吳相歡，田民義*，趙曉歌，陸廷亞，韋 鳳，鄧國棟

(1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省藥食同源植物資源開發(fā)工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550025）

紅球姜Zingiber zerumbet(L.) Smith 為姜科姜屬植物,根莖具有芳香氣味,主要分布在國內(nèi)云南、廣西、廣東及國外斯里蘭卡、尼泊爾、孟加拉、馬來西亞、印度等地［1-2］,既可藥用,又可食用,其根莖能祛風(fēng)解毒,治療感冒、發(fā)燒、腹痛、胃痙攣、胃腸脹氣、咳嗽、食欲不振、細菌感染、過敏、皮膚病等,并能提取芳香油作調(diào)合香精原料,嫩莖葉可當(dāng)蔬菜［2-4］。藥理研究表明,它具有抗腫瘤［5］、鎮(zhèn)痛［6］、抗炎［7］、抗瘧疾［8］、抗氧 化［9］、抗 微生物［10］等作用,球姜酮為其主要活性成分,屬于倍半萜類,有著抗菌［5］、抗腫瘤［11］、抗炎［12］、抗高膽固醇［13］、抗乙酰膽堿酯酶活性［14］,以及鎮(zhèn)痛［15］、胃保護［16］、肝 保護［17］、改善糖尿病作用［18］。

目前,紅球姜已被開發(fā)為香料和茶飲料產(chǎn)品,其揮發(fā)油開發(fā)為化妝品,并作為傳統(tǒng)民間藥被廣泛使用,球姜酮為其主要藥理活性成分,而且含量高,故可將其作為藥材質(zhì)量的評價指標(biāo)。本實驗旨在開發(fā)一種簡單、便捷、高純度的球姜酮制備方法,以期用于紅球姜質(zhì)量評價,并為該成分藥理研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 紅球姜于2018 年10 月采自廣西玉林,經(jīng)貴州大學(xué)熊源新教授鑒定為姜科姜屬紅球姜Zingiber zerumbet(L.) Smith,標(biāo)本保存于貴州省藥食同源植物資源開發(fā)工程技術(shù)研究中心。薄層色譜硅膠(青島海洋化工有限公司)。乙腈、甲醇為色譜純(德國Merck 公司)；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 Agilent 1260 分析型高效液相色譜儀(美國Agilent Technologies 公 司)；HP6890/5975C GC/MS 聯(lián)用儀(美國安捷倫公司)；JEOL ECX-400 核磁共振儀(日本電子株式會社)；HP5973 質(zhì)譜儀(美國惠普公司)；FA2004型電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油提取 稱取500 g 鮮紅球姜地下根莖,粉碎后置于2 L 圓底燒瓶中,加入1 L 蒸餾水,連接揮發(fā)油提取器,微沸4 h 后將提取器中的液體放入分液漏斗中,加入適量正己烷萃取,正己烷層用無水Na2SO4除水,濾過,減壓濃縮除去溶劑,即得(0.51 g)。

2.2 揮發(fā)油GC-MS 鑒定 分析條件為HP6890/5975C GC/MS 聯(lián)用儀,FB-5MSI 彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣量1 μL；初始溫度46 ℃,保留2 min,3 ℃/min升至190 ℃,以15 ℃/min 升至310 ℃,運行時間58 min；汽化室溫度250 ℃；載氣高純He (99.999%),柱前壓7.65 psi (1 psi=0.133 kPa)；載氣體積流量1.0 mL/min；分流比20 ∶1；溶劑延遲時間4.0 min；離子源EI 源,溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1 565 V；接口溫度280 ℃；質(zhì)量范圍m/z29～500。通過質(zhì)譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索、Nist2014 和Wiley275 標(biāo)準質(zhì)譜圖比對,鑒定總離子流圖(圖1) 中各色譜峰對應(yīng)的化學(xué)成分,峰面積歸一化法測定球姜酮質(zhì)量分數(shù)為77.8%。

圖1 揮發(fā)油GC-MS 色譜圖

2.3 球姜酮純化 揮發(fā)油中加入0.3 mL 正己烷,40 ℃水浴加熱使其完全溶解,置于-22 ℃冰箱中冷藏15 min,析出晶體,減壓抽濾,得白色粗品,加入0.2 mL 正己烷,40 ℃水浴加熱溶解,置于-22 ℃冰箱中冷藏10 min,減壓抽濾,得到0.32 g 純品,純度大于99%。

2.4 球姜酮結(jié)構(gòu)鑒定 EI-MSm/z(%):218 ［M+］,203,189,175,163,150,135 (100),121,107,96,79,67,53,41。1H-NMR (CDCl3,400 MHz)δ:5.96～5.92 (1H,m,H-6),5.89 (1H,d,J=16.4 Hz,H-9),5.78 (1H,d,J=16.4 Hz,H-10),5.18 (1H,bd,J=15.1 Hz,H-2),2.43～2.30 (1H,m,H-5),2.30～2.12(4H,m,H-1,4,5),1.88～1.75 (1H,m,H-1),1.72(3H,s,H-13),1.46 (3H,s,H-12),1.13 (3H,s,H-14),0.99 (3H,s,H-15)；13C-NMR (CDCl3,100 MHz)δ:42.4 (C-1),125.0 (C-2),136.3 (C-3),39.5 (C-4),24.5 (C-5),148.9 (C-6),137.9 (C-7),204.3 (C-8),127.2 (C-9),160.7 (C-10),37.9 (C-11),15.3 (C-12),11.8 (C-13),29.5 (C-14),24.3 (C-15),以上數(shù)據(jù)與文獻［19］ 報道一致,故鑒定為球姜酮。

2.5 球姜酮純度檢測

2.5.1 TLC 法 取球姜酮適量,甲醇制成1 mg/mL 供試品溶液,吸取2、5、10、15、20 μL 點于GF254硅膠薄層板上,以氯仿-甲醇(2 ∶1)、丙酮-甲醇(6 ∶1)、乙酸乙酯-丙酮-甲醇(4 ∶2 ∶1) 為展開劑在254 nm 波長下觀察,碘蒸氣顯色。結(jié)果,在3 種展開劑、2 種顯色條件下均呈現(xiàn)單一球姜酮斑點,未見雜質(zhì)。

2.5.2 HPLC 法 分析條件為Agilent 1260 高效液相色譜儀,島津Wonda Cract ODS-2 色譜柱(4.6×250 mm,5 μm)；檢測波長280 nm；流動相乙腈-水(80 ∶20)；進樣量10 μL；柱溫25 ℃；體積流量1 mL/min。設(shè)定240、260、280、290、310 nm 5 個信號通道,用于考察球姜酮純度。

稱取10 mg 球姜酮,乙腈制成1 mg/mL 供試品溶液,取其和溶劑(乙腈) 各10 μL 進行測定,扣除溶劑干擾峰后采用歸一化法計算球姜酮含量,結(jié)果見表1,可知在各波長下均大于99%。

表1 球姜酮含量測定結(jié)果

2.6 穩(wěn)定性試驗 按照2015 年版《中國藥典》 四部通則“原料藥物與制劑穩(wěn)定性試驗指導(dǎo)原則”,分別對球姜酮進行室溫、高濕、強光照試驗,再按“2.2.2” 項下方法檢測其純度。

2.6.1 室溫 取適量球姜酮至西林瓶中,敞口放置10 d,由于該成分具有揮發(fā)性,故將溫度設(shè)定為室溫(25 ℃),于第0、5、10 天取樣檢測,結(jié)果見表2。由此可知,球姜酮在該條件下放置10 d 后外觀性狀無明顯變化,含量穩(wěn)定。

表2 室溫試驗結(jié)果（%）

2.6.2 高濕 取適量球姜酮至恒溫恒濕培養(yǎng)箱中,在溫度25 ℃、相對濕度90%下放置10 d,于第0、5、10 天取樣檢測,結(jié)果見表3。由此可知,球姜酮在該條件下放置10 d后外觀性狀無明顯變化,含量穩(wěn)定,吸濕增重小于5%。

2.6.3 強光照 取適量球姜酮至光照箱中,在4 500 lx 下放置10 d,于第0、5、10 天取樣檢測,結(jié)果見表4。由此可知,球姜酮在該條件下放置10 d 后外觀性狀無明顯變化,含量穩(wěn)定。

表3 高濕試驗結(jié)果（%）

表4 強光照試驗結(jié)果（%）

2.7 球姜酮含量測定

2.7.1 檢測波長選擇 本實驗考察了240、260、280、290、310 nm 波長,發(fā)現(xiàn)供試品溶液在280 nm 處有最大吸收,故選擇其作為檢測波長。

2.7.2 流動相選擇 取適量球姜酮供試品溶液,分別以乙腈-0.25%乙酸(70 ∶30)、甲醇-0.05%甲酸(80 ∶20)、乙腈-甲醇-水(60 ∶15 ∶25)、乙腈-水(80 ∶20)、甲醇-水(80 ∶20) 為流動相,在280 nm 波長處檢測,結(jié)果見表5。由此可知,乙腈-水(80 ∶20) 為洗脫時對稱性較好,故以其為流動相。

表5 流動相考察結(jié)果

2.7.3 柱溫選擇 取適量供試品溶液,在柱溫25、35、48 ℃下進行考察,結(jié)果見表6。由此可知,當(dāng)柱溫為25 ℃時基線穩(wěn)定,對稱性較好。

表6 柱溫考察結(jié)果

2.7.4 體積流量選擇 取適量供試品溶液,在體積流量0.8、1.0、1.2 mL/min 下進行考察,結(jié)果見表7。由此可知,當(dāng)體積流量為1.0 mL/min 時對稱性較好。

2.7.5 色譜柱選擇 取適量供試品溶液,在檢測波長280 nm、柱溫25 ℃、流動相乙腈-水(80 ∶20)、體積流量1 mL/min、進樣量10 μL 色譜條件 下,采 用Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Wonda Cract ODS-2 (4.6 mm × 250 mm,5 μm)、Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm) 色譜柱進行考察,結(jié)果見表8。由此可知,Wonda Cract ODS-2 (4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱對稱性較好。

表7 體積流量考察結(jié)果

表8 色譜柱選擇

3 結(jié)論

本實驗所得球姜酮對照品純度大于99%,符合國家標(biāo)準,而且制備路線簡單穩(wěn)定,可用于含該成分藥材及相關(guān)制劑的質(zhì)量控制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。