol,在冰上繼續(xù)研磨成勻漿,并靜置5 min,13 000 r/min 離心10 min,取上清加入1/5體積TRIzol 的氯仿,室溫靜置5 min,13 000 r/min 離心10 min,取上清水相,加入等體積異丙醇,室溫靜置10 min,13 000 r/min 離心10 min,收集沉淀,75%乙醇洗滌2 次,室溫晾干,加水溶解(以上皆用無RNA 酶試劑耗材完成)。然后經(jīng)過RNA 含量檢測、去基因組DNA 反應、cDNA 合成反應和實時熒光定量PCR 反應檢測組織中mRNA 表達。熒光定量反應程序為預變性95 ℃、10 min、循環(huán)數(shù)1；擴增95 ℃、15 s,60 ℃、15 s,72 ℃、30 s、循環(huán)數(shù)40。用2-△△Ct表示基因相對表達量。

2.6 Western blot 實驗 取大鼠新鮮腎臟組織,加入RIPA 裂解液,置于冰上研碎至勻漿后,4 ℃放置30 min,13 000 r/min離心10 min,取一部分上清,BCA 試劑盒檢測蛋白濃度,另一部分上清加入上樣緩沖液,煮沸變性后,加到4%濃縮膠濃縮,10%分離膠分離,再經(jīng)過轉膜、封閉、4 ℃孵育一抗(TLR4、MyD88、NF-κB 稀釋比例分別為1 ∶2 000、1 ∶2 000、1 ∶3 000)、室溫孵育二抗 (TLR4、MyD88、NF-κB 稀釋比例1 ∶6 000)、ECL 發(fā)光液顯色、電子曝光等步驟,最后進行數(shù)據(jù)分析。

2.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0 軟件進行分析,計量資料以() 表示,多組間比較用單因素方差分析,組間兩兩比較用LSD 分析,方差不齊時用Dunnett’s 法。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 一般情況分析 正常組大鼠精神狀態(tài)良好,反應機敏,毛發(fā)柔順而光澤,飲食正常,體質量增加,尿量正常,糞便呈棕褐色顆粒狀,墊料干燥；其他各組大鼠則不同程度出現(xiàn)精神倦怠萎靡,喜蜷臥睡覺,毛發(fā)晦暗無光澤,不柔滑,腹部皮毛潮濕且有腥臭味,活動量少,進食量多,飲水量也明顯增多,每日換下的墊料潮濕,飼養(yǎng)盒底部存有大量尿液。后期大鼠極度虛弱,其中模型組大鼠癥狀表現(xiàn)最為嚴重,經(jīng)藥物治療4 周后,中藥各劑量組和陽性對照組大鼠情況有所改善,反應比之前靈敏,毛發(fā)稍微有光澤,進食量和飲水量均少于模型組。

3.2 STZ 注射前后大鼠血糖比較 STZ 注射前各組大鼠血糖比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),血糖在正常范圍內,與STZ 注射前相比,除正常組外,STZ 注射后模型組及各藥物干預組血糖升高(P＜0.01)。與STZ 注射后相比,給藥4周末厄貝沙坦組、當歸多糖高劑量組血糖下降(P＜0.05)。給藥4 周末,與模型組比較,各藥物干預組血糖下降(P＜0.01)。見表2。

表2 各組大鼠血糖變化（，mmol/L）

表2 各組大鼠血糖變化（，mmol/L）

注:同一組下,與STZ 注射前比較,**P＜0.01；與STZ 注射后比較,＃P＜0.05；同一時間下與模型組比較,▲▲P＜0.01。

3.3 24 小時尿微量白蛋白的比較 與STZ 注射前相比,除正常組外,STZ 注射后4 周各組大鼠24 h 尿蛋白均增加(P＜0.01)；與STZ 注射后相比,給藥4 周末厄貝沙坦組24 h尿蛋白下降(P＜0.01)。給藥4 周末,與模型組比較,各藥物干預組24 h 尿蛋白下降(P＜0.05)。見表3。

表3 各組大鼠24 h 尿蛋白變化（x±s，mg/24 h）

3.4 腎組織病理變化 正常組大鼠腎臟組織結構整齊、清晰,腎小球形態(tài)正常,腎小管官腔正常且不規(guī)則,胞質染色正常；與正常組相比,模型組腎小管管腔變大,管腔內可見透明管型,空泡化明顯,胞質染色變淺,腎小管上皮細胞核固縮,腎小球體積變小,核固縮明顯；與模型組相比,陽性藥物組中腎小管管腔明顯變小,未見空泡化改變,胞質染色相對加深,腎小球體積增大；與模型組相比,隨著當歸多糖劑量的增加腎小管管腔基本正常,胞質染色明顯加深,腎小球體積增大,無固縮；高劑量組與陽性藥物組的病理改變幾乎一致。見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理變化（HE，×200）

3.5 腎組織中炎癥因子mRNA 表達 與正常組相比,模型組大鼠腎組織中MCP-1、TNF-α、IL-1 mRNA 表達升高(P＜0.01)；與模型組相比,厄貝沙坦組大鼠腎組織中MCP-1、TNF-α、IL-1 mRNA 表達降低,當歸多糖中劑量組大鼠腎組織中TNF-αmRNA 表達降低,當歸多糖高劑量組大鼠腎組織中MCP-1、TNF-α、IL-1 mRNA 表達降低(P＜0.05,P＜0.01)。見圖2。

3.6 腎組織中TOLL 樣信號通路中TLR4、MyD88、NF-κB（p65） mRNA 表達 與正常組相比,模型組大鼠腎組織中TLR4、MyD88、NF-κB(p65) mRNA表達升高(P＜0.01)；與模型組相比,陽性藥物組大鼠腎組織TLR4、MyD88、NFκB(p65) mRNA 降低,當歸多糖中劑量組大鼠腎組織TLR4 和MyD88 mRNA 表達、當歸多糖高劑量組大鼠腎組織TLR4、MyD88、NF-κB(p65) mRNA 表達降低(P＜0.01,P＜0.05)。見圖3。

圖2 當歸多糖對糖尿病大鼠腎組織中MCP-1、 TNF-α、IL-1 mRNA 表達的影響

3.7 腎組織中TOLL 樣信號通路中TLR4、MyD88、NF-κB（P-p65） 蛋白表達 與正常組相比,模型組大鼠腎組織中TLR4、MyD88 和NF-κB (P-p65) 蛋白表達升高 (P＜0.01)；與模型組相比,厄貝沙坦組大鼠腎組織TLR4、MyD88、NF-κB (P-p65) 蛋白表達降低,當歸多糖中劑量組大鼠腎組織MyD88 和NF-κB (P-p65) 蛋白表達降低,當歸多糖高劑量組大鼠腎組織TLR4、MyD88 和NF-κB (Pp65) 蛋白表達降低(P＜0.05,P＜0.01)。見圖4。

4 討論

DN 是糖尿病致死率較高的慢性并發(fā)癥之一,難以根治,目前臨床上應用中西醫(yī)結合治療能有效的減輕DN 患者的臨床癥狀,改善其生活質量［6］,但其中的機制尚不明確,故本研究采用中藥單體當歸多糖干預糖尿病腎病大鼠,為探索其效果及可能的治療機制。本研究通過高脂高糖飼料聯(lián)合STZ 注射建立DN 大鼠模型,經(jīng)當歸多糖干預后,與模型組相比,高劑量組DN 大鼠在第4 周血糖顯著降低,提示當歸多糖對糖尿病腎病具有一定的緩解作用,其具體分子機制尚需進一步研究。以上雖未直接證明當歸多糖對DN 腎組織炎癥反應有緩解作用,但由于DN 腎組織中的炎癥反應是由高血糖引起的,因此當歸多糖可通過降低血糖間接緩解DN 腎組織炎癥反應。

圖3 當歸多糖對糖尿病大鼠腎組織中TLR4、MyD88、 NF-κB mRNA 表達的影響

DN 發(fā)病過程中,腎功能會逐漸受到損害,腎功能損害導致尿液中24 h 尿蛋白明顯升高,因此,可通過24 h 尿蛋白的變化判斷DN 腎功能的改變［7］。為研究當歸多糖是否對DN 腎組織具有保護作用,本研究對DN 大鼠24 h 尿蛋白進行了檢測,結果發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過當歸多糖干預4 周后,盡管各組大鼠24 h 尿蛋白一直處于上升趨勢,但與模型組相比,低、中、高劑量組均出現(xiàn)顯著下降,這一結果提示當歸多糖對糖尿病腎病腎組織具有保護作用。

圖4 當歸多糖對糖尿病大鼠腎組織中TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白表達的影響

炎癥反應是DN 腎組織損傷的重要原因,DN 患者血液中高血糖可激活腎組織多條介導炎癥的信號通路,TLR4/NF-κB 信號通路就是其中一條。在高糖因素的刺激下,激活了細胞膜上的TLR4,通過相關接頭蛋白如:MyD88、IRAK-2、IRAK-4 等介導胞內信號傳遞,最終激活NF-κB,NF-κB 進入細胞核內轉錄、翻譯［8-11］,使得大量炎癥因子如MCP-1、IL-1、TNF-α 等炎癥因 子被釋放入血［12-15］,MCP-1 進入血液后激活和趨化巨噬細胞等免疫細胞聚集在腎組織中,增加細胞外基質沉積［16-17］,TNF-α 可以改變腎小球基底膜的通透性,刺激成纖維細胞增殖,引起腎臟微血管結構改變［18-20］,IL-1 介導中性粒細胞浸潤,損傷內皮細胞,同時誘導其他炎癥因子的釋放,具有擴大效應［21-22］這些炎癥因子的釋放加快了DN 的發(fā)生發(fā)展。

上述研究已初步證實當歸多糖對DN 腎組織具有保護作用。為進一步證實這種保護作用是否是通過抑制TLR4/NF-κB 炎癥信號通路實現(xiàn)的,本研究對各組大鼠腎組織中TLR4/NF-κB 信號通路中蛋白和基因進行檢測,結果發(fā)現(xiàn)與模型組相比,高劑量組腎組織中TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白和基因降低。為證實當歸多糖是通過減少炎癥因子的釋放從而達到保護腎臟的作用,本研究對腎組織中MCP-1、TNF-α、IL-1 mRNA 進行檢測,結果發(fā)現(xiàn)當歸多糖高劑量組可明顯降低上述三種因子的表達,對糖尿病腎病腎組織起到保護作用。

綜上,當歸多糖可降低糖尿病腎病大鼠血糖,延緩腎組織損傷,對糖尿病腎病大鼠腎組織具有保護作用,其保護機制是當歸多糖有效抑制TLR4/ NF-κB 信號通路中TLR4、MyD88、NF-κB 的蛋白和基因表達,降低MCP-1、TNF-α、IL-1 的釋放從而減輕腎組織中的炎癥反應,延緩DN 的進展。