田淋淋，徐 云，林建梅，高 嵩，崔憲利，徐 建*

(1.吉林修正藥業(yè)新藥開發(fā)有限公司，吉林省中藥標(biāo)準(zhǔn)化關(guān)鍵工程技術(shù)重點實驗室，吉林 長春 130103；2.吉林長白山藥業(yè)集團股份有限公司，吉林 白山 134300）

肝膽雙清口服液由熊膽粉、牡丹皮、半枝蓮等8 味中藥組成,具有清熱利膽、調(diào)理氣血的功效,臨床用于肝膽濕熱、氣血不調(diào)所致脅肋隱痛、口干、口苦、食少乏力等癥狀的輔助治療,效果顯著。但原工藝處方中牡丹皮、當(dāng)歸采用水蒸氣蒸餾法收集的蒸餾液后,直接加入其余藥味提取的濃縮液中,存在有效成分穩(wěn)定性及水溶性差、口感不好等缺點。

為了克服上述缺點,本實驗選用羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD) 作為包合材料［1-3］,將肝膽雙清口服液中丹皮酚、當(dāng)歸揮發(fā)油制成包合物,在提高穩(wěn)定性的同時增加溶解度。再采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化包合物制備工藝,以期為工業(yè)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 儀器 U3000 型高效液相色譜儀(美國戴安公司)；MS205DU 型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；揮發(fā)油提取器(北京玻璃儀器廠)；ETS-D5 型恒溫磁力攪拌器(艾卡儀器設(shè)備有限公司)；新之冷凍凍干機。

1.2 試劑與藥物 牡丹皮(批號2017-08-09-6)、當(dāng)歸(批號2017-09-01-8) 均由吉林長白山藥業(yè)集團股份有限公司提供,經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)張輝教授鑒定為正品,符合2015 年版《中國藥典》 標(biāo)準(zhǔn)。HP-β-CD (批號181201) 購自遼寧祿泉醫(yī)藥科技有限公司。乙醇、石油醚、鹽酸均為分析純；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹皮酚提取 取牡丹皮飲片100 g,加入10 倍量水浸泡0.5 h,水蒸氣蒸餾法收集6 倍量餾出液,加入1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 至2～3,在4 ℃下放置24 h,濾過,結(jié)晶用水洗滌,35～38 ℃下低溫干燥,研成細(xì)粉,即得。

2.2 當(dāng)歸揮發(fā)油提取 取當(dāng)歸飲片200 g,加入7 倍量水浸泡0.5 h,按2015 年版《中國藥典》 四部通則2204 項下?lián)]發(fā)油測定法［4］收集揮發(fā)油。

2.3 包合物制備 以乙醇為溶劑,采用飽和溶液法進(jìn)行包合。稱取一定量HP-β-CD,加入適量乙醇使其成飽和溶液,置于磁力攪拌器中(轉(zhuǎn)速2 600 r/min),設(shè)置適當(dāng)溫度使其溶解。另稱取丹皮酚結(jié)晶細(xì)粉、當(dāng)歸揮發(fā)油各1 g,適量乙醇溶解,緩慢加到HP-β-CD 乙醇溶液中攪拌,減壓回收乙醇后常溫干燥,石油醚等量洗滌3 次,揮干溶劑,即得。

2.4 包合率、包合物收率測定

2.4.1 丹皮酚含量測定 按照中國藥典2015 年版《中國藥典》 四部通則0512［5-8］,采用HPLC 法測定。

2.4.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相甲醇-水(45 ∶55)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長274 nm。理論塔板數(shù)按丹皮酚計,應(yīng)不低于3 000。

2.4.1.2 對照品溶液制備 精密稱取丹皮酚對照品適量,流動相制成每1 mL 含0.3 mg 該成分的溶液,即得。

2.4.1.3 供試品溶液制備 取包合物約1 g,精密稱定,置于100 mL 量瓶中,精密加入乙醇適量,密塞,超聲(250 W、50 kHz) 處理30 min,放冷,乙醇定容至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.4.1.4 線性關(guān)系考察 精密量取丹皮酚對照品溶液(1.503 0 mg/mL) 0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL,置于5 mL 量瓶中,甲醇稀釋至刻度,搖 勻,濾 過,在“2.4.1.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),丹皮酚質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X) 進(jìn)行回歸,得方程為Y=415.46X+1.479 2(R2=0.999 9),在0.150 4～1.202 4 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.1.5 精密度試驗 精密吸取“2.4.1.2” 項下對照品溶液,在“2.4.1.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定6 次,測得丹皮酚峰面積RSD 為0.96%,表明儀器精密度良好。

2.4.1.6 穩(wěn)定性試驗 取“2.4.1.3” 項下供試品溶液,于0、2、4、8、12、18、24 h 在“2.4.1.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定,測得丹皮酚峰面積RSD 為0.34%,表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.1.7 重復(fù)性試驗 取同一份包合物,共6 份,按“2.4.1.3” 項下方法制備供試品溶液,在“2.4.1.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定,測得丹皮酚含量RSD 為0.57%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.1.8 加樣回收率試驗 取丹皮酚含量已知的包合物6份,每份0.5 g,加入丹皮酚對照品溶液(1.503 0 mg/mL)13 mL,按 “2.4.1.3” 項下方法制備供試品溶液,在“2.4.1.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定,計算回收率。結(jié)果,丹皮酚平均加樣回收率為99.78%,RSD 為0.76%。

2.4.2 丹皮酚包合率測定 稱取丹皮酚結(jié)晶、包合物,測定該成分含量,計算包合率,公式為包合率=(包合物中丹皮酚含量/丹皮酚總投藥量) ×100%。

2.4.3 當(dāng)歸揮發(fā)油包合率測定 取包合物適量,按2015年版《中國藥典》 四部通則2204 項下?lián)]發(fā)油測定法提取揮發(fā)油,讀取體積,計算包合率,公式為包合率=(包合物中揮發(fā)油含量/揮發(fā)油加入量)×100%。

2.4.4 包合物收率測定 公式為收率=［包合物質(zhì)量/(環(huán)糊精加入量+丹皮酚加入量+揮發(fā)油加入量)］ ×100%。

2.4.5 綜合評分計算 以丹皮酚、當(dāng)歸揮發(fā)油包合率及包合物收率的綜合評分為評價指標(biāo)［9-12］。其中,包合率為衡量包合效果的主要指標(biāo),其數(shù)值越高,揮發(fā)油包合效果越好,故將其作為主要指標(biāo),權(quán)重系數(shù)設(shè)定為0.8；包合物收率在實際生產(chǎn)過程中也有重要意義,在投入量一定的情況下其數(shù)值越高,包合率越高,故將其作為次要目標(biāo),權(quán)重系數(shù)設(shè)定為0.2。牡丹皮中丹皮酚包合率權(quán)重系數(shù)設(shè)定為0.7,當(dāng)歸揮發(fā)油包合率權(quán)重系數(shù)設(shè)定為0.3。將丹皮酚包合率、當(dāng)歸揮發(fā)油包合率分別用A1、A2表示,包合物收率用B表示,計算綜合評分,公式為綜合評分=A1×0.56(0.8×0.7) +A2×0.24 (0.8×0.3) +B×0.2。

2.5 包合工藝優(yōu)化

2.5.1 單因素試驗

2.5.1.1 投料比 稱取HP-β-CD 8 g (4 ∶1)、12 g (6 ∶1)、16 g (8 ∶1)、20 g (10 ∶1)、24 g (12 ∶1),加入適量乙醇使其成飽和溶液,置于磁力攪拌器中 (轉(zhuǎn)速2 600 r/min),水浴溫度45 ℃。分別稱取丹皮酚結(jié)晶細(xì)粉、當(dāng)歸揮發(fā)油1 g,各5 份,適量乙醇溶解,緩慢加入HP-β-CD 乙醇溶液攪拌2 h,減壓回收乙醇后常溫干燥,石油醚等量洗滌3 次,揮干溶劑,測定丹皮酚、當(dāng)歸揮發(fā)油包合率及包合物收率,計算綜合評分,結(jié)果見圖1。由此可知,隨著投料比增加,綜合評分逐漸升高,達(dá)到8 ∶1 后程度趨緩,故選擇8 ∶1 作為最優(yōu)投料比。

圖1 投料比對綜合評分的影響

2.5.1.2 包合溫度 稱取HP-β-CD5 份,每份20 g,加入適量乙醇使其成飽和溶液,置于磁力攪拌器中 (轉(zhuǎn)速2 600 r/min),水浴溫度35、40、45、50、55 ℃。分別稱取丹皮酚結(jié)晶細(xì)粉、當(dāng)歸揮發(fā)油1 g,各5 份,適量乙醇溶解,緩慢加入HP-β-CD 乙醇溶液攪拌2 h,減壓回收乙醇后常溫干燥,石油醚等量洗滌3 次,揮干溶劑,測定丹皮酚、當(dāng)歸揮發(fā)油包合率及包合物收率,計算綜合評分,結(jié)果見圖2。由此可知,包合溫度為40 ℃時綜合評分最高,故選擇40 ℃作為最優(yōu)包合溫度。

圖2 包合溫度對綜合評分的影響

2.5.1.3 包合時間 稱取HP-β-CD5 份,每份20 g,加入適量乙醇使其成飽和溶液,置于磁力攪拌器中 (轉(zhuǎn)速2 600 r/min),水浴溫度45 ℃。分別稱取丹皮酚結(jié)晶細(xì)粉、當(dāng)歸揮發(fā)油1 g,各5 份,適量乙醇溶解,緩慢加入HP-β-CD 乙醇溶液攪拌0.5、1、2、3、4 h,減壓回收乙醇后常溫干燥,石油醚等量洗滌3 次,揮干溶劑,測定丹皮酚、當(dāng)歸揮發(fā)油包合率及包合物收率,計算綜合評分,結(jié)果見圖3。由此可知,隨著包合時間延長,綜合評分逐漸升高,在2 h 后基本穩(wěn)定,故選擇2 h 作為最優(yōu)包合時間。

2.5.2 Box-Behnken 試驗 在單因素試驗基礎(chǔ)上,以投料比(HP-β-CD 與丹皮酚、當(dāng)歸揮發(fā)油) (A)、包合溫度(B)、包合時間(C) 為影響因素,綜合評分(Y) 為評價指標(biāo),設(shè)計三因素三水平試驗［13-16］。因素水平見表1,結(jié)果見表2。

圖3 包合時間對綜合評分的影響

表1 因素水平

表2 試驗設(shè)計及結(jié)果

采用Design-Expert8.0.6 軟件進(jìn)行二次多元回歸擬合,得方程為Y=81.08+3.11A+0.80B+0.80C-0.47AB+0.37AC-0.27BC-2.45A2-3.45B2-1.50C2,方差分析見表3。由此可知,模型P＜0.01,表明有極顯著意義；失擬項P=0.801 5＞0.05,表明失擬項不顯著；因素A(投料比)的一次項、二次項均有極顯著意義(P＜0.01)；各因素影響程度為依次為A(投料比) ＞C(包合時間) ＞B(包合溫度)。

表3 方差分析

響應(yīng)面分析見圖4。由此可知,在包合溫度、包合時間不變時,綜合評分隨著投料比增加而升高,達(dá)到8 ∶1 后程度趨緩；在投料比、包合溫度不變時,隨著包合時間延長綜合評分升高,但程度不明顯；當(dāng)投料比、包合時間不變時,隨著包合溫度增加綜合評分先升后降,在40 ℃時達(dá)到最大。最終確定,最優(yōu)工藝為投料比8 ∶1,包合溫度40 ℃,包合時間1 h,綜合評分為81.08 分。

圖4 各因素響應(yīng)面圖

2.6 驗證試驗 按優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批驗證試驗,結(jié)果見表4,可知綜合評分與預(yù)測值81.08 分基本一致,表明該工藝穩(wěn)定可行。

表4 驗證試驗結(jié)果（n=3）

3 討論

當(dāng)歸揮發(fā)油、丹皮酚均具有揮發(fā)性,難溶于水,而且易損失,為了增加肝膽雙清口服液穩(wěn)定性,提高其生物利用度,本實驗采用包合技術(shù)將上述2 種成分一起包合。羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD) 是應(yīng)用最廣泛β-環(huán)糊精衍生物,在保持環(huán)糊精空腔的同時克服了β-環(huán)糊精水溶性差的主要缺點,是目前研究較全面、安全性較高、水溶性較好的包合材料,是用于口服液包合的最佳選擇,故本實驗選擇其對當(dāng)歸揮發(fā)油、丹皮酚進(jìn)行包合。

然后,本實驗采用Design-Expert8.0.6 軟件,通過Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化肝膽雙清口服液中丹皮酚、當(dāng)歸揮發(fā)油包合物制備工藝,發(fā)現(xiàn)投料比對綜合評分的影響最顯著,而且包合溫度、包合時間均受其影響。最終確定,最優(yōu)制備工藝為投料比8 ∶1,包合溫度40 ℃,包合時間1 h,綜合評分為81.78 分,與預(yù)測值81.08 分基本一致,表明結(jié)果真實可靠,工藝穩(wěn)定可行。