馮自立，朱志斌，趙正棟，陳 旺，李 穎

(1.陜西理工大學(xué)，陜西 漢中 723001；2.陜西萃程生物醫(yī)藥科技有限公司，陜西 漢中 723007）

銀杏內(nèi)酯為銀杏葉重要活性物質(zhì),主要包括銀杏內(nèi)酯A、B、C 和白果內(nèi)酯［1］,具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、神經(jīng)保護等諸多藥理活性［2-7］,其中銀杏內(nèi)酯B 是迄今為止在自然界中發(fā)現(xiàn)的活性最強的血小板活化因子拮抗劑［8］。由于銀杏內(nèi)酯活性與其純度具有相關(guān)性,故近年來有不少學(xué)者對該成分的純化工藝進行研究,目前主要方法有有機溶劑萃取-結(jié)晶法、有機溶劑萃取-柱層析法、模擬移動床色譜法等［9-15］,但都存在產(chǎn)品生產(chǎn)周期長、收率和純度低、不能實現(xiàn)多種內(nèi)酯化合物同時制備等缺陷。

高壓制備液相色譜是快速分離和制備高純度天然產(chǎn)物活性成分的重要方法之一,因其分離度好、制備效率高、載樣量大、制備化合物純度高,正成為中藥化學(xué)成分分離純化的重要手段［16-17］,在對照品制備、藥理活性研究、中藥現(xiàn)代化和質(zhì)量控制等方面發(fā)揮了重要作用。由于銀杏內(nèi)酯紫外吸收弱,采用常規(guī)的紫外檢測器靈敏度較低,導(dǎo)致其收率和純度不理想,故本實驗采用高壓制備液相色譜實現(xiàn)銀杏內(nèi)酯A、B、C、J 和白果內(nèi)酯同時制備的在線檢測,以期為相關(guān)系統(tǒng)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

烘干銀杏葉于2018 年10 月購自陜西金慧方中藥科技有限公司,經(jīng)陜西理工大學(xué)植物系教研室楊培君教授鑒定為銀杏科植物銀杏Ginkgo bilobaL.的干燥葉(總黃酮醇苷質(zhì)量分數(shù)0.72%總萜內(nèi)酯質(zhì)量分數(shù)0.46%)。銀杏內(nèi)酯A、B、C、J 和白果內(nèi)酯對照品(陜西樂博生化科技有限公司)。分析用甲醇、四氫呋喃為色譜純；制備用甲醇、乙腈、四氫呋喃、乙醇、乙酸乙酯、鹽酸、碳酸氫鈉、活性炭、酸性氧化鋁為分析純；水為超純水(實驗室自制)。

DYG-200 L 超聲波中藥提取罐(寧波新芝超聲設(shè)備有限公司)；Agilent 1260 高效液相色譜儀(美國Agilent 公司)；HB DAC-50 高效制備液相色譜系統(tǒng)(江蘇漢邦科技有限公司)；UNIEX 7700 蒸發(fā)光散射檢測器(上海通微分析技術(shù)有限公司)；AVANCE 400 核磁共振儀(德國Bruker公司)；AL204 電子天平 (瑞士梅特勒-托利多公司)；YRE-2050A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；SCIENTZ-10 N 真空冷凍干燥箱(上海圣科儀器設(shè)備有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 銀杏總內(nèi)酯提取 取干燥銀杏葉20 kg,粉碎過80 目篩,加復(fù)合酶液(纖維素酶∶果膠酶=1 ∶1) 80 L (復(fù)合酶用量67.0 g),鹽酸調(diào)pH 至5,在50 ℃下酶解4 h,加80 L 工業(yè)乙醇攪拌均勻,超聲(2 kW) 提取60 min,濾過,濾渣加160 L 50%乙醇超聲提取60 min,濾過,合并濾液,減壓濃縮至20 L,等體積石油醚(60～90 ℃) 萃取2次,水相用0.5 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)pH 至8.0,濾過,濾液用10%鹽酸溶液調(diào)pH 至7.0,加300 g 氯化鈉充分攪拌,等體積乙酸乙酯萃取3 次,合并乙酸乙酯相,無水硫酸鈉干燥,濾過,濾液減壓濃縮至干,得總銀杏內(nèi)酯粗品228.3 g,純度36.4% (RSD=1.6%,n=3),回收率90.3% (RSD=1.8%,n=3)。

2.2 銀杏內(nèi)酯結(jié)晶 向“2.1” 項下粗品加入500 mL甲醇加熱溶解,再加入200 mL 去離子水攪拌均勻,置于4 ℃冰箱中結(jié)晶12 h,濾過,母液合并減壓濃縮至原體積的1/3,繼續(xù)于4 ℃冰箱中結(jié)晶12 h,抽濾,合并晶體,丙酮重結(jié)晶,真空干燥,得總銀杏內(nèi)酯晶體95.0 g,純度95.8%(RSD=2.1%,n=3),回收率91.3% (RSD=2.3%,n=3)。

2.3 銀杏內(nèi)酯制備 將“2.2” 項下總銀杏內(nèi)酯用70%甲醇配制成50 g/L 溶液,0.45 μm 濾膜過濾,高效制備液相色譜進行制備。

2.3.1 柱填料選擇 分別以正向硅膠(200～300 目)、酸性氧化鋁 (200～300 目)、Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠(27～163 μm)、十八烷基鍵合硅膠(10 μm) 為填料,對銀杏內(nèi)酯進行制備。結(jié)果,正向硅膠、酸性氧化鋁對銀杏內(nèi)酯的分離度較差,上樣量少,有機溶劑用量多,重復(fù)性不理想,產(chǎn)品純度、收率均較低；LH-20 凝膠分離度差,上樣量少,分離速度慢；十八烷基鍵合硅膠分離度好,上樣量多,有機溶劑用量少,重復(fù)性好,制備時間短,產(chǎn)品純度、收率均較高,故選擇其作為柱填料。

2.3.2 制備溶劑系統(tǒng)選擇 根據(jù)HPLC 溶劑系統(tǒng)四面體優(yōu)化法,對水、甲醇、乙腈、四氫呋喃4 種溶劑體系進行色譜制備。結(jié)果,甲醇-水體系可將5 種銀杏內(nèi)酯分離開,但柱效低,上樣量少,制備時間長,溶劑用量多；乙腈-水體系較難分離銀杏內(nèi)酯A、B,無法同時制備5 種銀杏內(nèi)酯；甲醇-四氫呋喃-水體系對5 種銀杏內(nèi)酯的選擇性較好,制備時間短,分離度好,上樣量多,故選擇其作為制備溶劑系統(tǒng)。

2.3.3 銀杏內(nèi)酯放大制備 制備色譜條件為NP7010C 高壓制備泵(×2)；DAC-HB50 動態(tài)軸向壓縮柱(50 mm×250 mm),Megres C1810 μm 填料；20 mL 定量環(huán)；分流式串聯(lián) UNIEX-7700 蒸發(fā)光散射檢測器；Unimicro ChromStation 色譜工作站；流動相甲醇-四氫呋喃-水(30 ∶10 ∶60)；體積流量95 mL/min；分流比0.5 ∶94.5；漂移管溫度70 ℃；載氣體積流量2.5 L/min；進樣量12 mL/次。結(jié)果,5 種銀杏內(nèi)酯分離度良好,一次上樣600 mg 仍能實現(xiàn)基線分離,在25 min 內(nèi)能完成一次制備；產(chǎn)物經(jīng)減壓濃縮、真空冷凍干燥后,各銀杏內(nèi)酯收率均大于95%,色譜圖見圖1。

圖1 銀杏內(nèi)酯高壓制備液相色譜圖

2.4 銀杏內(nèi)酯檢測

2.4.1 對照品溶液制備 精密稱取銀杏內(nèi)酯A、B、C、J及白果內(nèi)酯對照品各5.0 mg,甲醇定容至5 mL,搖勻,過0.45 μm 微孔濾膜,取續(xù)濾液,即得。

2.4.2 供試品溶液制備 取制備的5 種銀杏內(nèi)酯各5.0 mg,甲醇定容至5 mL,搖勻,過0.45 μm 微孔濾膜,取續(xù)濾液,即得。

2.4.3 色譜條件 TC-C18色譜柱(4.6 mm × 250 mm,5 μm)；UNIEX-7700 蒸發(fā)光散射檢測器；流動相甲醇-四氫呋喃-水(30 ∶ 10 ∶ 60)；體積流量1.0 mL/min；柱 溫30 ℃；進樣量10 μL。

2.4.4 結(jié)果 制得化合物T13.22 g,純度98.26%；T224.23 g,純度98.74%；T317.80 g,純 度98.14%；T428.02 g,純度98.05%；T510.58 g,純度98.64%,色譜圖見圖2。

2.5 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物T1:白色粉末(甲醇),mp 349～350 ℃。1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:1.79 (1H,dd,J=15.2,7.8 Hz,H-1),2.72 (1H,dd,J=15.2,7.8 Hz,H-1),4.81 (1H,t,J=7.8 Hz,H-2),6.40 (1H,s,3-OH),4.65 (1H,d,J=4.0 Hz,H-6),4.16 (1H,m,H-7),5.50 (1H,d,J=6.6 Hz,7-OH),1.56 (1H,d,J=12.5 Hz,H-8),4.94 (1H,d,J=5.0 Hz,H-10),6.89 (1H,d,J=5.0 Hz,10-OH),6.05 (1H,s,H-12),2.87 (1H,q,J=7.2 Hz,H-14),1.09 (1H,d,J=7.2 Hz,H-16),1.04 (9H,s,t-Bu)；13CNMR (100 MHz,DMSO-d6)δ:36.6 (C-1),87.4 (C-2),85.9 (C-3),100.1 (C-4),63.2 (C-5),85.8 (C-6),72.4(C-7),49.3 (C-8),62.5 (C-9),68.6 (C-10),174.1 (C-11),109.5 (C-12),171.1 (C-13),40.5 (C-14),176.7(C-15),8.3 (C-16),32.4 (C-17),29.0 (C-18),29.0 (C-19),29.0 (C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻［18］ 報道一致,故鑒定為銀杏內(nèi)酯J。

化合物 T2:白色針狀結(jié)晶 (甲醇),mp 353～354 ℃。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ:3.91 (1H,dd,J=7.2,3.6 Hz,H-1),4.93 (1H,d,J=3.6 Hz,1-OH),4.63 (1H,d,J=7.2 Hz,H-2),6.46 (1H,s,3-OH),4.92(1H,d,J=4.0 Hz,H-6),4.03 (1H,m,H-7),5.61 (1H,d,J=6.2 Hz,7-OH),1.53 (1H,d,J=12.4 Hz,H-8),4.96 (1H,d,J=5.6 Hz,H-10),7.54 (1H,d,J=5.6 Hz,10-OH),6.08 (1H,s,H-12),2.80 (1H,q,J=7.0 Hz,H-14),1.12 (3H,d,J=7.0 Hz,H-16),1.09 (9H,s,t-Bu)；13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ:74.0 (C-1),92.0(C-2),83.1 (C-3),98.7 (C-4),66.6 (C-5),79.5 (C-6),74.2 (C-7),49.4 (C-8),64.2 (C-9),69.2 (C-10),174.3(C-11),109.7 (C-12),170.6 (C-13),41.8 (C-14),176.7(C-15),8.3 (C-16),32.4 (C-17),29.2 (C-18),29.2 (C-19),29.2 (C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻［19］ 報道一致,故鑒定為銀杏內(nèi)酯C。

化合物T3:白色針狀結(jié)晶 (甲醇),mp 316～317℃。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ:2.91 (1H,d,J=18.4 Hz,H-1),2.77 (1H,d,J=18.4 Hz,H-1),4.90(1H,t,J=7.2 Hz,H-6),2.53 (1H,dd,J=13.6,7.2 Hz,H-7),2.06 (1H,dd,J=13.6,7.2 Hz,H-7),5.40 (1H,s,8-OH),5.13 (1H,d,J=5.2 Hz,H-10),7.25 (1H,d,J=5.2 Hz,10-OH),6.26 (1H,s,H-12),1.04 (9H,s,t-Bu)；13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ:42.1 (C-1),173.2(C-2),174.3 (C-4),58.0 (C-5),68.2 (C-6),36.0 (C-7),86.0 (C-8),65.8 (C-9),83.1 (C-10),177.6 (C-11),99.3 (C-12),37.3 (C-17),26.8 (C-18),26.8 (C-19),26.8 (C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻［19］ 報道一致,故鑒定為白果內(nèi)酯。

化合物 T4:白色針狀結(jié)晶 (甲醇),mp 350～351 ℃。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ:2.72 (1H,dd,J=12.5,7.7 Hz,H-1),1.76 (1H,dd,J=15.2,7.7 Hz,H-1),4.80 (1H,t,J=7.7 Hz,H-2),6.32 (1H,s,3-OH),4.92 (1H,s,H-6),2.01 (1H,dd,J=10.5,2.9 Hz,H-7),2.01 (1H,dd,J=10.5,2.9 Hz,H-7),1.68 (1H,t,J=10.5 Hz,H-8),4.92 (1H,d,J=5.2 Hz,H-10),6.78(1H,d,J=5.2 Hz,10-OH),6.00 (1H,s,H-12),2.93(1H,q,J=7.2 Hz,H-14),1.12 (1H,d,J=7.2 Hz,H-16),1.02 (9H,s,t-Bu)；13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ:36.8 (C-1),88.2 (C-2),86.3 (C-3),110.5 (C-4),68.3 (C-5),85.6 (C-6),36.3 (C-7),49.1 (C-8),67.0(C-9),69.0 (C-10),174.7 (C-11),100.1 (C-12),171.2(C-13),40.7 (C-14),176.8 (C-15),8.6 (C-16),32.4(C-17),29.3 (C-18),29.3 (C-19),29.3 (C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻［19］ 報道一致,故鑒定為銀杏內(nèi)酯A。

化合物 T5:白色針狀結(jié)晶 (甲醇),mp 350～351 ℃。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ:4.05 (1H,dd,J=7.4,3.4 Hz,H-1),4.93 (1H,d,J=3.4 Hz,1-OH),4.62 (1H,d,J=7.4 Hz,H-2),6.45 (1H,s,3-OH),5.31(1H,d,J=3.6 Hz,H-6),1.93 (1H,td,J=14.0,4.0 Hz,H-7),2.13 (1H,dd,J=13.6,4.6 Hz,H-7),1.71 (1H,dd,J=14.0,4.6 Hz,H-8),5.02 (1H,d,J=5.4 Hz,H-10),7.46 (1H,d,J=5.4 Hz,10-OH),6.06 (1H,s,H-12),2.84 (1H,q,J=7.0 Hz,H-14),1.11 (3H,d,J=7.0 Hz,H-16),1.03 (9H,s,t-Bu)；13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ:74.1 (C-1),92.3 (C-2),83.2 (C-3),98.8(C-4),72.2 (C-5),79.0 (C-6),37.1 (C-7),49.0 (C-8),67.7 (C-9),69.3 (C-10),174.3 (C-11),109.9 (C-12),170.6 (C-13),42.1 (C-14),176.8 (C-15),8.3 (C-16),32.2 (C-17),29.3 (C-18),29.3 (C-19),29.3 (C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻［19］ 報道一致,故鑒定為銀杏內(nèi)酯B。

3 討論

由于銀杏內(nèi)酯具有較強且廣泛的藥理活性,故對該類化合物進行系統(tǒng)的純化制備具有重要理論意義和實際價值。為了快速制備高純度的銀杏內(nèi)酯單體化合物,本實驗以銀杏葉為原料,經(jīng)酶解預(yù)處理、提取、溶劑萃取、結(jié)晶、高壓制備液相色譜同時獲得高純度的銀杏內(nèi)酯A、B、C、J 和白果內(nèi)酯。

銀杏內(nèi)酯是銀杏葉主要藥用成分,對心血管、神經(jīng)系統(tǒng)均具有較強的藥理活性,一直以來受到眾多研究者的青睞,但其含量較低,結(jié)構(gòu)相似,導(dǎo)致分離純化較為困難。本實驗對高壓制備液相色譜分離銀杏內(nèi)酯過程中的填料種類和溶劑體系進行篩選,最終選擇十八烷基鍵合硅膠作為制備用填料,甲醇-四氫呋喃-水作為流動相,并采用分流式串聯(lián)蒸發(fā)光散射檢測器,從而實現(xiàn)該成分的在線檢測和制備。與傳統(tǒng)的溶劑萃取、結(jié)晶、硅膠柱層析等方法比較,高壓制備液相色譜可大幅提高銀杏內(nèi)酯單體制備的效率和收率,所得產(chǎn)品純度高,有機溶劑用量少,生產(chǎn)成本降低,對工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。